Detekce mutace JAK2^V617F u myeloproliferativních onemocnění – přehled a vlastní zkušenosti

Souhrn

K Ph-negativním chronickým myeloproliferativním onemocněním (CMPO) řadíme pravou polycytemii (PV), esenciální trombocytemii (ET) a primární idiopatickou myelofibrózu (IMF). Diagnostika CMPO je obtížná vzhledem k absenci jednoznačných diagnostických ukazatelů. Objev bodové mutace V617F v genu JAK2 (JAK2^V617F) u velké části pacientů s CMPO znamenal velký pokrok v poznání vzniku onemocnění a uvedená somatická mutace je využívána v současnosti jako významný diagnostický prostředek k vyloučení sekundárních trombocytemií nebo erytrocytóz. V této práci je podán přehled a srovnání některých metod molekulární biologie, které nalezly uplatnění při vyšetření JAK2 genu. Jsou uvedeny rovněž vlastní zkušenosti se stanovením mutace JAK2^V617F metodou alelické diskriminace a se stanovením alelické zátěže pomocí kvantitativní real-time polymerázové řetězové reakce. Stanovení alelické zátěže se může jevit jako přínosné jak pro sledování úspěšnosti chemoterapeutické léčby, tak i pro zkoumání možných korelací s klinickými symptomy či dalšími hematologickými abnormalitami vyskytujícími se u uvedené skupiny pacientů.

Klíčová slova:
JAK2^V617F, myeloproliferativní onemocnění, real-time polymerázová řetězová reakce, alelická diskriminace, alelická zátěž

Úvod

Chronická myeloproliferativní onemocnění (CMPO) představují skupinu hematologických chorob, které jsou charakteristické proliferací jednoho či více klonů myeloidní linie v kostní dřeni a nálezem zvýšeného počtu zralých a nezralých buněk v periferní krvi. Nejčastější molekulární příčinou CMPO jsou mutace genů kódujících tyrozinkinázy, např. fúzní gen BCR-ABL u nejfrekventovanějšího CMPO chronické myeloidní leukemie, charakterizované přítomností tzv. Filadelfského chromozomu (Ph). K Ph-negativním klasickým CMPO řadíme pravou polycytemii (PV), esenciální trombocytemii (ET) a primární idiopatickou myelofibrózu (IMF).

Gen JAK2

U pacientů s Ph-negativním CMPO objevilo nezávisle na sobě v roce 2005 několik výzkumných týmů somatickou mutaci V617F v genu JAK2 kódujícím Janusovu kinázu (1, 2, 3). JAK2 patří do rodiny cytoplazmatických JAK tyrozinkináz, které jsou součástí důležitých buněčných signálních kaskád. Janusovy kinázy byly pojmenovány podle římského boha Januse, boha dvou tváří, neboť obsahují ve své struktuře dvě symetrické, homologní kinázové domény: katalyticky aktivní JH1 doménu a téměř identickou JH2 doménu, která je enzymaticky inertní (4). Všechny čtyři JAK kinázy (JAK1, JAK2, JAK3, TYK2) obsahují sedm JH domén, které jsou rozděleny do čtyř oblastí: kinázové (JH1), pseudokinázové (JH2), FERM (N-koncová JH7, JH6, JH5 a část JH4) a SH2 (JH3 a část JH4). Úkolem pseudokinázové domény je negativně regulovat aktivitu JH1. Funkce FERM oblasti spočívá v interakci s receptorem (5). Gen JAK2 je lokalizován na chromozomu 9p24. Bodová mutace JAK2^V617Fje substitučním nahrazením G ’T na pozici 1849 v exonu 14 genu JAK2, což má za následek záměnu valinu za fenylalanin v kodónu 617. JAK2^V617F postihuje doménu JH2, která tímto ztrácí svou regulační funkci vůči kináze JH1 a důsledkem je konstitutivní aktivace JAK2 kinázy a aktivace JAK-STAT dráhy, která ovlivňuje proliferaci a přežití buňky (6).

Mutace JAK2^V617F detekovatelná téměř u všech případů PV (90–95 %) umožnila charakterizovat PV na molekulární úrovni a usnadnila diagnostiku PV, i když patogeneze choroby zůstává stále ne zcela objasněná. Mutace JAK2^V617F je však identifikována i u významné části pacientů s ET a PMF (40 – 50 %). Zde je významným přínosem k pochopení patologického procesu, ale samotná přítomnost mutace pro potvrzení diagnózy nestačí (7). Současná diagnostická kritéria pro stanovení PV, ET a PMF jsou uvedena v WHO klasifikaci malignit hematopoetického a lymfoidního systému z roku 2008 (8). Klinický význam a role JAK2^V617F ve vzniku a progresi onemocnění se dále intenzivně zkoumá a ukazuje se, že úloha mutace v patogenezi CMPO je komplexnější a nemusí být primárně kauzativní (9, 10, 11). Hledají se např. souvislosti mezi alelickou zátěží JAK2^V617F, prognostickými faktory a fenotypovým projevem onemocnění (stupeň myelofibrózy kostní dřeně, náchylnost k trombotickým stavům) (12). Byla publikována celá řada technik pro genotypizaci JAK2^V617F s velmi odlišnou citlivostí stanovení.

Metody molekulární diagnostiky JAK2^V617F

Jednou z prvních metod detekce JAK2^V617F bylo stanovení polymorfismu délky restrikčních fragmentů u PCR produktů (PCR-RFLP) (2, 13), které je založeno na štěpení normální (wild type, wt) JAK2 alely pomocí restrikční endonukleázy BsaXI. Mutace JAK2^V617F mění specifickou sekvenci restrikčního místa pro BsaXI, restrikční místo není rozeznáno a v tom případě PCR produkt není štěpen. Udávaná citlivost metody je 20 %, v hraničních případech je nutno potvrdit pozitivní nález jinou detekční technikou (14).

Přímé sekvenační techniky využívají PCR produktů amplifikované genomové DNA nebo komplementární DNA, které jsou templátem sekvenační PCR reakce. Různé pracovní skupiny dosahovaly citlivostí v rozmezí 10–30 % mutované alely, u nižších zastoupení mutované alely ve vzorku interferuje pozadí vyvolané normální JAK2 alelou (1, 3, 15). Pyrosekvenace je senzitivní metoda založená na uvolnění a detekci pyrofosfátu v okamžiku zařazení správného nukleotidu v průběhu sekvenační reakce (16, 17). Výhodou metody je prezentace dat v reálném čase a možnost semikvantitativního vyhodnocení. Citlivost metody je 5–10 % mutované alely. Nevýhodou je poměrně vysoká vstupní investice (automatizovaný systém PSQ HS 96, Biotage, Uppsala, Švédsko) i finanční nákladnost vlastní analýzy z hlediska klinické praxe. Jiný přístup k detekci JAK2^V617F využívá denaturační vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (dHPLC) s citlivostí záchytu 1–2 % (18).

Základem mnoha publikovaných prací je alelově specifická polymerázová řetězová reakce (AS-PCR) (2), která používá společný reverzní primer a dvojici forward primerů, jeden specifický pro mutantní alelu a druhý pro normální alelu. Citlivost metody dosahuje kolem 5 %. Variantou AS-PCR je amplifikační refrakční mutační systém (ARMS). Citlivost stanovení touto technikou se udává od 3 do 0,01 % (19, 20). A právě vysoká citlivost dosažená těmito přístupy vedla k přehodnocení četnosti výskytu JAK2^V617F u pacientů s PV. Původní výsledky získané přímou sekvenací uváděly frekvenci JAK2^V617F u PV kolem 70 %, po rozšíření ARMS se tento údaj zvýšil na dnes udávané hodnoty kolem 90–95 %.

Kvantitativní real-time PCR (RQ-PCR) umožňuje amplifikovat cílový úsek DNA a současně detekovat vzniklý PCR produkt pomocí emitovaného fluorescenčního signálu, takže získáváme informaci o vstupním množství specifického templátu v analyzovaném vzorku. Detekční fluorescenční přístupy dělíme na specifické a nespecifické. K nespecifickým patří interkalační barviva (např. SYBR Green I dye), specifické systémy jsou představovány fluorescenčně značenými oligonukleotidovými sondami (např. hydrolyzační nebo hybridizační). TaqMan systém je založen na 5ę’ 3ę exonukleázové aktivitě Taq DNA polymerázy a její schopnosti uvolnit a hydrolyzovat sondu, která při PCR hybridizuje k cílovému úseku DNA. TaqMan sonda je krátký oligonukleotid, který má na jednom konci navázaný R-fluorofor (reporter), jenž excituje záření a na druhém konci Q-fluorofor (quencher – zhášeč), který díky vzájemné krátké vzdálenosti pohlcuje excitovanou energii (tzv. zháší R-fluorofor). Při hydrolýze sondy unikne R-fluorofor z vlivu Q-fluoroforu a následně dochází k emisi záření, které můžeme při vhodné vlnové délce měřit.

Druhý metodický přístup využívá hybridizační sondy ve spojení s termocyklerem LightCycler (LightCycler, Roche Applied Sciences, Indianapolis, USA). Dvě hybridizační sondy, z nichž je jedna značená pouze donorovým fluoroforem a druhá pouze akceptorovým fluoroforem, nasedají v těsné blízkosti vedle sebe (1 bp) a v důsledku této těsné pozice dochází k přenosu fluorescenční energie a k emisi záření, které je detekováno. Publikované citlivosti RQ-PCR metod se pohybují v rozmezí 2,5 až 0,01 % (21, 22, 23, 24, 25).

Vlastní zkušenosti s molekulární diagnostikou JAK2^V617F

Na našem pracovišti používáme pro kvalitativní záchyt metodu alelické diskriminace pomocí real-time PCR založenou na použití dvou sond lišících se v místě bodové mutace V617F (11, 26, 27). Tuto metodu jsme dále modifikovali pro účely kvantitativního stanovení JAK2^V617F.

Materiál a metodika

Separace granulocytů, izolace DNA

Výchozím materiálem bylo 5 ml nesrážlivé periferní krve (EDTA). Krev byla získána po informovaném souhlasu od 1036 pacientů suspektních pro CMPO. V pozici negativních kontrol byly použity odběry od 60 zdravých dobrovolníků. Separací pomocí hustotní gradientové centrifugace (Histopaque 1077/1119, Sigma, GmbH, Německo) byly získány granulocyty, ze kterých byla izolována DNA pomocí komerčního kitu (QIAamp Blood Mini kit, Qiagen, Hilden, Německo) podle výrobcem doporučeného postupu. Koncentrace DNA byla měřena spektrofotometrem ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA).

Kvalitativní stanovení JAK2^V617F metodou alelické diskriminace

Metoda alelické diskriminace je založena na PCR amplifikaci s jedním párem primerů a se dvěma alelově specifickými sondami. Primery přiléhají k oblasti JAK2 genu, ve které je lokalizována potencionální mutace V617F a rozlišení mutované a nemutované alely je prováděno na základě oligonukleotidových sond, lišících se v místě mutace V617F: jedna je komplementární k normální JAK2 alele (R-fluorofor: FAM) a druhá k mutované JAK2^V617F alele (R-fluorofor: HEX). Obě sondy mají na 3ękonci A2 zhášeč (Q-fluorofor) (Exiqon, Vedbaek, Dánsko). Ke zvýšení specifity a citlivosti byly do sond vmezeřeny uzamčené nukleové kyseliny. Jedná se o nukleotidy, jejichž ribózový kruh je ,,uzamčen” methylenovým můstkem mezi atomy 2ę-O a 4ę-C (Locked Nucleic Acid, LNA).

Vstupní množství genomové DNA do PCR analýzy bylo 100 ng. Celkový objem reakční směsi byl 20 μl: obsahoval 2 μl 10 x PCR Buffer (Abgene Limited, Epsom, Velká Británie), 3,2 μl MgCl₂ (25 mM), 0,4 μl dNTPs (každý 10 mM), 1 μl forward a reverse primerů (každý 25 μM), 0,4 μl FAM-sondy a 0,4 μl HEX-sondy (každá 10 μM) a 0,2 μl ThermoStart DNA polymerázy 5 U/μl (Abgene Limited, Epsom, Velká Británie).

Sekvence použitých primerů a sond:

JAK2-RQ-F: (5ę- gaagcagcaagtatgatgagcaa - 3ę),

JAK2-RQ-R: (5ę- actgacacctagctgtgatcc - 3ę),

sonda JAK2^wt: (5ę- FAM - tcCacAgaCaCatAc - A2 - 3ę),

sonda JAK2^V617F: (5ę- HEX - ctcCacAgaAacAtaCtc - A2 - 3ę).

Kapitálky označují LNA nukleotidy.

Teplotní profil

Analýza byla provedena na cykleru RotorGene 3000 (Corbett Research, Mortlake, Austrálie). Signál z JAK2^wt sondy byl snímán na kanále pro fluorofor FAM, signál z JAK2^V617F sondy na kanále pro fluorofor HEX/JOE. Teplotní profil a časy: 8 min. při 95 °C, následně 55 cyklů denaturace 20 s při 95 °C a annealing/extenze 1 min. při 63 °C. Vyhodnocení bylo provedeno softwarem pro analýzu alelické diskriminace, který je součástí daného cykleru. Před každým měřením byla provedena autokalibrace při 63 °C.

Kvantitativní stanovení JAK2^V617Fmetodou real-time PCR

Pro kvantitativní stanovení alelické zátěže JAK2^V617F byla použita metoda absolutní kvantifikace pomocí dvou standardních křivek u souboru 60 pacientů nesoucích mutaci JAK2^V617F. Standardní křivky byly vytvořeny amplifikací desítkového ředění dvou plazmidových DNA obsahujících sekvenci mutované alely JAK2^V617F a normální alely JAK2^wto známém počtu kopií v rozsahu 6 log (10⁶ až 10 kopií na reakci). Vstupní množství genomové DNA do PCR analýzy je stejné, jako v případě analýzy alelickou diskriminací (100 ng), stejná je i sekvence a výsledná koncentrace oligonukleotidových primerů a obou LNA sond v reakci. DNA je amplifikována ve výsledném reakčním objemu 25 μl ve směsi ABsolute™ QPCR Mix (Abgene Limited, Epsom, Velká Británie). Teplotní profil reakce se opakuje v 50 cyklech: 95 ľC/15 s, 63 ľC/90 s a následuje po úvodní prodloužené denaturaci 95 ľC/15 min.

Počet kopií mutované a normální alely ve vyšetřovaném materiálu je odečítán ze standardních křivek, výsledek je vyjádřen jako procentuální zastoupení mutované alely JAK2^V617F v celkovém počtu JAK2 alel podle vzorce JAK2^V617F (%) = (počet kopií JAK2^V617F/ počet kopií JAK2^V617F + počet kopií JAK2^wt)*100.

Výsledky

Výsledky genotypizace JAK2 pomocí alelické diskriminace měly tři možné výstupy. Pacient s normálním JAK2 genem vykazoval pouze signál z FAM – sondy (JAK2^wt), ve druhém případě byl zaznamenán signál z obou sond anebo byl ve třetím případě detekován pouze signál z HEX – sondy (JAK2^V617F) (obr. 1 A, B, C). Proměřením 60 kontrolních vzorků DNA JAK2^V617F negativních zdravých osob byl stanoven diskriminační threshold na hodnotu 0,05 pro eliminaci velmi nízkého fluorescenčního signálu, který se může objevit jako důsledek nespecifické vazby sondy JAK2^V617Fk normální alele. Citlivost metody byla testována na plazmidech obsahujících JAK2 normální a JAK2^V617F alelu, které byly vzájemně naředěny v poměrech 5 %, 2 %, 1 %, 0,5 % zastoupení mutované alely. Mez detekce byla 1 % JAK2^V617F alely, za mez stanovitelnosti byla zvolena detekce 2 % JAK2^V617F alely. Sekvence obou plazmidů byla potvrzena kontrolní sekvenační analýzou. Reprodukovatelnost uvnitř stanovení (intra-assay) byla určena otestováním skupiny vzorků s různou hladinou mutace ve čtyřech paralelních reakcích (koeficient variability 1,9 %). Reprodukovatelnost mezi stanoveními (inter-assay) byla zjištěna otestováním 3 vzorků s různou alelickou zátěží JAK2^V617F z 10 různých běhů (koeficient variability 2 %).