Experimentální příprava korozivních preparátů orgánů velkého zvířete

Súhrn

Úvod:
Korozivní preparáty (KP) slouží k vizualizaci a hodnocení morfologie dutých struktur. KP s naplněným kapilárním řečištěm umožňují za pomoci zobrazovacích metod získání dat použitelných pro matematické modelování orgánové perfuze. Náročnost přípravy KP stoupá s objemem cévního řečiště, proto byly touto metodou doposud zkoumány zejména malé živočišné druhy. Cílem této studie bylo optimalizovat protokoly přípravy korozivních preparátů různých orgánů prasete domácího, a to vzhledem k dostupnosti těchto orgánů a významu prasete domácího v experimentální medicíně.

Metoda:
Byly použity orgány (játra, slezina, ledviny a tenké střevo) zdravého prasete domácího. Celkem 10 prasat (6 samic), plemeno přeštické černostrakaté, hmotnost 35–45 kg. Orgány byly vypreparovány, do systémového řečiště byl aplikován heparin a následně byl cévní systém orgánu propláchnut buď in situ (játra), nebo po vyjmutí z těla zvířete (ledviny, slezina, tenké střevo) heparinizovaným fyziologickým roztokem. Veškerá manipulace s vyjmutými orgány pak probíhala pod vodní hladinou z důvodu prevence embolizace vzduchu do cévního řečiště. Dalším krokem byla intraarteriální (u jater i intraportální) aplikace pryskyřice Biodur E20^® (Heidelberg, Německo). Po ztuhnutí pryskyřice byly odstraněny okolní tkáně pomocí 15% roztoku KOH a poté vymyty vodou. Objemné preparáty byly uchovávány v 70% denaturovaném alkoholu, menší byly vysušeny mrazem. Hotové KP byly zkoumány pomocí stereomikroskopu, běžné výpočetní tomografie (CT), mikro-CT, skenovací elektronové mikroskopie (SEM) nebo vysokorozlišovacího digitálního mikroskopu.

Výsledky:
Díky odběru orgánů za specifických podmínek, použití vhodné pryskyřice i metodiky nástřiku se podařilo získat kvalitní KP jater, ledvin, sleziny a tenkého střeva prasete domácího. Možnost barvení pryskyřice zlepšila makroskopickou přehlednost preparátů. Bylo provedeno skenování pomocí běžného CT, které se ukázalo jako vhodná metoda pro zkoumání preparátu jater. Mikro-CT, SEM a vysokorozlišovací digitální mikroskopie pak přinesly obrazy nejdrobnějších struktur řečiště zkoumaných orgánů. I když se SEM pro kontrolu kvality odlitků ještě stále jeví jako nezastupitelná, zdá se, že může být částečně nahrazena vysokorozlišovacím digitálním mikroskopem. Mikro-CT umožnilo získání dat o prostorovém uspořádání řečiště a dat pro budoucí softwarové modelování orgánové perfuze zkoumaných orgánů. Vysoká kvalita získaných preparátů umožnila jejich využití i ve výuce anatomie člověka.

Závěr:
Podařilo se optimalizovat protokol přípravy KP jater, ledvin, sleziny a tenkého střeva prasete domácího. S použitím různých zobrazovacích modalit mohou být tyto KP využity pro získání dat o prostorové architektonice cévního řečiště. Tato data mohou být využita pro přípravu matematických modelů orgánové perfuze využitelných například pro optimalizaci orgánových resekcí.

Klíčová slova:
korozivní preparáty – kapilární řečiště – Biodur E20^® – prase domácí – animální model

ÚVOD

Korozivní preparáty (KP) slouží k vizualizaci a hodnocení morfologie dutých struktur. Jejich příprava spočívá ve vyplnění prostor polymerizující látkou a v následném odleptání okolních tkání. Vzniklý preparát je tedy odlitkem dutiny (lumina). Historie KP sahá až do středověku. Obvykle je za objevitele a průkopníka této metodiky považován Leonardo da Vinci, který na začátku 16. století vyplňoval hovězí mozkové komory a srdeční dutiny voskem, po jeho ztuhnutí však okolní tkáně odstraňoval mechanicky [1,2]. Nejednalo se tedy přímo o korozi (proces definovaný jako samovolné, postupné rozrušení hmoty vlivem chemické reakce s okolím), z tohoto hlediska je historie KP mnohem starší. V tzv. prekorozivním období např. již Alessandra Giliani (1307–1326), italská vědkyně a anatomka, jako první naplnila velké cévy lidského těla barevnou tvrdnoucí látkou, aby usnadnila jejich sledování. První skutečný korozivní preparát připravil nejspíš až holandský anatom Govert Bidloo (1649–1713), jenž naplnil dýchací cesty člověka roztaveným kovem a po jeho ztuhnutí odstranil okolní tkáň varem [3]. V následujících stoletích se anatomové snažili vylepšit jak aplikovaná média, tak techniku samotné aplikace nebo odstranění okolních tkání tak, aby získali co nejpřesnější odlitky zkoumaných struktur [4].

KP nacházejí své využití zejména při studiu cévního řečiště jednak normálních a jednak patologicky změněných orgánů [5]. Pro hodnocení cévního stromu je nutná dobrá náplň kapilárního řečiště [6].

Ke zkoumání KP jsou využívány různé zobrazovací techniky. V 70. letech minulého století byly publikovány první práce využívající skenovací elektronovou mikroskopii (SEM) pro diagnostiku různých struktur kapilárního řečiště [7]. Jeho dobrá náplň byla umožněna nově syntetizovanými akrylovými a epoxidovými pryskyřicemi. Pro zkoumání KP je poměrně nově využívána metoda mikroCT. Zdá se, že se zavedením vysokorozlišovací tomografie (mikroCT) prožívají KP opět svoji renesanci [8,9,10]. Ačkoli je SEM pro kontrolu kvality odlitků stále nezastupitelná, při použití RTG kontrastních pryskyřic nabízí mikroCT v kombinaci s využitím v klinické praxi běžně používaných softwarů zcela nové možnosti 3D zobrazení s rozlišením struktur na úrovni 2D histologických řezů [11]. CT skeny je však možné použít i pro potřeby modelování perfuze nebo kvantifikaci jednotlivých parametrů mikrocirkulačního řečiště (míra větvení, úhel odstupu cév atd.) [10,12]. Jako velmi nadějná zobrazovací technika se pro studium cévní morfologie založené na KP jeví i vysokorozlišovací digitální mikroskopy, které díky mobilnímu objektivu a pohybu v Z ose umožňují 3D rekonstrukce s možností zvětšení až 2000x, a to v rozlišení odpovídajícím možnostem SEM. Avšak na rozdíl od SEM můžeme s digitálním mikroskopem odečítat povrchové struktury do hloubky až 1 cm bez nutnosti řezání preparátu nebo následné fixace či pokovování vzorku. Digitální fotografie umožňují reálný barevný obraz, instalovaný software pak možnost 2D i 3D měření.

Pro dobrou náplň kapilárního řečiště je nutné odebírat orgán za specifických podmínek (systémová heparinizace, průplach řečiště izotonickým roztokem). Z toho důvodu jsou lidské orgány pro tento účel prakticky nedostupné. Výjimku tvoří jen orgány vyřazené z transplantace [8,13]. Cílem této studie bylo optimalizovat protokoly přípravy korozivních preparátů různých orgánů prasete domácího, a to vzhledem k dostupnosti těchto orgánů a významu prasete domácího v experimentální medicíně.

METODA

Studie byla provedena dle platné legislativy a s povolením Ministerstva zemědělství ČR. Byly dodrženy stávající předpisy a směrnice pro chov a experimentální využívání zvířat v souladu se zákonem č. 246/1992 upraveným vyhláškou č. 207/2004 s následným výkladem k vyhlášce č. 39/2009. Orgány byly získány z prasete domácího (plemeno přeštické černostrakaté prase), které je na Lékařské fakultě UK v Plzni využíváno jako animální model pro výzkumné účely [14,15,16,17]. Pracovalo se s 10 zdravými jedinci z jatečního chovu (6 samic, váha 35–45 kg).

Zvířata byla operována v celkové anestezii za použití mechanické ventilace. Orgány byly vypreparovány a ihned poté zvířeti aplikován heparin (100 IU/kg váhy). Následovalo propláchnutí cévního systému orgánu heparinizovaným fyziologickým roztokem (5000 IU/1 l fyziologického roztoku). V případě jater byl proveden proplach in situ pomocí katétrů zavedených suprahepaticky do vena cava caudalis a do arteria hepatica. Vena portae zůstala volná pro odtok krve a fyziologického roztoku, infrahepatická část vena cava caudalis byla podvázána. V případě ostatních orgánů byl proplach proveden intraarteriálně po vynětí orgánu z těla zvířete. Žíly byly ponechány volné pro odtok. Obě ledviny byly ponechány jako jeden preparát a proplachování bylo provedeno intraaortálně s odtokem cestou vena cava caudalis. Po propláchnutí byly cévy vyjmutých orgánů zasvorkovány a orgány přeneseny a proplněny pryskyřicí pod vodní hladinou z důvodu prevence embolizace vzduchu do cévního řečiště.

Plnění cévního stromu pryskyřicí Biodur E20^® (Heidelberg, Německo) bylo provedeno tepennou cestou (ledviny, slezina, střevo), u jater i cestou vena portae. U některých preparátů jater byly navíc naplněny i žlučové cesty včetně žlučníku cestou ductus choledochus, v případě ledvin pak retrográdně močovod a ledvinová pánvička. Některé preparáty ledvin byly plněny jak cestou intraarteriální, tak intravenózní. Při aplikaci pryskyřice více cestami bylo vždy provedeno barvení pryskyřice k následnému usnadnění makroskopického rozlišení jednotlivých řečišť a struktur. Po aplikaci pryskyřice orgány zůstaly ve vodní lázni o pokojové teplotě. Po ukončení polymerizace pryskyřice (asi 24 hod.) byl orgán přemístěn do 15% roztoku KOH, jenž rozpustil organické tkáně. Hotové KP byly uchovány v 70% denaturovaném alkoholu, menší byly vysušeny mrazem.

Pro studium a ověření kvality hotových KP byly použity následující zobrazovací metody: pro přehledové vyšetření větších struktur běžné CT (Somatom Sensation 64, Siemens, Forchheim, Německo), pro detailnější zobrazení stereomikroskop (Olympus SZX7; Tokio, Japonsko), dále mikroCT (Xradia µXCT 400, Pleasanton, CA, USA), SEM SU-70 (Hitachi, Japonsko) a digitální mikroskop Keyence VHX-6000 (Osaka, Japonsko). Při použití technik mikroCT, SEM a stereomikroskopu nelze vyšetřit preparáty velkých orgánů jako jeden celek. Preparáty tedy byly zamraženy v destilované vodě a nařezány na pásové pile na menší díly o velikosti přibližně 1 cm³. Pro zkoumání pomocí SEM bylo dále potřeba tyto nařezané kostky na 5 minut ponořit do 5% kyseliny mravenčí, opláchnout v destilované vodě, usušit na vzduchu a pokrýt zlatem. Až po této přípravě mohlo být provedeno vyšetření SEM.

VÝSLEDKY

Byla vypracována metodika přípravy KP různých orgánů prasete domácího (Obr. 1–3). Díky proplachu cévního řečiště orgánů při jejich odběru, prevenci vzduchové embolizace a díky použití pryskyřice s požadovanými vlastnostmi (přiměřená viskozita, dostatečný manipulační čas před ztuhnutím, nízká lámavost po ztuhnutí) se podařilo naplnit celé cévní řečiště včetně kapilár. Při aplikaci pryskyřice arteriální cestou došlo v případě ledvin, sleziny a střeva k naplnění celého řečiště skrz kapiláry až do žil. U jater došlo při aplikaci intraarteriální a intraportální k naplnění sinusoid a skrz venae centrales postupně venae hepaticae a vena cava caudalis (Obr. 1 A, B). Použitá pryskyřice Biodur E20 umožňuje zároveň zobrazení velkých struktur (vrátnicová žíla, jaterní tepny a žíly, ledvinové a slezinové tepny a žíly, žlučové cesty se žlučníkem) i mikrocirkulace (glomeruly, jaterní sinusoidy). Možnost barvení této pryskyřice pak zlepšuje makroskopickou přehlednost připravovaných preparátů.

Díky dostatečné radioopacitě lze takto získané preparáty vyšetřovat pomocí CT. Běžné CT je však z důvodu velikosti orgánu a vyšetřovaných struktur použitelné pouze u jater (Obr. 1 C). Softwarové programy umožňují prostorové rekonstrukce větších cév a odlišení jednotlivých cévních řečišť. Autoři prezentují rekonstrukci pomocí volume rendering technique (VRT) s patrným řečištěm vena portae a vena cava caudalis (Obr. 1 C). Díky běžnému CT mohou být vytipovány dobře naplněné části orgánů vhodné k detailnějšímu zobrazení. Podobně jako běžné CT, umožňuje i mikroCT provedení prostorových rekonstrukcí a měření včetně kvantifikací (Obr. 1 D) [10]. I přes technický pokrok se jeví SEM pro kontrolu kvality odlitku včetně diagnostiky různých oddílů cévního stromu jako nezastupitelná. Autoři představují obraz jaterního lalůčku včetně vena centralis a obraz peribiliární arteriální pleteně (Obr. 1 E, F). Na KP jater prasete je také demonstrována přítomnost pěti laloků na rozdíl od lidských jater (Obr. 1 A).

V případě tenkého střeva byly zobrazeny cévy mezenteria, došlo k naplnění cestou a. mesenterica superior a arteriae rectae až do mikrocirkulace vlastního střeva a dále pak k naplnění přes drobné žíly mezenteria do přítoků vena mesenterica superior (Obr. 2 A). Na preparátu střeva před samotnou korozí jsou patrné mízní cévy mezenteria (Obr. 2 B).

Dále autoři prezentují makroskopický obraz preparátu ledvin plněný jednak arteriální cestou a jednak skrz močovod. Patrné jsou cévy vyživující močovod (Obr. 2 C). Při plnění jak arteriálním, tak venózním řečištěm se podařilo zobrazit arteriovenózní anastomózu (Obr. 2 D).

V případě sleziny došlo také k naplnění mikrocirkulace, ovšem aplikovaná pryskyřice přestoupila do intersticia, v němž vytvořila kvůli svým hydrofobním vlastnostem typické kulovité útvary, patrné na snímcích ze SEM (Obr. 3 B). Dále autoři představují makroskopický obraz celého preparátu sleziny před korozí a po ní (Obr. 3 A, C).

MikroCT umožnilo získání dat o prostorovém uspořádání mikrocirkulace a dat pro budoucí softwarové modelování orgánové perfuze zkoumaných orgánů. Vysoká kvalita získaných preparátů umožnila jejich využití i ve výuce anatomie člověka.

DISKUZE

Zhotovené preparáty umožnily demonstraci rozdílů mezi anatomií prasečích a lidských orgánů. Vzhledem k tomu, že byly použity orgány prasete pro studii s předpokládaným přesahem do lidské medicíny, je potřeba zmínit tyto odlišnosti mezi lidskými a prasečími orgány. Například játra prasete domácího mají makroskopicky obvykle pět laloků (lobus lateralis dexter et sinister, lobus medialis dexter et sinister, lobus caudatus). Lobus quadratus je variabilní. Cévní a žlučový strom je však lidským játrům bližší, utváří také osm segmentů, které jsou zhruba shodné s lidskými [18]. Játra prasete domácího jsou tak vhodným modelem pro nácvik chirurgických technik [19,20], studium regenerace [21,22] nebo pro matematické modelování [23]. Histologicky je u zdravých jater prasete popisováno vazivo ohraničující jednotlivé jaterní lalůčky, zatímco u člověka je toto vazivo patrné pouze za patologických stavů, jako jsou jaterní fibróza či cirhóza [24].

Ledviny prasete jsou podobné lidským svou velikostí, hmotností, počtem a stavbou nefronů včetně architektury mikrocirkulace [25,26]. Liší se však počtem segmentů. Zatímco lidské ledviny mají obvykle pět segmentů, ledviny prasete mají pouze čtyři segmenty. Arteria renalis se u prasat větví před ledvinovou brankou na horní a dolní pólovou tepnu a poté na přední a zadní segmentové tepny [27].

Slezina prasete se liší svým tvarem od sleziny lidské. Je významně delší a užší, její mikrostruktura doposud nebyla detailně zkoumána.

Lidské orgány jsou také využívány pro přípravu cévních korozivních preparátů, v průběhu odběru je však řečiště již zpravidla vyplněno koaguly, a naplnění mikrocirkulace je tudíž obtížné [28,29], avšak ne nemožné [30], což může činit problémy zejména při pokusu o dokonalou náplň kapilár. Výjimku tvoří lidské orgány vyřazené z transplantace, jejichž řečiště je propláchnuto speciálními roztoky, a riziko trombotizace je tak eliminováno [8]. Získání takového orgánu je však možné jen ve výjimečných situacích. Je až zarážející, že u tak často používaného animálního modelu ještě chybějí základní morfologické údaje – např. množství vaziva v játrech zdravého prasete dosud nebylo kvantifikováno, ačkoli stupeň fibrotizace je klíčový pro hodnocení výsledku experimentu včetně jeho převodu do lidské medicíny [31]. 

U KP sleziny sice byla naplněna mikrocirkulace, ovšem došlo k extravazaci pryskyřice. Získané zobrazení mikrocirkulačního řečiště sleziny odpovídá otevřené cirkulaci, jež umožňuje přestup pryskyřice do intersticia. Tento nález je v souladu s prací Lametschwandtnera a kol. a ukazuje, že pro studium morfologie cévního řečiště sleziny prasete je nutné použití imunohistochemie nebo SEM z nativních vzorků [32].

Do budoucna je možné využití dat o cévním řečišti získaných pomocí KP a mikroCT k matematickému modelování perfuze jednotlivých orgánů. Tyto modely mohou mít význam například pro zkoumání vlivu izolované orgánové perfuze, ale i pro plánování a optimalizaci některých chirurgických výkonů, např. jaterních resekcí [33]. Pokud by bylo možné pomocí těchto perfuzních modelů predikovat jaterní regeneraci, mohla by se zvýšit operabilita pacientů s jaterními malignitami. Nová zjištění mohou přinést i KP patologicky změněných orgánů. Již dnes je známo například využití KP jater pro výpočet smykového napětí na stěně vrátnicové žíly u myšího modelu portální hypertenze [34].

ZÁVĚR

Byla vypracována metodika přípravy KP různých orgánů prasete domácího. Za mimořádný úspěch lze označit optimalizaci protokolu pro přípravu KP jater prasete s ohledem na komplikované cévní řečiště a náročnost operačního protokolu. Předpokládáme možnost použití této metodiky i pro jiná velká zvířata včetně lidských jater. V této studii zhotovené preparáty mohou sloužit pro výuku anatomie a jejich výhoda spočívá v možnosti zkoumání postupně od makroskopických až po mikroskopické struktury v rámci jednoho preparátu. Je možné vytvořit trojrozměrné modely mikrocirkulace z dat získaných pomocí mikroCT. Získaná data o prostorovém uspořádání mikrocirkulačního řečiště pak mohou být přínosná pro matematické modely orgánové perfuze s významem pro chirurgické resekce a transplantační chirurgii.

Poděkování:

Tato studie byla podpořena programem UNCE/MED/006 „Centrum klinické a experimentální jaterní chirurgie“ Univerzity Karlovy, Národním programem udržitelnosti I (NPU I) č. LO1503 poskytovaným Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy. Dále z prostředků Univerzity Karlovy v rámci Investičního programu 2016–18 a GAUK č. 1206417.

Konflikt zájmů

Autoři článku prohlašují, že nejsou v souvislosti se vznikem tohoto článku ve střetu zájmů a že tento článek nebyl publikován v žádném jiném časopise.

MUDr. Richard Pálek

Chirurgická klinika, UK, LF v Plzni, FN Plzeň

alej Svobody 80

304 60 Plzeň

e-mail: palekr@fnplzen.cz