Časná kancerogeneze u spinocelulárního karcinomu hlavy a krku

Nakolik je tento trend vyhrazen ekonomicky silným zdravotním systémům je předmětem diskusí na odborných fórech i otázkou pohledu (chirurg, onkolog, ekonom aj.). Zřejmé je ale, že i tato schémata mají svá omezení a nežádoucí efekty, a to zejména vysokou toxicitu a neselektivitu. I proto je velká naděje upřena k molekulárně biologickým terapeutickým postupům, které představují cílený specifický zásah do procesu kancerogeneze a nejsou pro organismus tolik toxické.

Cílem této biologické či molekulárně biologické léčby je zasažení nádorové buňky na úrovni regulačních a signálních proteinů. Již dnes je v klinické praxi několik látek, které můžeme hrubě rozdělit jak podle mechanismu účinku, tak podle charakteru vlastní účinné látky. Jednotlivé molekuly mohou mít různé mechanismy účinku, a jedna látka může být současně řazena do několika podskupin.

Jednou z nich jsou tzv. monoklonální protilátky. Ty představují zatím v praxi nejvíce využívanou skupinu a současně velkou množinu molekul, které mohou zasahovat na nejrůznějších úrovních řízení procesu kancerogeneze v postižené buňce. Monoklonální protilátka je taková, která je tvořena pouze jedním klonem B-lymfocytů a která je zaměřena na jeden konkrétní antigen (při obranné reakci organismu vznikají v těle protilátky polyklonální, které jsou vytvořeny mnoha klony B-lymfocytů a směřovány proti různým antigenům). Monoklonální protilátky mohou být kompetitivními inhibitory receptorů pro růstové faktory (např. EGFR, receptor pro epidermální růstový faktor), mohou být zaměřeny proti tzv. CD antigenům (cluster of differentiation, tzv. diferenciační antigeny, označují se tak membránové antigeny, které mají na povrchu stejnou antigenní determinantu – tzv. epitop), z nichž některé jsou zvýšeně exprimovány na povrchu nádorových buněk (např. CD20 u non-hodgkinského lymfomu, CD52 u chronické lymfatické leukémie, aj.).

Monoklonální protilátka může být využita jako léčivo, které blokuje například receptor pro růstový faktor, signální dráhu pro apoptózu či angiogenezi a/nebo může být využita jako směrující struktura pro jiný typ terapeutika. Je možné konjugovat monoklonální protilátku s toxiny, s radioaktivním izotopem, či přes polymerní nosič s konvenčním cytostatikem. (19, 20). V ORL oblasti je do klinické praxe již zaveden cetuximab (Erbitux), který v kombinaci s radioterapií u lokálně pokročilého karcinomu hlavy a krku zlepšuje přežití o 20 měsíců (prodloužení přežití z 29 měsíců na 49 měsíců, tj. o 68 %) ve srovnání se samotnou radioterapií bez navýšení toxicity, a přibližně o třetinu také snižuje riziko lokoregionálního relapsu (21). Je schválen pro léčbu lokálního a lokálně pokročilého karcinomu hlavy a krku v kombinaci s radioterapií u pacientů s neresekovatelným nádorem a jako monoterapii u pacientů s metastatickým karcinomem po selhání standardní platinové chemoterapie.

Další potencionální monoklonální protilátkou je bevacizumab (Avastin), který selektivně blokuje VEGF (vaskulární endoteliální růstový faktor), vyřazuje jej z vazby na receptor a tak brání angioneogenezi. Klinické použití Avastinu je možné u kolorektálního karcinomu, pro klinické použití v ORL oblasti není registrován (22).

Mezi další skupinu látek využitelných pro cílenou léčbu patří inhibitory tyrosinkináz. Tyrosinkinázy představují širokou skupinu membránových i buněčných enzymů, katalyzujících fosforylaci tyrosinových zbytků. Tak dochází k aktivaci proteinů jednotlivých signálních drah, které se podílejí na přenosu signálu do nitra buňky. Ty jsou za normálních okolností odpovědné za regulaci buněčné proliferace, diferenciace a apoptózy. V procesu kancerogeneze mohou jejich inhibitory ovlivňovat tyto signální dráhy a tak blokovat patologickou proliferaci, angioneogenezi či poruchu dějů nutných k apoptóze buňky.

Existují tři hlavní mechanismy inhibice tyrozinkináz:

1. blokádou vazebného místa pro ATP (kompetitivní vazba na vazebné místo pro ATP na intracelulární doméně receptoru a zabránění jeho fosforylaci a přenosu signálu do buňky);
2. vazbou na extracelulární doménu receptoru prostřednictvím monoklonálních protilátek (viz výše);
3. inhibicí stimulačních ligandů těchto drah.

Z inhibitorů tyrosinkináz se jako nejlepší z těchto cílů u HNSCC jeví inhibitor tyrosinkinázové aktivity signalizační dráhy receptoru pro epidermální růstový faktor (EGFR) gefitinib (Iressa). Pro snadnější orientaci lze říci, že monoklonální protilátky využívané v léčbě nádorových onemocnění mají koncovku –ab (např. cetuximab/Erbitux), zatímco názvy inhibitorů enzymatických reakcí mají koncovku –ib (např. gefitinib/Iressa).

Potenciální způsoby cílené léčby nádorů představují inhibitory matrixmetaloproteinázy, které mohou zablokovat destrukci bazální membrány, a tím zabránit invazívnímu růstu tumoru. Mechanismem jejich účinku je vytvoření komplexu se zinkem, který se podílí na aktivaci matrixmetaloproteináz.

Další skupinu tvoří cykliny, které s cyklin-dependentními kinázami vytvářejí aktivní komplexy a hrají důležitou roli v regulaci buněčného cyklu. Inhibitory cyklin-dependentních kináz mohou zastavit buněčný cyklus a indukovat apoptózu. Ve fázi klinických zkoušek se slibnými výsledky je také inhibitor proteinkinázy-C (enzastaurin), který současně blokuje angiogenezi, buněčnou proliferaci a indukuje apoptózu (19).

Pozornost se zaměřuje i na jiné možnosti ovlivnění kancerogeneze. Velká pozornost se věnuje imunitním mechanismům, protože i když se nějaký preparát jeví jako přínosný, nelze dopředu říci, jak konkrétní pacient na léčbu zareaguje. To je dáno nejenom genetickou výbavou daného jedince, charakteristikami určitého typu nádoru a vlastnostmi léků, důležitou roli hraje nastavení imunitního systému daného jedince v danou chvíli. Proto je taková pozornost věnována procesu vzniku a růstu dlaždicobuněčného karcinomu v oblasti hlavy a krku a jeho ovlivnění imunitním systémem. Je zřejmé, že zastoupení jednotlivých subpopulací buněk imunitního systému přímo souvisí s rozvojem a prognózou onemocnění. Bylo prokázáno, že subpopulace T lymfocytů, tzv. regulační T lymfocyty (CD4+CD25+), přímo korelují s časnou recidivou HNSCC. Analýza zastoupení lymfocytárních subpopulací by mohla být jedním z údajů ovlivňujících naše rozhodování při volbě terapie či plánování dispenzarizace pacienta (20).

V dnešní medicíně je často skloňována individualizace léčby. Je ale zřejmé, že v současnosti nelze vyrábět jeden lék pro jednoho pacienta, ani nelze každého pacienta léčit veškerými dostupnými přípravky, neboť se jedná o velice nákladnou léčbu. Určitá pravidla v rozhodování komu lék podat a komu ne přináší výzkum potenciálních markerů. Obecně vzato, nejstarším markerem mohla být ve starověké medicíně glukóza, respektive její obsah v moči u jedince trpícího diabetem. V dnešní době to jsou nejčastěji proteiny/enzymy (nejsnadněji prokazatelné biochemicky), ale i jejich prekurzory prokazatelné metodami molekulární genetiky (DNA, RNA a další), nebo složitĕjší molekuly, např. proteoglykany (23-25). Markery v užším slova smyslu mohou být exprimovány pouze určitou částí nádorových buněk, u jednotlivých pacientů různě významně zastoupených. Ale ani tehdy není úplně jisté, že když některý pacient, respektive jeho nádorové buňky ve zvýšené míře exprimují onen marker, bude léčba úspěšná.

HNSCC a genová exprese, využití biočipu a real-time PCR

Při studiu exprese genů je zásadní porovnání exprese genů ve zdravé a v patologické tkáni. Zajímavé je ale také sledovat genovou expresi ve tkáni přilehlé k nádoru, která je, jak bylo uvedeno výše, histologicky normální, ale molekulárně již prokazatelně patologická. Pro zjednodušení lze říci, že při studiu exprese genů je třeba nejprve izolovat RNA, poté ji převést reverzní transkripcí na stabilnější cDNA (komplementární DNA je tedy jakýmsi otiskem exprimovaného genu) a tuto detekovat kvalitativně (např. biočip) či semikvantitavně (např. real-time PCR). Porovnáním výsledků mezi tkání zdravou a patologickou se určí, nakolik je daný gen v jednotlivé tkáni exprimován.

Biočip si můžeme představit jako mikrodestičku (umělohmotná destička, sklíčko aj.), kde na ploše řádově několika mm² je možné identifikovat hybridizačním procesem mezi na destičce navázanými sondami a zkoumanou a zároveň např. fluorescenčně značenou komplementární DNA až několik desítek tisíc genů. Jsou k dispozici komerčně vyráběné „screeningové“ biočipy pro celý genom (tzv. profil genové exprese v genomickém měřítku) i pro některé podoblasti výzkumného zájmu, například „onkologické“ biočipy, biočipy pro studium polymorfismu vybraných genů (cytochrom P450 aj.) pro účely farmakogenetiky a jiné.

Dalším způsobem je tzv. real-time PCR (někdy zkracováno RT-PCR, ale pozor, tak se označuje i reverzní transkripce, tedy zpětný přepis RNA na komplementární DNA, která je nicméně také nutná k provedení samotné real-time PCR), tedy polymerázová řetězová reakce v reálném čase. Tato metoda umožňuje semikvantitavní analýzu exprese genů na základě sledování zvyšující se fluorescence označené zkoumané cDNA při polymerázové řetězové reakci srovnáním se standardně exprimovaným genem (tzv. housekeeping gen, který je ve zdravé i patologické buňce exprimován ve stejné míře) a standardním genetickým materiálem (např. buněčná linie). Existují i složitější a náročnější analýzy výsledku genové exprese na podkladě tzv. proteomiky, která se zabývá identifikací jednotlivých proteinů kódovaných genomem, jejich vzájemnými interakcemi a stanovením jejich trojrozměrné struktury.

Na podkladě analýzy pomocí biočipu a real-time PCR získaných výsledků je možné určit tzv. target geny, tedy ty, které jsou ve zvýšené míře exprimovány v nádorové či přednádorové tkáni. Za předpokladu, že v histologicky normální tkáni přilehlé k nádoru jsou přítomny molekulárně genetické změny, vede další akumulace genetických změn k transformaci zdravé buňky v maligní, nádorovou tkáň. Akceptujeme-li teorii klonální expanze, tedy že je molekulárně alterována i histologicky zdravá tkáň v těsném okolí nádoru, pak srovnání míry exprese genu mezi molekulárně postiženou tkání (v těsném okolí nádoru) a molekulárně zdravou tkání (odebranou v dostatečné vzdálenosti od nádoru) může určit potenciální target geny, které jsou zapojeny do časných fází kancerogeneze.

Rozpoznání těchto genů časné kancerogeneze by napomohlo například časnějšímu záchytu druhého primárního tumoru, který se v ORL oblasti vyskytuje relativně často. V budoucnu přispějí tyto poznatky k optimálnímu cílení biologické léčby v časných stadiích kancerogeneze u dosud obtížně terapeuticky ovlivnitelných nádorových stavů ale i při časné detekci rekurencí. Kombinace biochipové technologie s real-time PCR se jeví jako vhodná kombinace studia procesu kancerogeneze, zejména pak jeho časných fází, a to u spinocelulárního karcinomu hlavy a krku, který představuje ideální model solidního nádoru pro studium časné kancerogeneze.

Závěr

Při studiu mechanismů vzniku a progrese nádorového bujení je nezbytná dobrá spolupráce mezi klinickým a výzkumným pracovištěm. V některých západních zemích je běžné, že student medicíny zakončí své pregraduální vzdělání dizertací podloženou publikací v renomovaném časopise. Takto nastavená spolupráce na jedné straně pomáhá pozdějším klinickým pracovníkům k detailnějšímu seznámení s vědou a výzkumem a na straně druhé nutí ke kombinaci jiných způsobů řešení problémů, různých metodických přístupů a v neposlední řadě i k nastolení úzké spolupráce v rámci řešitelského kolektivu. Tak například v sousedním Německu může sice lékař bez dizertace vykonávat lékařské povolání, ale nepřísluší mu respektovaný titul Dr. med. (obdoba titulu MUDr., který v Česku získáváme automaticky s poslední státní zkouškou, německý lékař bez dizertace používá označení Arzt/lékař, bez titulu).

Tento fungující systém (sám bych ale, býti ještě studentem, našel mnoho důvodů proti …) sice v České republice ještě nemáme, ale v posledních letech vzrůstá trend, kdy dochází k většímu zapojení klinických pracovišť do vědeckého výzkumu. Tato spolupráce je do určité míry vynucena systémem hodnocení klinik v rámci fakult, ale je to dáno též nárůstem počtu postgraduálních studentů, kteří přispívají ke zvýšení povědomí o vědeckém výzkumu na svých mateřských pracovištích. Věda a klinická práce by samozřejmě neměly koexistovat nezávisle na sobě, ale spíše se vzájemně obohacovat a přispívat k aplikaci nových vědeckých do klinické praxe, což se naštěstí v posledních letech v některých univerzitních centrech i v České republice daří.

Věříme, že tyto poznatky umožní v blízké budoucnosti časně diagnostikovat i účinně terapeuticky zasáhnout spinocelulární karcinom hlavy a krku u pacientů, kteří jsou z dosud neznámých příčin neodpovídají na dnes standardně zavedená terapeutická schémata. Možná se tak, jako chirurgové, nevědomky do budoucna připravujeme o velkou část našich výkonů (obr. 3), ale poznat mechanismy časné kancerogeneze a moci účinně zasáhnout biologickou léčbou za to jistě stojí.

Článek byl podpořen grantem GAUK 203435 - 36/06, IGA MZ ČR č. 8883–3 a Národním programem výzkumu II 2B06106.

MUDr.Jan Kastner

Klinika otorhinolaryngologie a chirurgie hlavy a krku 1. LF UK, FN v Motole

V Úvalu 84, 150 06 Praha 5 – Motol

E-mail: jkastner@email.cz ,

jkastner@uni-mainz.de