Analýza vztahu výsledků cytogenetického vyšetření k poměru volných lehkých řetězců κ/λ (FLC-r, Freelite^TM), páru těžkých/lehkých řetězců imunoglobulinu (HLC-r, Hevylite^TM ) a vybraných prognostických faktorů vyšetřených při diagnóze mnohočetného myelomu

Súhrn

Úvod:
Vyšetření hladin volných lehkých řetězců κ/λ(FLC-κ/λ) a nověji i páru těžkých/lehkých řetězců imunoglobulinu (HLC) rozšířilo tradiční algoritmus laboratorních testů u mnohočetného myelomu (MM). Cílem studie bylo zhodnocení vztahu zavedených prognostických faktorů MM, standardního poměru FLC-κ/λ (sFLC-r), modifikovaného poměru, tj. „involved/uninvolved“ FLC (mFLC-r), rozdílu „involved – uninvolved“ FLC (FLC-dif), standardního poměru HLC-κ/λ(sHLC-r), modifikovaného poměru HLC, tj. poměru „involved/uninvolved” HLC (mHLC-r) a rozdílu „involved – uninvolved“ HLC (HLC -dif.) k výsledkům cytogenetického vyšetření při diagnóze MM.

Soubor a metody:
V sestavě 97 nemocných s MM byly vyšetřeny metodou Freelite^TM hladiny FLC a vypočteny indexy ^sFLC-r, ^mFLC-r a FLC-dif metodou HevyliteTM byly stanoveny hladiny párů HLC a vypočteny indexy ^sHLC-r, ^mHLC-r a HLC-dif. Cytogenetické vyšetření myelomových plazmocytů bylo provedeno pomocí fluorescenční in situ hybridizace s imunofluorescenčním značením plazmatických buněk (metoda FICTION, “Fluorescence Immunophenotyping and Interphase Cytogenetics as a Tool for the Investigation of Neoplasms“).

Výsledky:
Byl prokázán významný vztah komplexních změn, del(13)(q14) a zmnožení chromozomové oblasti 1q21 k tíži poklesu Hb < 100 g/l, del(13)(q14) k trombocytopenii <150 x 10⁹/l a zvýšeným hodnotám kreatininu, v případě translokace t(14;16)(q32;q23) rovněž i k β₂-mikroglobulinu (β₂-M) > 5,5 mg/l, del(17)(p13) (TP53) k zvýšeným hodnotám β₂-M a trizomie chromozomů 15 a 17 k výskytu monoklonálního imunoglobulinu (MIg) > 25 g/l. Hodnoty indexu ^sFLC-r byly signifikantně vyšší pouze v případě průkazu del(13)(q14), avšak při vyčlenění souboru s hodnotami indexu ^sFLC-r < 0,01 a > 100 se vynořil navíc signifikatní vztah k del(17)(p13) a k nálezu komplexních změn. Přítomnost zmnožení oblasti 1q21, del(17)(p13), komplexních změn a trizomie 17 se vyznačovala významně vyšší hodnotou ^mFLC-r a v případě vyčlenění souboru nemocných s cut-off ≥ 79,6 s průkazem del(13)(q14), zmnožením v oblasti 1q21 a s nálezem komplexních změn. V souboru s hodnotou FLC-dif s cut-off ≥ 185 byly významně častější del(13)(q14), del(17)(p13) a komplexní změny karyotypu. Vztah mezi ^sHLC-r a ostatními vyšetřenými cytogenetickými markery vyzněl až na statisticky významný vztah k t(4;14)(p16;q32) nesignifikantně. Originálním zjištěním je průkaz významně zvýšených hodnot indexu ^mHLC-r v případě zmnožení oblasti 1q21, komplexních změn karyotypu a trizomie chromozomu 17, ale i translokace t(4;14)(p16;q32) potvrzené souhlasným výsledkem analýzy HLC-dif. V souboru s hodnotou cut-off ^mHLC-r ≥ 31,6. Významně vyšší koncentrace MIg v séru byla zjištěna pouze v případě trizomie chromozomu 15.

Závěr:
Studie prokázala statisticky významný vztah cytogenetických změn typu „high risk“, tj. t(14;16)(q32;q23), del(13)(q14), del(17)(p13), zmnožení oblasti 1q21 a komplexních změn k zavedeným standardním prognostickým faktorům vyznačujících se vztahem k rozsahu a biologickým vlastnostem MM. Příspěvkem k hlubšímu pochopení patobiologie MM je průkaz významného vztahu ^mFLC-r k del(13)(q14), zmnožení oblasti 1q21 a k del(17)(p13), zejména ale originální nález signifikantního vztahu ^mHLC-r, částečně i HLC-dif k prognosticky rizikovým aberacím t(4;14)(p16;q32), zmnožení oblasti 1q21 a komplexním změnám karyotypu.

Klíčová slova:
mnohočetný myelom – prognostické faktory – volné lehké řetězce imunoglobulinu – pár těžkých/lehkých řetězců imunoglobulinu – fluorescenční in situ hybridizace

ÚVOD

Mnohočetný myelom (MM) je značně heterogenní onemocnění podmíněné nekontrolovanou proliferací a akumulací neoplastických elementů plazmocelulární linie, vyznačující se značnou genetickou nestabilitou a přítomností komplexních genetických změn charakteru chromozomových translokací, delecí, duplikací a genetických mutací, uplatňujících se nejen v patogenezi, ale i v proměnlivosti klinického obrazu, léčebné odezvy a prognózy [1–6]. Genetická různorodost MM se projevuje chromozomovými změnami provázenými zmnožením genetického materiálu formou trizomií, vedoucí k hyperploidii (50–60 % změn) provázené obvykle příznivou prognózou a strukturními chromozomovými změnami označovanými jako “nonhyperploidní změny” (40–50 %), představující především přestavby genu pro těžký řetězec imunoglobulinu (IgH) s různými onkogeny umístěnými v zlomových oblastech chromozomů 4, 16 nebo 20 jako výsledek reciprokých translokací t(11;14)(q13;q32), t(4;14)(p16;q32), t(14;16)(q32;q23), t(14;20)(q32;q12) (7-9). Tyto translokace spolu s aberacemi typu delecí krátkých ramen chromozomu 17 del(17)(p13) zahrnující ztrátu genu TP53, zmnožení genetického materiálu dlouhých ramen chromozomu 1, ale i monozomií chromozomu 13 či intersticiální delecí 13q14 zahrnující Rb1 gen, jsou nejvýznamnějšími markery rizikové formy MM a zkráceného celkového přežívání (OS) [2, 3, 8, 10, 11]. MM není jednolitým onemocněním, ale skupinou cytogeneticky, genotypicky a klinicky odlišných podtypů nemoci [10]. Podstatné zlepšení prognózy s bezmála dvojnásobným prodloužením délky OS je výsledkem hlubšího poznání patogeneze myelomu a stále sofistikovanějších vyšetřovacích a především léčebných metod. Tradiční oporou diagnostiky, monitorování průběhu a hodnocení výsledků léčby je vyšetření izotypu a koncentrace monoklonálního imunoglobulinu (MIg) standardní (SPE) a imunofixační (IFE) elektroforézou séra, normálních imunoglobulinů pomocí nefelometrie a hladin volných lehkých řetězců imunoglobulinu (FLC) včetně jejich poměru κ/λ (FLC-r) pomocí Freelite^TM techniky [12, 13]. Nízkou senzitivitu a nespolehlivost SPE u oligosekreční a IgA formy MM, zkreslující vliv výkyvů hematokritu a objemu plazmy [14] i odlišný katabolismus jednotlivých tříd MIg [15] potlačila turbidimetrická technika Hevylite^TM, umožňující přesné separátní stanovení hladin párů těžkých/lehkých řetězců Ig (HLC-κ a HLC- λ) v séru, tj. „involved“ -HLC (i-HLC, MIg vytvářený myelomovými buňkami) a „uninvolved“ -HLC (u-HLC, normální Ig stejného izotypu produkovaný normálními plazmocyty) s výpočtem jejich vzájemného poměru (HLC-r) a nově i jejich vzájemné diference (HLC-dif) [16–20]. Vyšetření HLC-r se osvědčilo při monitorování výsledku léčby zejména u hyposekreční formy MM, a to včetně hodnocení minimální reziduální nemoci [13, 21].

Vzhledem k tomu, že vztah mezi výsledky cytogenetické analýzy a ukazateli sekrece Ig normálních a myelomových plazmocytů, tj. indexů FLC-r a FLC-dif, zejména ale HLC-r a HLC-dif nebyl doposud analyzován a pouze v omezené míře hodnocen vztah k standardním prognostickým faktorům MM [22, 23], zaměřila se předložená analýza na tuto problematiku. Náplní studie bylo rovněž ověření pracovní hypotézy, že hodnoty indexu FLC-r, HLC-r a rozdílu jejich hodnot (FLC-dif a HLC-dif) by se měly v případě přítomnosti vs. nepřítomnosti chromozomových změn podstatně lišit. Případný pozitivní výsledek šetření by mohl vést k obohacení dosavadních znalostí molekulárně-cytogenetické patogeneze MM a vztahu cytogenetických markerů k standardním laboratorním ukazatelům s potenciální možností využití v klinické praxi.

SOUBOR NEMOCNÝCH A METODY

Studie vychází z analýzy 97členného souboru s IgG (73,2 %) a IgA typem MM (26,8 %) vyšetřeného při rozpoznání nemoci, splňující diagnostická kritéria International Myeloma Working Group (IMWG) – tabulka 1 [24, 25].

K cytogenetické analýze byla použita metoda fluorescenční in situ hybridizace (FISH) s imunofluorescenčním značením plazmatických buněk (metoda FICTION, tj. „Fluorescence Immunophenotyping and Interphase Cytogenetics as a Tool for the Investigation of Neoplasms“). Buněčná suspenze kostní dřeně zpracovaná pro klasické cytogenetické vyšetření z 24hodinové kultivace buněk bez stimulace a fixována v metanoloctové kyselině (3 : 1), byla převedena do fixace s 96% etanolem. Etanolem fixovaná suspenze byla nakapána na skla, obarvena pomocí protilátky proti lehkým řetězcům MIg (anti-human kappa nebo lambda chain) konjugované s 7-amino-4-metalkumarin-3-octovou kyselinou (AMCA) (Vector Laboratories Burlingame, CA). Fluorescenční signál byl zesílen protilátkou (anti-goat) konjugovanou s AMCA (Vector Laboratories Burlingame, CA) pro snadnější identifikaci populace klonálních plazmatických buněk [26]. Pro metodu FICTION byl použit panel komerčně dodávaných sond pro určení delece a zmnožení v oblasti 1p/1q, del(13)(q14), del(17)(p13), přestavby genu IgH a jeho nejčastější translokace (sondy XL 1p32/1q21, LSI RB1(13q14), LSI TP53/CEP17, LSI IGH/CCND1 Dual Color Dual fusion, IGH/FGFR3 Dual Color Dual Fusion, LSI IGH/MAF Dual Color Dual Fusion, XL t(6;14), XL t(14;16), XL IGH plus) (Abbott Molecular, Des Plaines, IL, USA; Dako, Glostrup, Denmark; Kreatech, Amsterdam, The Netherlands; MetaSystems, Altlusheim, Germany). K určení nejčastějších početních změn chromozomů byly použity centromerické sondy pro chromozomy 15 a 17 (Abbott Molecular). Hybridizace byla provedena podle návodu výrobce sondy. Výsledek hybridizace byl hodnocen pomocí fluorescenčního mikroskopu a programu ISIS (MetaSystems). Hodnoceno bylo 100 plazmatických buněk; hodnota cut-off pro genové sondy byla 10 %, pro centromerické sondy 20 %. Komplexní změny byly hodnoceny jako nález ≥ 3 změn v karyotypu nebo určené metodou FICTION.

Séra zmražená na -78 °C byla deponovaná v biobance Oddělení klinické biochemie a Hemato-onkologické kliniky FN v Olomouci, koncentrace MIg byla vyšetřena SPE přístrojem Sebia Hydrasy pomocí skeneru Epson 1680, IFE soupravou Hydragel 4 IF. Hladiny FLC byly vyšetřeny soupravami Freelite SPA Plus κ free (rozmezí 3,3–19,4 mg/l) a Freelite SPA Plus λ free (5,7–26,3 mg/l) s výpočtem indexu FLC-r, tj. poměru FLC-κ/ FLC-λ (0,26 až 1,65) [1, 3, 6]. Koncentrace HLC v séru byla vyšetřena turbidimetrem SPA Plus (The Binding Site) soupravami Hevylite Human: IgG-κ (3,84–12,07 g/l), IgG-λ (1,91–6,74 g/l), index IgG HLC-r z poměru IgG-κ/IgG-λ (1,12–3,21); hodnoty IgA-κ (0,57–2,08 g/l), IgA-λ (0,44–2,04 g/l), index IgA HLC-r z poměru IgA-κ/IgA-λ (0,78–1,94) [13, 16]. Na rozdíl od standardních kritérií, založených stabilně na výpočtu indexů FLC-r (^sFLC-r) a HLC-r (^sHLC-r) z poměru FLC-κ/FLC-λ, respektive HLC-κ /HLC-λ, vedoucí u nemocných s lehkým řetězcem λ k získání nízkých obtížně interpretovatelných hodnot, byl použit pro výpočet „modifikovaných“ indexů ^mFLC-r a ^mHLC-r (vždy poměr i-FLC/u-FLC nebo i-HLC/u-HLC) tj. hodnota „involved“ typu použitá v čitateli zlomku (např. v případě i-HLC-λ poměr i-HLC-λ/u-HLC-κ). Jde o analogii principu, použitého v případě FLC-r v některých předchozích studiích [22, 27, 28, 29] a zejména recentních IMWG (International Myeloma Working Group) revidovaných diagnostických kritériích MM (biomarker malignity FLC-r = i-FLC/u-FLC ≥ 100) [29, 30]. Výpočet rozdílu hodnot FLC (FLC-dif) a HLC (HLC-dif) byl proveden prostým odečtem hodnoty „uninvolved“ od hodnoty „involved“ FLC a HLC (20). Hodnoty β₂-mikroglobulinu (β₂-M) byly vyšetřeny metodou ELISA (< 2,3 mg/l), hodnoty hemoglobinu (Hb), trombocytů, albuminu, kreatininu a laktátdehydrogenázy (LDH) standardními postupy. Ke stratifikaci MM byl použit stážovací systém podle Durieho-Salmona (D-S), International Staging System (ISS) [24, 25, 31]. Zařazení do studie bylo vázáno na podpis informovaného souhlasu, design studie byl schválen etickou komisí FN v Olomouci.

Získaná data byla analyzována pomocí statistického software IBM SPSS Statistics 22, normalita dat byla posouzena pomocí Shapiro-Wilkova testu. Ke statistické analýze byly použity testy podle Pearsona, Kruskala-Wallise, U-test podle Manna-Whitneye a Fischerův přesný test s Bonferroniho korekcí signifikance. Všechny testy byly prováděny na hladině významnosti p < 0,05.

VÝSLEDKY

Vztah výsledků chromozomové analýzy  k prognostickým faktorům

Výsledky vyšetření základních klinicko-laboratorních charakteristik v sestavě 97 nemocných při diagnóze MM jsou uvedeny v tabulce 1. Výskyt abnormálních cytogenetických ukazatelů, vyšetřených metodou FICTION je shrnut v tabulce 2. Cytogenetické změny byly zjištěny v 90,7 %, velmi častý byl nález komplexních změn (64,9 %), del(13)(q14) (50,5 %), trizomie chromozomu 15 (55,6 %) a zmnožení oblasti chromozomu 1q21 (46,4 %). Komplexní změny karyotypu se vyznačovaly významně nižšími hodnotami Hb, což potvrdil signifikantně vyšší výskyt komplexních změn v souboru s Hb < 100 g/l. V případě translokace t(14;16)(q32;q23) byla významně častější trombocytopenie (< 150 x 10⁹/l) a zvýšený kreatinin (> 104 (μmol/l) i β₂-M (> 5,5 mg/l) – tabulka 3. Trizomie chromozomů 15 a 17 se vyznačovala významně vyšším zastoupením nemocných s MIg > 25 g/l, zatímco přítomnost del(13)(q14) se vyskytovala významně častěji u nemocných s Hb < 100 g/l a trombocytopenií < 150 x 10⁹/l. Del(17)(p13) zahrnující gen TP53 byla významně častěji provázena vysokou hodnotou β₂-M, zatímco zmnožení oblasti chromozomu 1q21 se vyznačovalo vysoce významným vztahem k nízkým hodnotám Hb, včetně nemocných s Hb < 100 g/l. V případě hodnocení vztahu IgH přestavby typu translokace t(11;14)(q13;q32) a t(4;14)(p16;q32) k standardním PF MM, tj. Hb, albuminu, kreatininu, β₂-M a LDH, nebyl zjištěn statisticky významný vzájemný vztah (viz tab. 3).

Analýza vztahu cytogenetických změn a FLC-r

S výjimkou významně vyšších hodnot standardního indexu ^sFLC-r v případě del(13)(q14) nebyl zjištěn vztah k ostatním analyzovaným cytogenetickým změnám (tab. 4). Kromě statisticky významného vztahu del(13)(q14) (p = 0,025), del(17)(p13) (p = 0,025) a komplexních změn karyotypu (p = 0,008) k podsouboru s vysoce abnormálním indexem ^sFLC-r (cut-off < 0,01 a > 100) [29, 32] vyzněla analýza vztahu ^sFLC-r k přestavbě IgH, trizomii 15 a 17 i zmnožení oblasti chromozomu 1q21 nevýznamně. V případě modifikovaného indexu ^mFLC-r byly prokázány s výjimkou IgH přestavby a trizomie 15 významně vyšší hodnoty v rámci změn del(13)(q14), trizomie 17, zmnožení oblasti 1q21, del(17)(p13) a nálezu komplexních změn (viz tab. 4). Významně častější výskyt del(13)(q14) byl zjištěn i v podsouboru s hodnotou indexu ^mFLC-r >100 [podle 29] (p = 0,025).

Analýza vztahu cytogenetických změn a HLC-r

S výjimkou t(4;14)(p16;q32) (p = 0,031), provázené signifikantně a bezmála 10krát vyššími hodnotami standardního indexu ^sHLC-r, nebyl prokázán významný vztah k ostatním analyzovaným chromozomovým změnám, a to ani v případě hlubší analýzy podsouborů s nízce (0,022 a < 45) vs. vysoce abnormálními hodnotami (< 0,022 a > 45) rozčleněnými podle Ludwiga [33]. V případě modifikovaného indexu ^mHLC-r byly zjištěny významně vyšší hodnoty pouze v případě přítomnosti trizomie 17, zmnožení oblasti 1q21 a nálezu komplexních změn. Cílená analýza zaměřená na aberace chromozomu 14 prokázala významně vyšší hodnoty ^mHLC-r u nemocných s přítomností translokace t(4;14)(p16;q32)(p = 0,047), nikoliv ale t(11;14)(q13;q32) a t(14;16)(q32;q23). S výjimkou trizomie 15, vyznačující se signifikantně vyššími hodnotami koncentrace MIg nebyla zjištěna v případě ostatních analyzovaných cytogenetických změn statisticky významná souvislost (viz tab. 4).

Výsledky hlubší analýzy zaměřené na analýzu podsouborů s vysokými vs. nízkými hodnotami ^mFLC-r nebo ^mHLC-r jsou shrnuty v tabulce 5. V podsouboru ^mFLC-r s hodnotami ≥ 79,6 (medián souboru) byl zjištěn významně vyšší výskyt del(13)(q14), zmnožení oblasti 1q21 a nález komplexních změn. Tento nález byl potvrzen i analýzou souborů s použitím cut-off ≥ 277, použitý s úspěchem v předchozí studii [22] (viz tab. 5). V případě FLC-dif byl při použití cut-off ≥ 185 zaznamenán významný vztah k del(13)(q14), komplexním změnám karyotypu a del(17)(p13). Analýza věnovaná modifikovanému indexu ^mHLC-r prokázala v podsouboru s hodnotou ≥ 89,2 (medián souboru) signifikantně častější výskyt pouze zmnožení oblasti 1q21 a nález komplexních změn, v případě cut-off ≥ 94,5, zvoleného na podkladě doporučení naší předchozí studie [28] byl zjištěn významný vztah k zmnožení oblasti 1q21 (p = 0,002) a navíc i k přítomnosti komplexních změn karyotypu (p = 0,031). Samostatná analýza vyčleněného podsouboru třídy IgG zachytila v případě hodnot ≥ 94,5 vedle významně častějšího zmnožení oblasti 1q21 (p = 0,013) i častější nález trizomie chromozomu 17 (p = 0,029), analýza nemocných s izotypem IgA vyzněla nepříznačně. V případě analýzy podsouborů rozdělených podle hodnoty mediánu HLC-dif v našem souboru (cut-off ≥ 31,6) byl zjištěn významný vztah pouze k výskytu translokace t(4;14)(p16;q32) a zmnožení oblasti 1q21 (viz tab. 5).

DISKUSE

MM je plazmocelulární neoplazie s komplexní, neúplně vyřešenou molekulární patogenezí a se složitou subklonální strukturou. V důsledku klinicko-laboratorní, genetické, molekulárně-biologické a intraklonální různorodosti MM se většina recentních studií zaměřila s použitím vysoce sofistikovaných molekulárně-genetických metod na odhalení biologické podstaty nemoci [34, 35]. Hlubší poznání vnitřních biologických vlastností myelomových buněk a jejich vztahu k mikroprostředí kostní dřeně, ale i ke standardním klinicko-laboratorním ukazatelům vedlo k sestavení nových stratifikačních systémů založených na metodě iFISH, tj. mSMART (Mayo Stratification of Myeloma and Risk-Adapted Therapy) [36] a R-ISS (Revised International Staging System) [37] jako východiska specificky orientované terapie [7, 11, 36, 37]. V 97členném souboru MM vyšetřeném při diagnóze metodou FICTION byl zaznamenán obdobný výskyt chromozomových aberací jako v předchozích studiích, tj. v analýze Aveta-Loiseaua [38] a Kumara [7, 11], v našem souboru bylo ale nižší zastoupení t(11;14)(q13;q32) a poněkud vyšší výskyt t(4;14)(p16;q32) – viz tab. 2.

Vztah výsledků chromozomové analýzy  k prognostickým faktorům

V souladu s dosavadními prameny byly v naší studii zjištěny cytogenetické změny u naprosté většiny (90,7 %) nemocných [11, 38]. V předchozích studiích byl zjištěn vztah abnormálního karyotypu k standardním prognostickým faktorům se vztahem k  náloži myelomové tkáně (viz tab. 3). U nemocných s přítomností komplexních změn jsme v souladu s předchozí analýzou zaznamenali pouze signifikantní vztah k tíži anémie, nikoliv k albuminu, β₂-M, kreatininu Ca a LDH, zatímco  předchozí studie popsala vedle vztahu k poklesu Hb rovněž významný vztah k trombocytopenii, zvýšeným hodnotám β₂-M a počtu plazmocytů v kostní dřeni [22]. Přes poměrně širokou škálu parametrů, u nichž byl v předchozích studiích popsán vztah k přítomnosti prognosticky „inertní“ translokace t(11;14)(q13;q32) – viz tab. 3, včetně výskytu lymfoplazmocytové morfologie myelomových buněk u 20 % nemocných, přítomnosti hyposekrečního a/nebo B-J typu MM, vyzněla naše studie, a to pravděpodobně i v důsledku pouze 11,3% zastoupení nepříznačně [1, 4, 11, 22, 38, 50]. Rovněž u primární, pro MM specifické a prognosticky poměrně nepříznivé translokace t(4;14)(p16;q32) jsme na rozdíl od předchozích autorů nezaznamenali žádný vztah k analyzovaným standardním prognostickým faktorům (viz tab. 3) [2, 39]. V předchozích studiích byl zaznamenán významný vztah t(4;14)(p16;q32) k tak prognosticky významným parametrům, jakými jsou β₂-M, množství plazmocytů v kostní dřeni a IgA izotyp MM [1, 2, 40]. U poměrně vzácné t(14;16)(q32;q23), spojované s výskytem plazmocelulární leukemie a nepříznivou prognózou jsme zaznamenali významný vztah k trombocytopenii, k vzestupu kreatininu a v souladu s Avetem - Loiseauem i k vyšším hodnotám β₂-M (viz tab. 3)

[1, 41]. Trizomie chromozomu 15 a 17 byla v naší studii provázena význačně zvýšenou koncentrací MIg > 25 g/l, což nebylo doposud popsáno a pro což nemáme doposud věrohodné vysvětlení. Del(13)(q14) měla v našem souboru vztah k anémii a trombocytopenii, zatímco v předchozích studiích navíc k množství plazmocytů v kostní dřeni a zvýšeným hodnotám β₂-M i LDH (viz tab. 3) [22, 42, 43]. Je známo, že zejména kompletní, ale i parciální delece chromozomu 13, případně translokace 13q zjištěná pomocí konvenční chromozomové analýzy se vyznačuje nepříznivou prognózou, zatímco v případě identifikace pomocí iFISH jsou nižší léčebná odezva a kratší OS vázány na současný výskyt t(4;14)(p16;q32) a del(17)(p13) [2, 42]. U nemocných s přítomností del(17)(p13) s delecí TP53, tj. aberace s narůstajícím výskytem v průběhu MM a spojené v důsledku ztráty řady genů a mutace TP53 s chemorezistencí a nepříznivou prognózou, jsme zaznamenali na rozdíl od jiných autorů pouze vztah k vyšším hodnotám β₂-M (viz tab. 3) [1, 2, 22, 44]. Bylo zjištěno, že v případě t(4;14)(p16;q32), t(14;16)(q32;q23), t(14;20)(q32;q12) a del(17)(p13) dochází zčásti ke snížení negativního prognostického náboje v případě současné trizomie [11, 45]. Dosti frekventní aberace typu zmnožení oblasti 1q21 byla na rozdíl od jiných autorů, prokazujících vztah k mnoha negativním prognostickým faktorům (β₂-M, hyperkalcemie, vysoká BJ-urie, infiltrace kostní dřeně myelomovými plazmocyty, IgA izotyp) v naší i v dalších analýzách vysoce významně sdružena s výskytem anémie (viz tab. 3) [22, 23]. Popsaný vztah mezi Hb a zmnožením oblasti 1q21 odpovídá zjištění, že alterace transkripční regulace genů lokalizovaných na chromozomu 1q přispívá k progresi nemoci a krátké délce života, tedy často k průběhu MM s již prvotně nízkou hodnotou Hb [8]. Bylo odhaleno, že další oblast chromozomu 1, tj. oblast 1p36 je často deletovaná, a tato deletovaná oblast nese nádorový supresor, gen p73 s úzkým vztahem k p53 [46]. Výskyt amplifikace chromozomu 1q narůstá s pokročilostí MM a zejména ve spojení s del(13)(q14), jde o nezávislý nepříznivý prognostický faktor s krátkým PFS a OS [47, 48, 49]. Z předložených výsledků vyplývá, že chromozomové aberace měly převážně vztah k významným prognostickým faktorům MM se vztahem k rozsahu a biologickým vlastnostem nádorové tkáně, tj. k hodnotám Hb, trombocytů, β₂-M a k zastoupení plazmocytů v kostní dřeni, zatímco asociace s jinými laboratorními ukazateli byla dosti proměnlivá. Za přínos pro klinickou praxi lze považovat mj. spojení trombocytopenie s abnormálním karyotypem [22], nižší hodnoty albuminu i MIg a vysoký výskyt lymfoplazmocytového typu MM u t(11;14)(q13;q32) (22, 50, 51), častější zastoupení IgA izotypu MM v případě t(4;14)(p16;q32) [1, 52], zvýšené hodnoty LDH v případě del(13)(q14) (43) aj. (viz tab. 3).

Analýza vztahu cytogenetických změn k FLC-r

Z analýzy vyplynulo, že hodnoty standardního indexu monoklonality, tj.^sFLC-r byly statisticky významně zvýšeny pouze u nemocných s aberací del(13)(q14). Hlubší analýza věnovaná podsouborům s vysokým vs. nízkým indexem ^sFLC-r (cut-off < 0,01 a > 100) [29, 32] potvrdila vedle relace k del(13)(q14) taktéž signifikantní vztah k del(17)(p13) (TP53) a komplexním změnám karyotypu. Zjištěné vztahy dokládají závislost výše indexu ^sFLC-r k těmto karyotypovým aspektům patobiologie MM. Analýza modifikovaného indexu ^mFLC-r odhalila s výjimkou přestavby IgH a trizomie chromozomu 15 významně vyšší hodnoty v případě del(13)(q14), trizomie 17, zmnožení oblasti 1q21, del(17)(p13) a komplexních změn karyotypu. Delece 13q14 se významně častěji vyskytovala u nemocných s indexem ^mFLC-r > 100. Popsané vztahy neodkrývají pouze vztah mezi sekrečním nábojem myelomového klonu v produkci monoklonálního/„involved“ FLC vs. snížení výskytu a suprese funkce normálních plazmocytů projevující se snížením tvorby normálních/„uninvolved“ FLC k široké škále primárních a sekundárních karyotypových změn, ale i předností modifikovaného indexu ^mFLC-r před formou standardní (^sFLC-r). Naše pozorování, že hodnoty indexu ^sFLC-r a ^mFLC-r se v případě přestavby IgH lišily pouze nevýznamně, neodpovídá předchozím zkušenostem, kdy nemocní s „high-risk“ IgH translokacemi, zejména t(14;16)(q32;q23), měli významně vyšší medián hodnot FLC a FLC-r [10, 45]. Současný výskyt t(14;16)(q32;q23) a renální insuficience vedly na rozdíl od samotné translokace bez renální insuficience ke zkrácení OS, takže negativní vztah t(14;16)(q32;q23) k prognóze je zřejmě podmíněn vyšší prevalencí renální insuficience nežli biologickou agresivitou choroby [10]. Klinický přínos iFISH analýzy umocňuje zjištění, že nebyla nalezena významná rozdílnost mezi hodnotami FLC a FLC-r při diagnóze a v relapsu MM v případě „high-risk“ IgH translokací charakteru t(4;14)(p16;q32), t(14;16)(q32;q23) a t(14;20)(q32;q12) oproti nemocným bez jejich průkazu [35]. Naše, obdobně jako některé předchozí studie osvědčila dobrou zkušenost s výpočtem modifikovaného indexu ^mFLC-r z poměru „involved/uninvolved“ FLC [22, 27, 29, 30]. V poměrně přínosném světle se rovněž jevilo použití výpočtu indexu FLC-dif, neboť při analýze vztahu cytogenetických změn k podskupinám s nízkou vs. vysokou hodnotou FLC-dif byl ve skupině s cut-off ≥ 185 vyjádřen statisticky významný vztah k přítomnosti del(13)(q14), del(17)(p13) a komplexním změnám karyotypu. S výjimkou zmnožení 1q21 byly při použití FLC-dif zjištěny obdobné vztahy, jako v případě ^mFLC-r, což signalizuje určitou informační ekvivalenci obou indexů.

Analýza vztahu cytogenetických změn k HLC-r

Korelační analýza neshledala významný vztah mezi zvýšením hodnot ^sHLC-r a přítomností některé z analyzovaných cytogenetických změn, a to ani v případě hlubší analýzy s vyčleněním podsouborů s nízkou vs. vysokou hodnotou ^sHLC-r (cut-off < 0,022 a > 45 podle doporučení Ludwiga) [19, 33]. Jedinou výjimkou byla významná, desetinásobně zvýšená hodnota mediánu ^sHLC-r nemocných s t(4;14)(p16;q32), podchycená i v případě modifikovaného indexu ^mHLC-r a indexu HLC-dif. Přítomnost t(4;14)(p16;q32) při diagnóze MM se tedy vyznačovala statisticky významným vztahem nejen k standardnímu poměru HLC-κ/HLC-λ (^sHLC-r), k modifikovanému poměru „involved/uninvolved“ HLC (^mHLC-r), ale i k rozdílu hodnot obou izotypů HLC („involved – uninvolved“ HLC) (HLC-dif), tedy parametrů vyjadřujících současný stav produkce monoklonálního Ig (MIg) myelomovými plazmocyty a suprimované syntézy normálního/polyklonálního Ig (PIg) téhož izotypu reziduálními normálními, tj. polyklonálními plazmocyty. Této problematice se doposud pouze okrajově věnovala studie Ludwiga, jež popsala významnou korelaci mezi supresí páru HLC a cytogenetickým „high risk“ obrazem, nikoliv stupněm infiltrace kostní dřeně myelomovými plazmocyty [33].

Z nálezu významného vztahu mezi zvýšenými hodnotami ^mHLC-r a trizomie 17, zmnožení oblasti 1q21 a nálezu komplexních změn karyotypu vyplývá, že jde o účelně pojatý ukazatel se statisticky širším a významnějším korelačním potenciálem nežli standardní index ^sHLC-r [16, 18], zatížený význačným rozptylem neobyčejně rozdílných hodnot ztěžujících klinickou interpretaci [28]. Analýza výskytu cytogenetických změn v souborech nemocných s nízkou vs. vysokou hodnotou ^mHLC-r odhalila v případě cut-off ≥ 89,2 (medián souboru) významně častější přítomnost zmnožení oblasti 1q21 a komplexních změn. Separátní analýza nemocných s IgG izotypem MM rozpoznala na rozdíl od IgA třídy vztah ^mHLC-r nejen k zmnožení oblasti 1q21, ale i k trizomii 17. Ve skupině nemocných s cut-off indexu HLC-dif ≥ 31,6 byla vedle opět významně častějšího zmnožení oblasti 1q21 a navíc i translokace t(4;14)(p16;q32). Originálně odhalený významný vztah vysokých hodnot indexu ^mHLC-r k řadě různých chromozomových změn nasvědčuje určité provázanosti cytogenetických aberací s náloží a funkcí myelomového klonu a zprostředkovaně i s velikostí kompartmentu normálních plazmocytů, zejména s prognosticky rizikovými typy karyotypu. Výše indexu ^mHLC-r, případně i HLC-dif nemá tedy vztah pouze k objemu nádorové masy a redukci normálních plazmocytů, ale i k doposud nedostatečně poznaným vnitřním biologickým vlastnostem myelomových plazmocytů a druhotným změnám „niche“ mikroprostředí kostní dřeně. Složitost vzájemného vztahu cytogenetických změn, hodnot indexu HLC-r a prognostických faktorů MM demonstrují i výsledky multivariační analýzy Bradwella [53] prokazující, že hodnoty HLC-r a β₂-M měly k přežití bez progrese významnější vztah, nežli albumin, FLC-r a překvapivě i cytogenetické změny typu parciální delece nebo monozomie chromozomu 13 (51), translokace t(4;14)(p16;q32) (54) a přítomnosti monoalelické del(17)(p13) (40, 53). Stadium 3, vyčleněné s pomocí stratifikačního modelu založeného na hodnotách HLC-r a β₂-M se vyznačovalo významně kratším přežitím do progrese nežli při stanovení s pomocí ISS [53].

Analýza vztahu cytogenetických změn k MIg

Za překvapivý nutno považovat nález, že na rozdíl od standardních i modifikovaných indexů FLC-r a HLC-r, případně i FLC-dif a HLC-dif byla zjištěna významně vyšší koncentrace MIg v séru pouze v případě trizomie chromozomu 15. Příčinou mnohem přínosnějších výsledků v případě FLC-r a zejména HLC-r ve srovnání s koncentrací MIg je nepochybně komplexnější podstata indexů FLC-r a HLC-r. Stanovení poměru „involved vs. uninvolved“ sekrečních produktů plazmocytů, tj. FLC a HLC se vyznačuje mnohem komplexnějším vztahem ke změnám v kostní dřeni provázejících rozvoj MM, tj. nejen k proliferačním a dalším vnitřním změnám nádorového klonu, ale i k hloubce útlumu populace normálních plazmocytů. Bylo zjištěno, že k HLC izotypově-specifické supresi polyklonálních Ig dochází v důsledku selektivní změny „niche“ mikroprostředí kostní dřeně vyvolané proliferujícími neoplastickými plazmocyty IgG případně i IgA typu [53]. Podle zjištění Katzmanna suprimují v případě IgG typu monoklonální gamapatie nejistého významu monoklonální IgG plazmocyty IgG populaci s opačným typem lehkého řetězce, takže stupeň suprese těchto neklonálních plazmocytů je předpovědním ukazatelem vysokého rizika maligní transformace monoklonální gamapatie nejistého významu v MM [55].

ZÁVĚR

Studie potvrdila, že cytogenetické vyšetření MM metodou FICTION je přirozenou součástí „dobré klinické praxe“, neboť významně prohlubuje možnosti individuálního poznání biologických vlastností této geneticky velmi heterogenní nemoci. Zejména v případě strukturálních aberací vyčleňujících skupinu se „středním“, tj. t(4;14)(p16;q32) a „vysokým“ prognostickým rizikem, tj. del(13)(q14), del(17)(p13), zmnožením oblasti 1q21 a přítomností komplexních změn byl prokázán významný, i když proměnlivý vztah k ukazatelům rozsahu (Hb, trombocyty) i biologickým vlastnostem myelomové tkáně (β₂-M), zatímco v případě trizomie chromozomu 15 a 17 ke zvýšené koncentraci M-proteinu v séru. Byl rovněž ověřen praktický přínos výpočtu modifikovaných indexů ^mFLC-r a ^mHLC-r, případně stanovení indexů FLC-dif a HLC-dif s originálním odhalením statisticky významného vztahu zejména modifikovaného indexu ^mHLC-r, výběrově i indexu HLC-dif ke stěžejním, prognosticky významným strukturálním aberacím, především k t(4;14)(p16;q32), zmnožení oblasti 1q21 a nálezu komplexních změn. Je zřejmé, že k získání širších a všeobecně platných poznatků prohlubujících poznání patobiologie MM je nezbytná, zejména v případě chromozových změn s nízkou incidencí, analýza podstatně rozsáhlejších souborů.

Seznam použitých zkratek

BJ – Bence-Jones

β₂-M – β₂-mikroglobulin

Ca – vápník

Del – delece

D-S – stážovací systém podle Durieho-Salmona

FISH – fluorescenční in situ hybridizace

iFISH – interfázní fluorescenční in situ hybridizace

FLC – volné lehké řetězce imunoglobulinu („free light chains of immunoglobulin“)

FLC-dif – rozdíl volných lehkých řetězců imunoglobulinu („involved – uninvolved“ FLC)

FLC-r – poměr lehkých řetězců imunoglobulinu séra κ/λ („immunoglobulin free light chain ratio“)

^mFLC-r – modifikovaný poměr „involved/uninvolved“ FLC

^sFLC-r – standardní poměr „involved/uninvolved“ FLC

IFE – imunofixační elektroforéza

Ig – imunoglobulin

IgA – imunoglobulin-A 

IgG – imunoglobulin-G

IgH – přestavba genu pro těžký řetězec imunoglobulinu

IMWG – International Myeloma Working Group

ISS – mezinárodní stážovací systém

Hb – hemoglobin

HLC – pár těžkých/lehkých řetězců imunoglobulinu („immunoglobulin heavy/light chain pairs“)

HLC - dif – rozdíl „involved – uninvolved“ HLC

HLC-r – poměr párů těžkých/lehkých řetězců imunoglobulinu („imunoglobulin heavy/light chain ratio“)

^mHLC-r – modifikovaný poměr „involved/uninvolved“ HLC

^sHLC-r – standardní poměr „involved/uninvolved“ HLC

i-HLC – „involved-heavy/light chain immunoglobulin“

IMWG – International Myeloma Working Group

LDH – laktátdehydrogenáza

LP typ – lymfoplazmocytový typ

M – medián

MGUS – monoklonální gamapatie nejistého původu („monoclonal gammopathy of undetermined significance“)

MIg – monoklonální imunoglobulin

MM – mnohočetný myelom

mSMART – „Mayo Stratification of Myeloma and Risk--Adapted Therapy“

ns – nesignifikantní

OS – celkové přežívání („overal survival“)

PIg – polyklonální imunoglobulin

Pc – plazmocyt

PFS – doba od diagnózy do progrese nebo úmrtí, („progression free survival“)

R-ISS – revidovaný mezinárodní stážovací systém

SPE – elekroforéza proteinů séra

T – translokace

Thr – trombocyty

u-HLC – „uninvolved heavy/light chain immunoglobulin“

Podíl autorů na přípravě rukopisu

ŠV – hlavní autor, zpracování dat a sepsání rukopisu

BJ – cytogenetická analýza a příprava dat

LP – analýza VLŘ a párů HLC

MM – cytogenetická analýza

PT – spolupráce při výběru a analýze klinických dat

MJ – spolupráce při analýze KD a klinických dat

ZJ – statistická analýza

JM – analýza cytogenetických dat, hlavní korekce rukopisu

Poděkování

Podpora grantové studie IGA MZ ČR NT /12451-5 a NT/1440-3.

Čestné prohlášení autorů

Autoři práce prohlašují, že v souvislosti s tématem, vznikem a publikací tohoto článku neshledávají žádný střet zájmů a vznik ani publikace článku nebyly podpořeny žádnou farmaceutickou firmou.

Doručeno do redakce dne 28. 12. 2015.

Přijato po recenzi dne 19. 1. 2016.

prof. MUDr. Vlastimil Ščudla, CSc.

3. interní klinika NRE a Hemato-onkologická klinika LF UP a FN v Olomouci

I. P. Pavlova 6

772 00 Olomouc

e-mail: vlastimil.scudla@fnol.cz