Porucha v regulácii chromatínu ako molekulárny mechanizmus MLL-ENL leukemogenézy

Souhrn

Chromozomálne aberácie postihujúce gén Mixed-Lineage Leukemia (MLL, známy tiež pod názvami HRX alebo ALL-1) na lokuse 11q23 sú asociované s agresívnym typom akútnej leukémie. Časté translokácie vedú ku vzniku heterogénnej skupiny MLL fúznych génov, ktoré získaním aktívneho transformačného potenciálu spôsobujú leukemickú konverziu MLL transkripčného faktoru. MLL proteín sa zúčastňuje epigenetického procesu udržovania expresie homeotických (Hox) génov v priebehu niekoľkých bunkových delení počas vývinu a diferenciácie buniek. Abnormálne zmeny v tomto procese vedú ku vzniku leukémie. Cieľom tohto súhrnného článku je poskytnúť ucelený prehľad o normálnej a malígnej funkcii MLL proteínov so zameraním predovšetkým na MLL-ENL v rámci súčasných poznatkov. Súhrnný článok zároveň zahŕňa vlastný prínos našej skupiny do danej problematiky MLL leukémií.

Kľúčové slová:
akútna leukémia, MLL, translokácia, chromatín, epigenetika, transkripcia

Heterogenita prestavieb MLL génu

Gén MLL sa nachádza v oblasti 11q23 a zúčastňuje sa viacerých typov chromozomálnych aberácií, ktoré spôsobujú konverziu MLL protoonkogénu na aktívny onkogén. Mutácie génu MLL zahŕňajú okrem častých translokácií, aj inverzie, duplikácie, delécie; vo vzácnych prípadoch sa vyskytujú i génové amplifikácie. Najčastejšími mutáciami sú recipročné translokácie (1–3), ktoré sú asociované s agresívnou akútnou leukémiou (AL) v detskom aj v dospelom veku. V ich dôsledku vznikajú chimerické onkoproteíny, u ktorých N-terminálny konec MLL proteínu je fúzovaný s C-terminálnym koncom partnerského proteínu. Zlom v géne MLL najčastejšie nastáva v oblasti zahŕňajúcej exóny 8-14, nazývanej breakpoint cluster region (BCR). Lokalizáciu zlomov DNA do tejto oblasti ako i ich frekvenciu vo veľkej miere ovplyvňuje jej chromatínová štruktúra, ďalej repetitívne sekvencie a rozpoznávacie miesta pre topoizomerázu II, ktoré sa v BCR nachádzajú (4, 5, 6). Nie je preto prekvapením, že prestavby MLL patria medzi najčastejšie abnormality u sekundárnych leukémií po terapii inhibítormi topoizomerázy II.

MLL translokácie sa vyznačujú pozoruhodnou heterogenitou partnerských génov. Bolo popísaných viac než päťdesiat partnerských génových lokusov, ale ich značná časť je neznámeho pôvodu. Atlas genetiky a cytogenetiky v onkológii a hematológii v súčastnosti uvádza tridsaťštyri identifikovaných fúznych MLL partnerov (http://www.infobiogen.fr/services/chromcancer/Genes/MLL.html). Niekoľko nových translokácií bolo identifikovaných a charakterizovaných na HOK v Olomouci (nepublikované výsledky (obr. 1). Napriek veľkej diverzite MLL fúzií platí určitá „zákonitosť“ vo frekvencii ich výskytu. Podľa subcelulárnej lokalizácie normálnych proteínových produktov partnerských génov MLL je možné ich rozdeliť na nukleárne a cytoplazmatické. MLL je translokovaný v 5 % prípadov detských akútnych lymfoblastických leukémií (ALL) (43) a u 80 % kojeneckých ALL, z ktorých najmenej 50 % tvoria dve translokácie zahŕňajúce nukleárnych partnerov: t(4;11), ktorej výsledkom je fúzny onkogén MLL-AF4, a t(11;19), ktorá dáva vznik fúznemu onkogénu MLL-ENL (7, 8). Kým MLL-AF4 špecifikuje výlučne pre-B bunkový fenotyp ALL, MLL-ENL sa vyskytuje aj u akútnych myeloblastických leukémií (AML), u akútnych bifenotypických leukémií (ABL) a v ojedinelých prípadoch u T-bunkovej ALL (1, 7, 9). Okrem toho tvoria MLL translokácie 10 % všetkých mutácií u AML. Sú to najmä fúzie s nukleárnymi partnermi: t(9;11), kódujúca fúzny produkt MLL-AF9, a t(6;11), kódujúca MLL-AF6 (10). Ďalšie MLL fúzne onkogény s nukleárnymi partnermi ako i všetky fúzie s cytoplazmatickými partnermi sa vyskytujú v malých skupinách pacientov a v ojedinelých prípadoch. Skutočnosť, že MLL je častejšie fúzovaný s nukleárnymi proteínmi, poukazuje na to, že tieto chimerické onkoproteíny sa vyznačujú vysokým transformačným potenciálom v porovnávaní s cytoplazmatickými partnermi, a menej vyžadujú kooperáciu ďalších onkogénov v leukemickej transformácii krvotvorných buniek. Nezávisle na fenotype leukémie, výskyt MLL mutácií u pacientov vždy zhoršuje prežitie a je spojený s veľmi zlou prognózou.

Normálna funkcia MLL

MLL proteín je transkripčný faktor, ktorý sa zapája do udržiavania „transkripčnej pamäte“ počas embryogenézy, dozrievania a vývinu mnohých typov buniek. MLL je proteín s vysokou molekulovou hmotnosťou (skladá sa z 3968 aminokyselinových jednotiek), ktorý sa v bunke proteolyicky štiepi na C-koncový (MLL^C) a N-koncový (MLL^N) fragment. Po translokácií do jadra sa fragmenty spoja do jedného proteínového komplexu (44, 45, 46). Zjednodušená štruktúra proteínu MLL a funkčné domény jednotlivých fragmentov sú znázornené na obrázku 2.

Transkripčná pamäť umožňuje bunke zapamätať si, akým je bunkovým typom, a zabezpečuje zachovanie a prenos daného genetického programu zakódovaného v podobe histónových modifikácií chromatínu do ďalšej generácie počas niekoľkých bunkových delení. To znamená, že daný histónový kód určuje, ktoré gény sa majú zapínať v danom vývinovom štádiu, ako dlho majú byť udržiavané v aktívnom stave a kedy ich treba vypnúť.

Heterozygótny stav straty funkcie MLL u myší vedie ku skeletálnym transformáciam a posteriornému posunu profilu expresie Hox génov. Expresia Hox génov sa normálne aktivuje u myších embryí s úplnou deficienciou MLL, ale nie je udržovaná počas celého vývinu, čo má letálny efekt v skorom štádiu embryogenézy. Tieto výsledky poukázali nato, že kľúčovými cieľovými génmi MLL sú Hox gény kódujúce transkripčné faktory s dôležitou úlohou v regulácii embryonálneho vývinu, bunkového delenia, líniovej špecifikácie a diferenciácie buniek (20, 32, 33).

Leukemická konverzia transkripčného faktoru MLL

Translokáciou na partnerský lokus transkripčný faktor MLL stráca C-terminálnu časť, ktorá je zodpovedná za transaktiváciu cieľových génov a poskytuje schopnosť modifikovať chromatín. Doterajšie práce dokazujú, že skrátená N-terminálna časť MLL nemá leukemogénne vlastnosti, avšak pomocou fúzneho partnera nadobúda transformačný potenciál in vitro (11–16) a spôsobuje leukémiu u myši (17–19). Skoršie hypotézy naznačovali, že MLL leukemogenéza by mohla byť výsledkom dvoch mechanizmov - získavania nových funkcií MLL onkogénu, ktorý dominantne negatívnym spôsobom potláča účinok normálnej alely, a zároveň straty funkcie jednej alely MLL. Súčasný pohľad na vznik a vývin MLL leukémií skôr podporuje mechanizmus nadobúdania nových onkogénnych funkcií, čo je v súlade s už dávno známym faktom, že heterozygótna deficiencia MLL nevedie k vývinu leukémie u myší (20). Jarošová a kol. popísali prípad „skrytej“ fúzie MLL-AF10 u pacienta s AML, ktorá vznikla duplikáciou 5‘ časti MLL a jej následnou inzerciou do oblasti 10p12. Ďalším zaujímavým zistením bolo, že nedošlo k recipročnej translokácii, a preto obidve alely MLL zostali zachované. Tento predtým nikdy nepopísaný mechanizmus vzniku MLL fúzií poskytuje ďalší dôkaz o tom, že strata jednej alely MLL neprispieva k leukemogenéze (21). Molekulárna podstata leukemickej konverzie MLL proteínu spočíva v nadobúdaní nových funkcií prostredníctvom fúznych partnerov. Jedným z mechanizmov je priama fúzia MLL s transaktivačnou doménou nukleárnych partnerských proteínov. Konverzia proteínu MLL na onkogénny transkripčný faktor je schematicky znázornená na príklade vzniku MLL-ENL fúzneho onkoproteínu na obrázku 2.

Viac partnerov-jedna funkcia?

Charakteristickým rysom MLL leukémií je ich rozmanitý fenotyp. Na rozdiel od iných leukemických onkogénov, ktoré sú zväčša asociované s jedinou špecifickou hematopoetickou líniou, jednotlivé MLL onkogény vykazujú tendenciu určovať leukemický fenotyp. Napriek vysokej heterogenite MLL fúznych onkoproteínov, nevykazujú MLL leukémie výrazne odlišný profil expresie génov v súvislosti s jednotlivými partnermi, ale MLL translokácie sa skôr zoskupujú na základe fenotypu leukemickej línie (22, 23). So všetkými prestavbami MLL génu je dominantne asociovaná vysoká hladina expresie Hox génov, čo poukazuje na to, že deregulácia Hox génov môže byť spoločným mechanizmom leukemickej transformácie MLL onkogénmi (23). Na základe týchto faktov si treba položiť otázku, ako môžu natoľko odlišné, nepríbuzné proteíny dávať vznik onkogénnym MLL chiméram, ktoré transformujú hematopoetickú bunku podobným mechanizmom – nadmernou expresiou Hox génov. Novšie štúdie sa domnievajú, že najčastejšie nukleárne partnerské proteíny MLL fúzií sú súčasťou siete proteínových interakcií, ktorá ich pravdepodobne spája do jedného hypotetického multiproteínového komplexu nazývaného „MLL-web“. V ňom sú jednak pospájané interakciami medzi sebou, a jednak fyzicky a funkčne interagujú s transkripčným aparátom a transkripčnou elongáciou. V strede „MLL-web“ komplexu ležia MLL fúzni partneri dvoch proteínových rodín: ENL rodina a AF4 rodina. Proteíny ENL rodiny, ENL a AF9 obsahujú evolučne konzervovanú histón H3–väzobnú doménu na N-konci, transaktivačnú doménu na C-konci a spájajú „MLL-web“ komplex s chromatínovým templátom. Zároveň interagujú s proteínmi druhej rodiny, AF4 a AF5q31. AF5q31 priamo interaguje s komponentami transkripčného aparátu počas elongácie, čo naznačuje hypotézu, že proteínový komplex MLL fúznych partnerov podporuje priebeh transkripčnej elongácie (obr. 3) (24–26).

Aspekty MLL-ENL leukemogenézy

Leukemická konverzia MLL transkripčného faktoru je prvou udalosťou mnohokrokového procesu – „evolúcie“ akútnej leukemogenézy. Účinok MLL-ENL onkoproteínu v leukemogenéze spočíva vo zvýšení kapacity sebaobnovovania krvotvornej kmeňovej bunky (HKB) (abnormálna expanzia HKB) alebo znovu navodením týchto vlastností v determinovaných progenitoroch. Zároveň má MLL-ENL schopnosť zablokovať diferenciáciu krvotvorných buniek. Kombinácia týchto dvoch aspektov je potrebná k vytvoreniu preleukemického štádia, v ktorom sú bunky prístupné akumulácii ďalších mutácií, čo vedie k úplnej leukemickej transformácii a vzniku AL (27, 28). Obrázok 4 znázorňuje hierarchiu onkogénnych zásahov potrebných pre vývin AL.

Bunkové modely s indukovateľným onkogénom MLL-ENL ukázali, že leukemická transformácia indukovaná aktívnym MLL-ENL je reverzibilná. Na udržanie imortalizácie vyžadujú primárne krvotvorné bunky kontinuálnu aktivitu MLL-ENL. Po „vypnutí“ onkogénu strácajú myeloblasty proliferačný potenciál a začnú terminálne diferencovať do neutrofilov a makrofágov (29, 30). Myeloidné bunky imortalizované onkogénom MLL-ENL vykazujú závislosť na rastových faktoroch a zároveň citlivosť na apoptózu. Pôsobením G-CSF došlo k zvratu imortalizácie a indukcii terminálnej diferenciácie myeloidných buniek. To znamená, že MLL-ENL transformuje krvotvorné progenitory zvýšením alebo navodením sebaobnovovania a reverzibilného diferenciačného bloku. Na vytvorenie ireverzibilného diferenciačného bloku vyžaduje MLL-ENL kooperáciu c-myc proto-onkogénu (31).

Transformácia aktívnym MLL-ENL onkoproteínom koreluje so zvýšením expresie Hox génov, ktoré sú pod kontrolou transkripčného faktoru MLL. Po deaktivácii MLL-ENL dochádza k poklesu ich expresie, čo naznačuje, že MLL-ENL priamo udržuje expresiu týchto génov (30). Tieto pozorovania boli ďalej potvrdené „microarray“ analýzou, ktorá odhalila zvýšenú expresiu génov Hoxa9, Hoxa7 a génov Meis-1, Pbx3 (ich produkty podporujú transaktivačnú funkciu Hox proteínov), ktorá korelovala so zastavením diferenciácie vplyvom aktívneho onkoproteínu MLL-ENL. Ďalej sa ukázalo, že Hoxa9 v kooperácii s Meis-1 majú schopnosť nahradiť transformačnú aktivitu MLL-ENL onkogénu, čo poskytuje priamy dôkaz, že koexpresia týchto dvoch molekúl je kľúčovým molekulárnym mechanizmom MLL-ENL leukemogenézy (29).

Abnormálna elongácia ako kľúčový mechanizmus leukémie

MLL je počas krvotvorby exprimovaný na konštantnej úrovni, expresia Hox génov sa mení: na vysokej hladine sú exprimované v skorých štádiách krvotvorby, t.j. v HKB a multipotentných progenitoroch, a ich expresia klesá počas diferenciácie na zrelé krvné bunky (obr. 4).

Ako MLL udržuje expresiu Hox génov v krvotvorných bunkách? MLL z funkčného hľadiska je histón-metyltransferáza, ktorá sa podieľa na „zapisovaní“ histónového kódu na sekvenciách Hox génov špecifickou metyláciou aminokyseliny lyzín v pozícii štyri na molekule histónu H3 (H3K4) (34, 35). MLL ako transkripčný faktor má schopnosť naviazať sa na DNA v preaktivovaných promótorových oblastiach (regulačné sekvencie) Hox génov a posúvaním sa po celom génovom lokuse vkladá metylačný marker na histón H3 (36–38). V dôsledku označenia chromatínu markerom H3K4 dochádza k odpojeniu DNA molekuly od histónových proteínov, a tým sa DNA stáva prístupnou pre väzbu bazálneho transkripčného aparátu, ktorý je fyzicky asociovaný s MLL proteínom. MLL udržuje chromatín v aktívnom stave, a tým umožňuje elongáciu transkripcie (kontinuálnu expresiu) Hox génov počas vývinu krvotvorných buniek aj po niekoľkých bunkových deleniach, kým nedôjde k odpojeniu MLL zo sekvencií Hox génov (obr. 5) (37–39). Potlačením ich expresie krvotvorné progenitory začnú diferencovať na zrelé krvné bunky.

V prípade MLL-ENL onkoproteínu sa ukázalo, že sa viaže na promótory Hox génov v komplexe s normálnym MLL proteínom. V prítomnosti aktívneho MLL-ENL onkoproteínu sa zvyšujú aktivačné markery na chromatíne Hox génov, ktoré spôsobujú abnormálne zmeny v histónovom kóde. Podľa súčasného modelu krvotvorné progenitory konštitutívne udržujú aktívny stav chromatínu na sekvenciách Hox génov v dôsledku chybného čítania histónového kódu a spúšťajú abnormálny transkripčný program – konštitutívnu elongáciu Hox génov (40). Následná nadprodukcia kľúčových molekúl Hoxa9, Meis-1 dáva signál k zablokovaniu terminálnej diferenciácie krvotvorných progenitorov, ktorá sa stáva kritickým krokom v akútnej leukemogenéze (obr. 4).

Reverzibilita leukémie – bunkové a myšie modely budúcej generácie

Na základe súčasného pohľadu, onkogénny transkripčný faktor MLL-ENL konvertuje prechodne aktivované promótory kľúčových Hox génov na konštitutívne aktivované pomocou abnormálnych zmien v epigenetickom kóde, pôvodne vytvorenom normálnym MLL proteínom. To je prvou onkogénnou udalosťou, ktorá sa v bunke odohráva, a spôsobuje zastavenie diferenciácie. Rýchlo proliferujúce preleukemické bunky s vysokou pravdepodobnosťou akumulujú ďalšie genetické a epigenetické zmeny, ktoré vo funkčnej kooperácii vedú k vývinu AL. Avšak molekulárna podstata MLL-ENL leukemogenézy zostáva naďalej v mnohých aspektoch nejasná. Zdá sa, že MLL-ENL nemá schopnosť riadiť a udržiavať všetky aspekty leukemickej transformácie. Doteraz nie je známe, koľko ďalších, po sebe nasledujúcich zásahov je potrebných pre úplnu leukemickú transformáciu a aký je ich biologický vzťah k iniciačnej mutácii MLL-ENL.

Zaujímavou otázkou je, či dochádza k aktivácii obranných bunkových mechanizmov po stimulácii onkogénom MLL-ENL. Táto myšlienka sama o sebe nie je nová. Dávno je známe, že bunka spúšťa dráhy vedúce k zastaveniu bunkového cyklu alebo apoptóze ako odpoveď na onkogénny stres. Avšak v súčasných štúdiách sa ukázalo, že tieto dva základné tumor-supresorové mechanizmy sú aktivované v skorých pre-neoplastických štádiách rakoviny ako tzv. „bariéra“ proti malígnej konverzii (41). Kľúčovým regulátorom týchto mechanizmov je tumor-supresorový proteín p53, ktorý má za úlohu zabrániť genetickej instabilite. Zatiaľ nie je známe, či dochádza k aktivácii rovnakých mechanizmov aj v preleukemických bunkách. Súčasné štúdie odhalili ďalšiu funkciu MLL fúznych proteínov, okrem iných aj MLL-ENL. Tieto onkogény inhibujú transkripčnú aktivitu p53, a tým potláčajú ochrannú odpoveď bunky na poškodenie DNA indukované ionizujúcim žiarením (42). Na modele EK buniek, ktoré sú prirodzene imortalizovanými bunkami s rýchlou proliferačnou aktivitou sa ukázalo, že aktívny onkogén MLL-ENL zvyšuje prežitie buniek po ionizujúcim žiarení (vlastné predbežné výsledky). Na základe týchto faktov je možné sa domnievať, že MLL-ENL môže mať antiapoptický účinok, ktorý spočíva v inhibícii p53, alebo potláčaním bariérových mechanizmov v preleukemickom štádiu urýchľuje progresiu leukemickej transformácie bunky. Myší model s indukovateľným onkogénom MLL-ENL (nepublikovaný vlastný experiment) umožňuje v budúcnosti študovať túto hypotézu in vivo a objasniť dôležité otázky MLL-ENL leukemogenézy. Využitie tohto modelu spočíva hlavne v štúdiu molekulárneho mechanizmu potenciálnej reverzibility leukemickej transformácie in vivo a objasnení kľúčovej otázky, či inaktivácia jedinej (iniciačnej) mutácie je dostačujúca k návratu evolúcie leukémie aj v neskorých štádiách ochorenia, v ktorých dochádza ku kooperácii viac mutácií.

Veľkou výzvou do budúcnosti je odhalenie a pochopenie podrobného mechanizmu transkripčnej deregulácie nielen s onkogénom MLL-ENL, ale aj s ďalšími onkogénnymi variantami MLL, čo je predpokladom potencionálneho vývinu špecifických inhibítorov na cieľenú terapiu MLL leukémií. Štúdium úlohy a funkcie génu MLL v normálnej aj malígnej hematopoéze prispieva k objasneniu základných biologických mechanizmov bunky: regulácie transkripcie, diferenciácie a bunkového rastu.

Zoznam použitých skratiek

ABL = Akútna bifenotypická leukémia

AF4 = Associated factor 4

AF5q31 = Associated factor 5

AF6 = Associated factor 6

AF9 = Associated factor 9

AML = Akútna myeloidná leukémia

AL = Akútna leukémia

ALL = Akútna lymfoblastická leukémia

BCR = Breakpoint cluster region

c-myc = Myelocytomatosis oncogene

C-terminus = Karboxyterminálny koniec proteínu

DNA = Deoxyribonucleic acid

dsDNA = dvojvláknová (double strand) DNA

EK bunky = Embryonálne kmeňové bunky

ENL = Eleven-nineteen leukemia

FISH = Fluorescent in situ hybridization

G-CSF = Granulocytic colony stimulating factor

HKB = Hematopoetická kmeňová bunka

HOK = Hemato-onkologická klinika

Hox = Homeobox

H3K4 = Histón H3 metylovaný na lyzíne 4

LF UP = Lekárska fakulta Univerzity Palackého

Meis-1 = Mouse ecotropic integration site 1

MLL = Mixed lineage leukemia

N-terminus = Aminoterminálny koniec proteínu

Pbx3 = Pre-B-cell leukemia transcription factor 3

Vysvetlivky vybraných termínov

Chromatín – stavebná hmota chromozómov v jadre eukaryotickej bunky a skladá sa z dsDNA a proteínov. Proteíny chromatínu sa delia na históny a proteíny nehistónovej povahy. dsDNA sa otáča okolo histónového jadra a špiralizáciou sa vbalí do vyšších organizačných štruktúr chromatínu. Bunka dokáže regulovať expresiu génov rozbalením a opätovným vbalením príslušného úseku DNA do chromatínu.

Chromatínový marker – znak v podobe chemickej skupiny (napr. metylová), ktorá sa pripája na molekuly histónov kovalentnou chemickou väzbou a spôsobuje zmenu stavu a funkcie chromatínu.

Epigenetika (epigenetická dedičnosť) – prenos znakov a zmien, ktoré ovplyvňujú expresiu a funkciu génov do ďalšej generácie (buniek, organizmu) cez bunkový cyklus mimo genetickej informácie zakódovanej v podobe sekvencie DNA.

Transkripcia – začiatočný proces vyjadrenia genetického kódu, počas ktorého sa genetická informácia prepíše z DNA do RNA a vedie k jej prekladu do funkčných proteínových molekúl.

Elongácia – postupné predĺžovanie RNA reťazca počas transkripcie.

Ďakujeme Mgr. Zuzane Koledovej (Ústav biologie LF UP Olomouc) za asistenciu pri konečnej úpravy rukopisu. Grantová podpora: IGA NR7849; MSM 6198959205 a MSM 6198959216.

Mgr. Sylvia Takáčová

Ústav biologie LF UP

Hněvotínská 3

775 15 Olomouc

Došlo do redakce: 23. 6. 2006

Přijato: 3. 11. 2006