Ischemicko-reperfuzní poškození ledvin transplantovaných z nebijícího dárce (NHBD) – mají antioxidanty nebo protizánětlivé léky význam v jeho prevenci?

Česká verzia English info

Ischemia-reperfusion Injury in Kidney Transplantation from Non-heart Beating Donor – Do Antioxidants or Antiinflammatory Drugs Play Any Role?

Background:
Ischemia reperfusion injury (IRI) represents a serious problem of transplanted kidneys from a non-heart-beating donor (NHBD). It is probably the main cause of primary afunction or delayed graft function. The aim of the experimental study was to demonstrate on an experimental model the possibilities of reduction of IRI by intravenous application of antioxidants or immunosuppressives to the recipient before the kidney transplantation.

Method:
Piglets weighing between 20–25kg were used (N = 45) for the experiment. Intravenous application of multivitamins (GI) and a combination of immunosuppressives (GII) was tested one hour before the kidney transplantation from the NHBD. As a control a group (GIII) with simple NHBD modelling was used. At intervals of 0, 20, 60 and 120 minutes after the kidney transplantation, plasma levels of malondiadehyde (MDA) and reduced glutathione (GSH) were assessed. Before and 120 minutes after transplantation tissue concentrations of both factors were assessed in the transplanted kidney.

Results:
A permanent increase in MDA plasma concentrations occurred in GIII. In GI and GII, after a temporary increase of MDA plasma levels in the first 20 minutes after reperfusion, there was their permanent decrease then. (p < 0.05, resp. p < 0.01). The differences in the MDA plasma levels of GI and GII groups did not reach statistical significance. The both groups differed from GIII (p < 0.001). GSH plasma levels and also tissue concentrations of MDA and GSH were not statistically significant in any group in the course of the experiment.

Conclusion:
Intravenous application of multivitamins or immunosuppressives before kidney transplantation could have a significant influence on the immediate function of transplanted kidneys from a NHBD.

Key words:
ischemia reperfusion injury – non heart beating donor – multivitamins – immunosuppressives

Autoři: V. Třeška ¹; J. Kobr ²; D. Hasman ¹; J. Racek ³; L. Trefil ³; T. Reischig ⁴; O. Hes ⁵; V. Kuntscher ¹; J. Moláček ¹; I. Třešková ¹
Působiště autorů: Chirurgická klinika FN a LF UK v Plzni, přednosta: prof. MUDr. Vladislav Třeška, DrSc. ¹; Dětská klinika FN a LF UK v Plzni, přednosta: doc. MUDr. Jiří Kobr, Ph. D. ²; Ústav klinické biochemie FN a LF UK v Plzni, přednosta: prof. MUDr. Jaroslav Racek, CSc. ³; I. interní klinika FN a LF UK v Plzni, přednosta: doc. MUDr. Martin Matějovič, Ph. D. ⁴; Šiklův patologicko-anatomický ústav FN a LF UK v Plzni, přednosta: prof. MUDr. Michal Michal, Ph. D. ⁵
Vyšlo v časopise: Rozhl. Chir., 2009, roč. 88, č. 2, s. 65-68.
Kategorie: Monotematický speciál - Původní práce

Souhrn

Úvod:
Ischemicko-reperfuzní syndrom (IRS) je vážným problémem transplantovaných ledvin z nebijícího dárce (NHBD). IRS je pravděpodobně jednou z hlavních příčin primární afunkce, nebo opožděného nástupu funkce ledvin transplantovaných z NHBD.

Cíl práce:
V rámci experimentální studie demonstrovat možnosti ovlivnění IRS intravenózní aplikací antioxidancií nebo imunosupresiv příjemci před transplantací ledviny z NHBD

Metodika:
Studie probíhala na selatech o hmotnosti 20–25 kg (N = 45) v létech 2003–2008. Hodnotili jsme intravenózní aplikaci multivitamínů (SI) a kombinaci imunosupresiv (SII) jednu hodinu před transplantací ledviny z NHBD. Jako kontrolní skupina (SIII) sloužila selata, kde byla pouze modelována transplantace z NHBD bez použití jakéhokoli přípravku. V intervalech 0, 20, 60 a 120 minut po transplantaci ledviny jsme stanovili plazmatické hladiny malondialdehydu (MDA) a redukovaného glutathionu (GSH). Před a 120 minut po transplantaci jsme hodnotili tkáňové koncentrace obou faktorů v transplantované ledvině.

Výsledky:
Trvalé zvyšování plazmatických hladin MDA jsme zaznamenali v SIII. U SI a SII po částečném zvýšení hladin MDA v prvních 20 minutách po transplantaci jsme zaznamenali jejich trvalý pokles (p < 0,05, resp. p < 0,01). Rozdíly v plazmatických hladinách MDA u SI a SII nebyly statisticky signifikantní. Obě skupiny se odlišovaly od SIII (p < 0,001). Plazmatické hladiny GSH a tkáňové koncentrace MDA a GSH nebyly statisticky signifikantní.

Závěr:
Intravenózní aplikace multivitaminů nebo imunosupresiv před transplantací ledvin z NHBD může mít význam pro okamžitý nástup funkce transplantované ledviny v důsledku významného ovlivnění IRS.

Klíčová slova:
ischemicko-reperfuzní syndrom – dárce s nebijícím srdcem – multivitaminy – imunosupresiva

ÚVOD

Ischemicko-reperfuzní syndrom (IRS) je důležitým faktorem, který se podílí na bezprostřední a dlouhodobé funkci ledvin transplantovaných z dárce s nebijícím srdcem (NHBD). Čím intenzivnějšímu rozvoji IRS po transplantaci ledvin dochází, tím je větší pravděpodobnost rozvoje akutní rejekce transplantované ledviny. Právě ledviny z NHBD jsou zatíženy v důsledku teplé ischemie rozvojem IRS. Výsledkem je vyšší výskyt primární afunkce a opožděného nástupu funkce těchto ledvin v porovnání s ledvinami transplantovanými od jiných typů dárců. V našich předchozích experimentálních studiích [1, 2] jsme demonstrovali úzké spojení mezi rozvojem IRS a vznikem volných kyslíkových radikálů (VKR) a zánětlivých cytokinů v ledvinách odebraných z NHBD prakticky bezprostředně po jejich transplantaci.

Antioxidanty a imunosupresiva mohou významnou měrou ovlivnit rozvoj IRS tím, že redukují zánětlivou odpověď po reperfuzi transplantované ledviny, a tak mohou hypoteticky ovlivnit její bezprostřední i dlouhodobou funkci.

Cílem práce bylo na podkladě několika experimentálních studií zhodnotit význam intravenózního podání antioxidancií a imunosupresiv těsně před transplantací ledviny z NHBD pro ovlivnění IRS.

MATERIÁL A METODA

V experimentálních studiích, které probíhaly v létech 2003–2007 jsme použili selata (N = 45) o hmotnosti 20–25 kg. Všechny experimentální práce byly schváleny Etickou komisí pro práci s laboratorními zvířaty Lékařské fakulty v Plzni, Univerzity Karlovy v Praze a byly plně v souladu s Pravidly Evropské Unie pro práci s laboratorními zvířaty. Zvířata jsme rozdělili do 3 skupin (SI-III). První skupině (SI – N = 15) byl aplikován intravenózně (2 ml/min) multivitaminový přípravek (Multibionta N, Merck KGaA, Darmstadt, SRN – retinoli palmitas, thiamini hydrochloridum, riboflavini natrii phosphas dihydricus, nicotinamidum, dexpanthenolum, pyridoxini hydrochloridum, acidum ascorbicum, tocoferoli alfa acetas, tocoferolum alfa racemicum) v dávce 10 ml ve 100 ml fyziologického roztoku ihned po odběru levé ledviny. Druhé skupině zvířat (SII – N = 15) jsme podávali intravenózně mykofenolát mofetil (MMF, CellCept, Roche, Basilej, Švýcarsko), v dávce 20 mg/kg hmotnosti zvířete společně s takrolimem (Prograf, Astellas Pharma, Praha, Česká republika), 0,1 mg/kg, a hydrokortizonem (Hydrocortison Valeant, Valeant Czech Pharma, Praha, Česká republika) v dávce 3 mg/kg 60 minut po odběru levé ledviny. Třetí skupina SIII (N = 15) sloužila jako kontrolní skupina, kde byl pouze modelován odběr a transplantace z NHBD. Kombinaci imunosupresiv jsme zvolili podle našeho klinického protokolu u nemocných, jímž je transplantována ledvina z NHBD.

Kvalitu odebrané ledviny jsme hodnotili pomocí světelné a elektronové mikroskopie. Stupeň poškození glomerulů, tubulů a zánětlivých změn v intersticiu jsme hodnotili pomocí třístupňové škály. Tuto metodu jsme již dříve popsali [3]. Ledviny, u kterých jeden ze tří ukazatelů překročil stupeň poškození 2 jsme vyřadili a nebyly použity k transplantaci. Celkově jsme tak hodnotili 41 ledvin (SI – 14, SII – 14, SIII – 13).

Celý experiment probíhal v celkové anestezii s řízenou ventilací. Zvířata byla premedikována intramuskulární aplikací azaperonu (5–6 mg/kg) a atropinu (0,075 mg/zvíře). Periferní žilní vstup byl zajištěn ušní žilou a centrální pak vnitřní jugulární žilou. Během úvodu do celkové anestezie ještě před intubací jsme aplikovali intravenózně thiopental 7,5–10/kg. Zvířata byla řízeně ventilována v režimu: T=0,8 s, in P = 16 cm H₂O, BR = 28/min, PEEP = 5cm H₂O, FiO₂=0,3u. Během výkonu byla zvířata anestezována intravenózní aplikací ketaminu (Calypsol) v průměrné dávce 0,2 mg/kg a pankuronia bromide v dávce 0,1 mg/kg. Jako volumový expandér jsme použili 10% HES, dále Ringer laktát 1/1 v poměru 1:1 intravenózně (50–80 ml/hod). Inotropní podporu jsme zajišťovali dopaminem v průměrné dávce 2–3 mg/kg/min.

NHBD modelaci jsme provedli po střední laparotomii uzávěrem hilu levé ledviny cévní svorkou na 45 min. Čtyři minuty před uzávěrem hilu jsme podali intravenózně 100 UI heparinu/kg hmotnosti zvířete. Po 45 minutách uzávěru levého hilu jsme odebrali levou ledvinu, promyli ji 200ml Histidin - Tryptofán - Ketoglutarát roztokem (Custodiol, HTK,Dr.Franz Kohler Chemie, GmbH,SRN). Z horního pólu ledviny jsme odebrali klínovitou biopsii pro stanovení tkáňových hladin malondialdehydu (MDA) a redukovaného glutathione (GSH) v kůře a dřeni ledviny. Tkáňové vzorky jsme před laboratorním zpracováním uchovávali při teplotě -80 °C. Levou ledvinu jsme autotransplantovali stejnému zvířeti po 60 min intravenózní aplikaci výše uvedených přípravků (SI, SII). Provedli jsme heterotopickou transplantaci původní laparotomií, kdy renální žílu jsme našili na dolní dutou žílu a renální tepnu na aortu zvířete. Ureter byl vyveden v dolním pólu laparotomie jako ureterostomie. V intervalech 0, 20, 60 a 120 min jsme odebírali venózní krev z renální žíly transplantované ledviny pro stanovení MDA a GSH.

Po 120 minutách reperfuze jsme odebrali další klínovitou biopsii z horního pólu ledviny pro stanovení tkáňových hladin MDA a GSH. Zvířata byla následně utracena intravenózní aplikací 40 ml 7,5% kalium chloratum.

GSH jsme stanovovali spektrofotometricky a výsledky byly hodnoceny v mmol/1 erytrocytů. Hodnocení jsme provedli na přístroji Olympus AU 400 Analyzer (Olympus, Japonsko) pomocí reagentů GSH 400 (OXIS, Portland, USA). MDA jsme stanovovali fotometricky podle Jentzsche. MDA a GSH tkáňové koncentrace jsme měřili po tkáňové homogenizaci a hladiny u MDA, resp. GSH jsme vyjádřili v nmol/g, resp. mmol/g bílkoviny. Statistickou analýzu jsme provedli pomocí statistického software STATISTICA 98. Hodnoty jednotlivých parametrů jsme uváděli jejich průměry a směrodatnou odchylkou. Pro sledování parametrů v čase jsme využili testu ANOVA (Kruskalův-Wallisův test), kde p < 0,05 bylo považováno za statisticky signifikantní.

VÝSLEDKY

V kontrolní (SIII) skupině jsme pozorovali trvalý vzestup MDA hladin jako výraz produkce VKR během IRS. U SI a SII došlo k dočasnému vzestupu plazmatických hladin MDA v první 20 minutách reperfuze, s následným jejich trvalým poklesem, což svědčilo pro dostatečnou saturaci organizmu zvířete antioxidačním potenciálem. U obou skupin byl pokles MDA v čase statisticky významný (p < 0,05, resp. p < 0,01) – Tabulka 1. Rozdíly v hladinách MDA nebyly mezi SI a SII významné. Obě skupiny se však v plazmatických hladinách MDA významně lišily s SIII (p < 0,01, resp. p < 0,001) – Tabulka 2. Plazmatické hladiny GSH nedosahovaly u žádné skupiny ani v porovnání jednotlivých skupin statistické významnosti. Tkáňové hladiny MDA a GSH v kůře a dřeni transplantovaných ledvin před a po transplantaci nedosáhly rovněž statistického významu (Tab. 3).

Vývoj plazmatických hladin MDA (mmol/1) a GSH (mmol/1) u SI (N = 14), SII (N = 14) a SIII (N = 13) během 120 minut experimentu (průměrné hodnoty ± SD; NS – není signifikantní)
Tab. 1. The course of the MDA (mmol/1) and GSH (mmol/1) plasma levels in SI (N = 14), SII (N = 14) and SIII (N = 13) over the 120-minute experiment (mean values ± SD; NS – insignificant) — Tab. 1. Vývoj plazmatických hladin MDA (mmol/1) a GSH (mmol/1) u SI (N = 14), SII (N = 14) a SIII (N = 13) během 120 minut experimentu (průměrné hodnoty ± SD; NS – není signifikantní) Tab. 1. The course of the MDA (mmol/1) and GSH (mmol/1) plasma levels in SI (N = 14), SII (N = 14) and SIII (N = 13) over the 120-minute experiment (mean values ± SD; NS – insignificant)

Průměrné plazmatické hladiny MDA a GSH u SI (N = 14), SII (N = 14) a SIII (N = 13) vypočítané z naměřených plazmatických hladin sledovaných faktorů v 0, 20, 60 a 120 minut experimentu
Tab. 2. Mean plasmatic MDA and GSH values in SI (N = 14), SII (N = 14) and SIII (N = 13), calculated from the recorded plasmatic levels of the studied factors at 0, 20, 60 and l20 minutes — Tab. 2. Průměrné plazmatické hladiny MDA a GSH u SI (N = 14), SII (N = 14) a SIII (N = 13) vypočítané z naměřených plazmatických hladin sledovaných faktorů v 0, 20, 60 a 120 minut experimentu Tab. 2. Mean plasmatic MDA and GSH values in SI (N = 14), SII (N = 14) and SIII (N = 13), calculated from the recorded plasmatic levels of the studied factors at 0, 20, 60 and l20 minutes

Porovnání MDA a GSH hladin v kůře (k) a dřeni (d) transplantované ledviny, před a dvě hodiny po transplantaci
Tab. 3. Comparison between MDA and GSH levels in the cortex (k) and the medulla (d) of transplanted kidney, prior toand two hours following transplantation — Tab. 3. Porovnání MDA a GSH hladin v kůře (k) a dřeni (d) transplantované ledviny, před a dvě hodiny po transplantaci Tab. 3. Comparison between MDA and GSH levels in the cortex (k) and the medulla (d) of transplanted kidney, prior toand two hours following transplantation

DISKUSE

Celosvětový nedostatek ledvin pro transplantační účely a trvalý vzestup počtu nemocných v chronické renální insuficienci vede k hledání nových zdrojů pro transplantace ledvin. Ledviny odebrané z NHBD jsou nepochybně jedním z řešení tohoto problému. Jsou však zatíženy vysokým procentem opožděného nástupu funkce po transplantaci (60–70 %) a primární afunkcí (5–8 %) v porovnání s ledvinami od dárců s bijícím srdcem [4, 5, 6]. Pravděpodobně hlavním problémem je u ledvin z NHBD dlouhý čas teplé ischemie s následným rozvojem IRS.

IRS je hlavním tzv. antigen-nezávislým faktorem, který se podílí na poruchách funkce ledviny transplantované z NHBD. Navíc nemocní v chronické renální insuficienci jsou zatíženi vysokou produkcí VKR, která se ještě dále stupňuje po transplantaci ledviny z NHBD. V důsledku peroxidace lipidů dochází k poškození buněčných membrán, přímé oxidaci membránových proteinů a k aktivaci endoteliálních buněk. Výsledkem je pak strukturální a funkční poškození renální tkáně [7, 8, 9]. IRS působí nejen na funkci transplantované ledviny, ale je znám i jeho vzdálený vliv na funkci jiných orgánů, např. jater [10].

Předkládaná studie vychází z řady našich experimentálních studií, které jsme prováděli v letech 2003–2007 na experimentálním pracovišti Lékařské fakulty v Plzni [11, 12]. Jistým problémem našich dřívějších studií byl poměrně krátký čas teplé ischemie – 30 minut.Tato doba simuluje základní resuscitační čas, avšak nezohledňuje délku zástavy srdeční do počátku kardiopulmonální resuscitace a tzv. „non-touch“ dobu před odběrem ledviny z NHBD [13, 14]. Proto tato experimentální studie zohlednila výše uvedenou dobu teplé ischemie, kterou jsme zvolili 45 minut. Hodnotili jsme saturaci příjemce antioxidanty (multivitaminy) nebo protizánětlivými přípravky (imunosupresiva), které hrají důležitou roli v rozvoji IRS. Abychom vyloučili antigenní faktory v rozvoji IRS, zvolili jsme metodu autotransplantace, kdy stejnému zvířeti byla odebrána a transplantována jeho ledvina.

Podání antioxidancií nebo imunosupresiv jednu hodinu před transplantací vedlo k významnému poklesu plazmatických hladin MDA po 20 minutách reperfuze štěpu. Nenalezli jsme rozdílu v plazmatických hladinách hlavního intracelulárního antioxidantu – GSH mezi jednotlivými skupinami. Rovněž tkáňové hladiny GSH a MDA před a po reperfuzi ledviny nebyly statisticky významné. Tento fenomén pravděpodobně souvisí s nedostatečnou saturací ledvinné tkáně antioxidanty a protizánětlivými léky pravděpodobně v důsledku jejich krátké doby intravenózní aplikace. Nicméně tento čas aplikace byl dostatečný pro snížení rozvoje IRS u našeho experimentálního modelu IRS.

ZÁVĚR

Závěrem můžeme konstatovat, že intravenózní aplikace antioxidancií nebo imunosupresiv s protizánětlivým účinkem jednu hodinu před transplantací ledviny z NHBD může významně ovlivnit rozvoj IRS, a tak zlepšit bezprostřední a dlouhodobou funkci štěpu.

*Práce byla podpořena výzkumným záměrem VZMSM 0021620819.

Prof. MUDr. V. Třeška, DrSc.

U Českého dvora 11

326 00 Plzeň

e-mail: treska@fnplzen.cz

Zdroje

1. Třeška, V., Kuntscher, V., Moláček, J., Kobr, J., Racek, J., Trefil, L. Can the ischemia-reperfusion syndrome in transplanted kidneys procured from non-heart-beating donors be influenced by adding selenium into the reperfusion solution? An experimental study. Transplant. Proc., 2003; 35, s. 3125–3127.

2. Třeška, V., Moláček, J., Kuntscher, V., Liška, V., Kobr, J., Racek, J., Kormunda, S. Immunosuppresive agents have an influence on ischemia-reperfusion injury in kidneys procured from a non-heart-beating donor: experimental study. Transplant. Proc., 2004; 36: s. 2931–2934.

3. Třeška, V., Moláček, J., Kobr, J., Racek, J., Trefil, L., Hes, O. Ichemic training and immunosuppressive agents reduce the intensity of ischemic reperfusion injury after kidney transplantation. Exp. Clin. Transplant., 2006; 4: s. 439–444.

4. White, S. A., Jain, S., Absalom, H., Murphy, G., Williams, S. T., Knight, A., Zickerman, A. M., Nicholson, M. L. Influence of Delayed Graft Function in Renal Transplants From Cadaveric or Non-Heart -Beating Donors. Transplant. Proc., 2000; 32: s. 189.

5. Brook, N. R., White, S. A., Waller, J. R., Veitch, P. S., Nicholson, M. L. Non-heart beating donor kidneys with delayed graft function have superior graft survival compared with conventional heart-beating donor kidneys that develop delayed graft function. Am. J. Transplant., 2003; 3: s. 614–618.

6. Rela, M., Jassem, W. Transplantation from non-heart-beating donors. Transplant. Proc., 2007; 39: s. 726–727.

7. Aquilar, A., Alvarez-Vijande, R., Capdevila, S., Alcoberro, J., Alcaraz, A. Antioxidant patterns (superoxide dismutase, glutathione reductase, and glutathione peroxidase) in kidneys from non-heart-beating-donors: experimental study. Transplant. Proc., 2007; 39: s. 249–252.

8. Richer, J. P., Gibelin, H., Planet, M., Bardou, A., Ben Amor, I., Germoville, T., Caritez, J. C., Carretier, M., Eugene, M., Hauet, T. Ischemia-reperfusion injury is associated with inflammatory cell infiltration: evaluation in a pig kidney autotransplant model. Transplant. Proc., 2000; 32: s. 482–483.

9. Gulec, B., Coskun, K., Oner, K., Aydin, A., Yigitler, C, Kozak, O., Uzar, A., Arslan, I. Effects of perfusion solutions on kidney ischemia-reperfusion injury in pigs. Transplant. Proc., 2006; 38: s. 371–374.

10. Gulec, B., Coskun, K., Yigitler, C, Yigit, T., Aydin, A., Oner, K. Ischemia-reperfusion injury in the liver during renal transplantation: does perfusion solution play any role? Transplant. Proc., 2008; 40: s. 59–62.

11. Třeška, V., Racek, J., Kuntscher, V., Hasman, D., Kobr, J., Moláček, J., Trefil, L., Hes, O., Reischig, T. Plasma and tissue levels of free oxygen radicals in recipients of kidneys from non-heart-beating donors:does recipient pretreatment with antioxidant drugs make sense? An experimental study in pigs. Transplant. Proc., 2002; 34: s. 3060–3064.

12. Hes, O., Třeška, V., Hasman, D., Boudová, L., Kuntscher, V. Determination of apoptotic cells in kidneys from non-heart-beating donors and heart-beating donors using the TUNEL assay: a limited immunohistochemical method? Transplant. Proc., 2002; 34: s. 1095–1097.

13. Navarro, A. P., Sohrabi, S., Wilson, C, Sanni, A., Wyrley-Birch, H., Vijayanand, D., Reddy, M., Rix, D., Manas, D., Talbot, D. Renal transplants from category III non-heart-beating donors with evidence of pre-arrest acute renal failure. Transplant. Proc., 2006; 38: s. 2635–2636.

14. Sanni, A. O., Wilson, C. H., Wyrlex-Birch, H., Vijayanand, D., Navarfro, A., Gok, M. A., Sohrabi, S., Jaques, B., Rix, D., Soomro, N., Manas, D.,Talbot, D. Non-heart-beating kidney transplantation: 6-year outcomes. Transplant. Proc., 2006; 38: 3396–3397.