Funkční následky mutací v genu pro nukleofosmin u akutní myeloidní leukemie

Súhrn

Charakteristické mutace v genu pro nukleofosmin jsou nalézány zhruba u třetiny pacientů s akutní myeloidní leukemií (AML). Jejich následkem dochází k přemístění nukleofosminu z jadérek do cytoplazmy a tím k ovlivnění celé řady životně důležitých buněčných procesů. Naše výsledky mimo jiné naznačují, že proti mutovanému nukleofosminu se vytváří imunitní reakce, která u jedinců s vhodným HLA typem snižuje riziko rozvoje AML. Zásah imunitního systému proti leukemickým buňkám může ovšem být blokován inhibičními mechanismy, které jsou v současné době intenzivně zkoumány především u pevných nádorů, ale pravděpodobně působí i u hematoonkologických onemocnění.

KLÍČOVÁ SLOVA:
AML – nukleofosmin – HLA – imunitní odpověď

Akutní myeloidní leukemie (AML) je nejčastější formou akutní leukemie u dospělých, její příčiny a prognóza jsou poměrně heterogenní a vyléčení se daří dosáhnout v průměru asi u 30 % pacientů. Značná část buněk AML vykazuje cytogenetické abnormality, u ostatních byla také již identifikována řada rekurentních mutací, které se mohou vyskytovat i současně. Nejčastější jsou mutace v genu pro nukleofosmin (NPM1), které jsou nalézány asi u 60 % pacientů s normálním karyotypem a jejichž přítomnost je při absenci dalších mutací spojena s příznivější prognózou [1]. V klasifikaci leukemií vydané Světovou zdravotnickou organizací v roce 2016 je AML s mutovaným NPM1 uvedena jako samostatná kategorie onemocnění [2].

Obecně tato diagnóza patří do velmi široké skupiny AML se středním rizikem dle cytogenetického nálezu.

V Ústavu hematologie a krevní transfuze (ÚHKT) jsou mutace nukleofosminu rutinně vyšetřovány od roku 2011. Četnost výskytu mutace NPM1 se na našem pracovišti pohybuje celkově okolo 35 %, u AML s normálním karyotypem je to přes 50 %. Přítomnost izolované mutace v genu NPM1 u pacientů s normálním karyotypem zvyšuje pravděpodobnost dosažení celkové remise a zlepšuje celkové přežití, čímž řadí tyto nemocné do nižšího rizika v rámci široké skupiny AML se středním rizikem (graf 1). Pacienti jsou v tomto případě léčeni standardní indukční léčbou 3+7 (Dauno 60 mg/m² D1,2,3 + Cytosar 100 mg/m² D1-7) a následně čtyřmi cykly konsolidace HIDAC (Cytosar 3g/m², D1,3,5 à 12 hod). Vzhledem k tomu, že se jedná o molekulární ukazatel, jehož vývoj lze sledovat v čase (jak v periferní krvi, tak v kostní dřeni), používá se NPM1 k monitorování minimální reziduální nemoci (MRN). Při opakovaných vzestupech hodnoty (minimálně ve dvou odběrech po sobě) je brán jako indikátor molekulárního relapsu, který předchází relapsu hematologickému a v ÚHKT je indikací k zahájení záchranné léčby jakož i k transplantaci buněk krvetvorby.

Charakteristické mutace koncové části genu NPM1 umístěného na dlouhém raménku pátého chromozomu (5q35.1) byly poprvé popsány v roce 2005 jako překvapivý výsledek imunohistochemického barvení vzorků kostní dřeně pacientů s hematologickými malignitami [3], které bylo prováděno se záměrem detekovat produkty fuzních genů vzniklých chromozomálními translokacemi. Autoři studie specificky u primární AML zaznamenali vysoký počet vzorků, u kterých byl nukleofosmin (NPM) přítomen převážně v cytoplazmě (35 % vzorků označených jako NPMc+), ačkoli je tento protein obvykle soustředěn do buněčných jadérek. Výskyt NPM v cytoplazmě byl dále spojen s normálním karyotypem, s vysokou frekvencí výskytu interních tandemových duplikací v genu FLT3 a s dobrou odpovědí na indukční chemoterapii. Podrobná analýza potom ukázala, že abnormální lokalizace nukleofosminu je způsobena insercí malého počtu (většinou čtyř) nukleotidů v posledním exonu NPM1, která způsobí posun čtecího rámce, ztrátu sekvence zajišťující lokalizaci proteinu v jadérku a obvykle také vytvoření přídavného signálu pro export z jádra. Od vydání této průkopnické práce byla popsána řada různých mutací na 3´-konci genu NPM1, z nichž nejčastější (80 % všech mutací) je označována jako typ A [1, 4, 5]. Jejich následky jsou ovšem podobné a vždy zahrnují změnu lokalizace proteinového produktu [6]. Díky tomu je možné diagnostikovat mutaci nejen pomocí genetického vyšetření, ale také histochemickými nebo imunofluorescenčními metodami (obr. 1). Četné statistické analýzy provedené v posledních deseti letech potvrdily vyšší frekvenci mutací v genu FLT3 a odhalily rovněž častější výskyt mutací DNMT3A a IDH2 [7, 8] u pacientů s mutovaným NPM. Jen vzácně se naopak současně s mutací NPM1 objevují mutace v genech RUNX1, CEBPA a TP53 [9-11].

Nukleofosmin je multifunkční protein, který se vytváří ve všech buněčných typech a účastní se řady procesů včetně tvorby ribozomů [12], duplikace centrozomu [13], apoptózy [14, 15] a oprav poškozené DNA [16]. Jeho role v hematologických onemocněních je různorodá, může působit jako nádorový supresor i jako onkogen [17]. Na jedné straně NPM zajišťuje sestavení a transport ribozomálních podjednotek [18], podílí se na udržení stability genomu [19, 20], působí jako histonový chaperon [21] a díky interakci s nádorovými supresory p53 a p14ARF zajišťuje odstranění buněk poškozených genotoxickým stresem [22–24]. Na straně druhé je v solidních nádorech často pozorována zvýšená exprese NPM [25] a u hematologických malignit se objevují kromě charakteristických mutací také chromozomální translokace zahrnující gen NPM1 (jejich důsledkem je vznik fuzních proteinů, jako je NPM-ALK [26], NPM--RARalfa [27] nebo NPM-MLF1 [28]). O důležitosti funkce nukleofosminu svědčí i fakt, že homozygotní mutace NPM1 je v myším modelu letální již v embryonálním stadiu [20] a v buňkách AML pacientů je vždy zachována jedna alela divokého typu (NPMwt). Mutace charakteristické pro AML jsou často detekovány již v raných fázích onemocnění a jejich výskyt obvykle přetrvává i v relapsu, takže je NPM i vhodným markerem pro sledování minimální zbytkové nemoci [29].

Přestože mutace NPM pravděpodobně představují iniciační událost ve vývoji AML a vytvářejí proleukemické prostředí, molekulární mechanismy následných změn nejsou známy a jsou jistě složité. Mutovaný NPM si zachovává většinu funkčních domén a lze předpokládat, že i nadále tvoří komplexy s dalšími proteiny [6]. NPM ovlivňuje funkci velkého množství rozličných molekul, pro výsledek jeho působení je zřejmě zásadně důležitá jeho lokalizace a mutovaný protein není ve správný čas na správném místě. Je také možné, že přenášením svých interakčních partnerů do jiných částí buňky brání výkonu jejich přirozené funkce a tím rovněž přispívá k nastolení leukemogenních podmínek. Podobně není dosud známo, proč jsou mutace NPM příznivým prognostickým faktorem pro celkové přežití AML pacientů.

Studiem vlastností nemutovaného i mutovaného nukleofosminu se v ÚHKT dlouhodobě zabýváme. Podrobnou analýzou vnitrobuněčné lokalizace fluorescenčně značených variant NPM jsme například ukázali, že ačkoli izolovaný NPMwt a NPMmut se vyskytují takřka výlučně v jadérku, respektive v cytoplazmě, v AML buňkách s heterozygotní mutací se oba typy navzájem ovlivňují. NPM totiž tvoří oligomery [30], ve kterých se mohou obě formy kombinovat. NPM komplexy se tak vyskytují v jadérku, v cytoplazmě i v nukleoplazmě buněk obsahujících mutovaný NPM. Z našich výsledků i z experimentů dalších autorů plyne, že lokalizace závisí na typu mutace, poměrném množství mutované a nemutované formy a také je například ovlivněna působením léčiv [31–35]. Obrázek 2 ukazuje příklad výrazných změn vyvolaných leptomycinem B (LmB) a aktinomycinem D (actD) na modelových buňkách exprimujících fluorescenčně značené varianty NPMwt (červená) a NPMmut (zelená). LmB je inhibitor proteinu zajišťujícího export z jádra do cytoplazmy a jeho působením se i mutovaný NPM vrací do jader. Naopak actD vyvolává genotoxický stres, rozpuštění jadérek a přesun obou forem NPM do cytoplazmy. V literatuře se objevují návrhy terapeutických postupů založených na zásahu do vnitrobuněčné lokalizace NPM a jeho interakčních partnerů. Látky působící soustředění NPM do jadérka by mohly obnovit normální funkci nemutovaného a možná částečně i mutovaného NPM, včetně proapoptotických účinků, které by zajistily přirozené odstranění transformované buňky. Podobně inhibice interakce mutovaného NPM s dalšími proteiny by mohla do značné míry odstranit jeho vliv na buněčné procesy, což by opět mohlo vést k apoptóze. Na druhou stranu úplné vyřazení funkcí NPM (např. u homozygotních mutantů) buňky nepřežívají a molekuly cílící nemutovaný NPM by mohly při vhodném dávkování selektivně poškozovat transformované buňky s mutovanou alelou, které produkují nemutovaného proteinu méně. Vzhledem ke komplexnosti působení NPM, které zahrnuje pronádorové i protinádorové účinky, je ovšem obtížné předvídat výsledný efekt těchto zásahů, který navíc může záviset na typu buňky. Jak uvidíme dále, cytoplazmatická lokalizace mutovaného NPM může mít i pozitivní následky a její zachování může být důležité pro úspěch léčby.

Možným vysvětlením pozorovaného příznivého vlivu mutace NPM na celkové přežití pacientů je imunitní odpověď namířená proti mutovanému proteinu. Hypotézu, že proti unikátní koncové aminokyselinové sekvenci mutovaného NPM se vytváří spontánní imunitní reakce, jsme se rozhodli otestovat porovnáním frekvence výskytu HLA 1. třídy u pacientů s potvrzenou mutací NPM a u zdravých jedinců. Protože antigeny aktivující specifické cytotoxické lymfocyty jsou vystavovány právě na HLA molekulách 1. třídy, očekávali jsme, že jedinci s vhodným HLA typem by měli být vůči leukemii s mutovaným NPM díky imunitní odpovědi odolnější. Na pilotním souboru pacientů ÚHKT [36] a posléze i na větším souboru z více pracovišť (http://www.bloodjournal.org/content/128/22/5230) jsme pak skutečně nalezli několik alelických skupin HLA 1. třídy se sníženou frekvencí výskytu u NPMmut AML pacientů. Rozdíly mezi pacienty s různým HLA typem se přitom vyskytovaly i v dalším vývoji nemoci. Zajímavý závěr vyplynul z teoretických predikcí možných komplexů HLA molekul s peptidy odvozenými z NPM. Ty totiž ukázaly, že imunitní odpověď s největší pravděpodobností není namířena proti mutované sekvenci jako neoantigenu, ale spíše proti peptidům z nemutovaných částí proteinu. Imunogennost mutovaného NPM tedy zřejmě rovněž souvisí se změnou lokalizace – protein přítomný v cytoplazmě může být snáze zpracován a dopraven do endoplazmatického retikula, kde probíhá navázání imunopeptidů na HLA molekuly.

Naše výsledky ovšem také ukazují, že imunitní odpověď nedokáže rozvoji leukemie zabránit u všech pacientů s vhodným HLA typem, zřejmě v důsledku působení mechanismů podobných těm, které umožňují buňkám pevných nádorů imunitní odpověď potlačit, nebo jí uniknout. Mezi možné scénáře (obr. 3) patří například snížení exprese HLA molekul 1. třídy, snížená schopnost prezentace antigenů, potlačení specifické imunitní odpovědi působením inhibičních receptorů cytotoxických lymfocytů nebo globální utlumení funkce imunitních buněk prostřednictvím chemokinů. V současné době proto vyšetřujeme soubor markerů působení imunosupresivních mechanismů u AML pacientů. Pro určení fenotypu leukemických blastů a různých druhů imunitních buněk průtokovou cytometrií je třeba mít k dispozici čerstvé nebo zamražené intaktní buňky. V některých případech je ale možné použít i alternativní metody, které umožňují retrospektivní vyšetření uchovaných vzorků nukleových kyselin. Takový postup s využitím polymerázové řetězové reakce (PCR) jsme vypracovali pro analýzu povrchové exprese ligandu jednoho z inhibičních receptorů, PD-L1 [37], a použili ho pro vyšetření 55 vzorků AML pacientů se vstupní leukocytózou (http://www.bloodjournal.org/content/128/22/5229). Tato analýza ukázala, že pouze 14 pacientů mělo nízkou hladinu PD-L1 a pouze u pacientů s mutovaným NPM měla nízká exprese PD-L1 příznivý vliv na celkové přežití. Pilotní výsledky našich dalších stanovení jsou také v souladu s představou, že imunosupresivní mechanismy známé především ze studií na pevných nádorech působí i u AML a že u pacientů s mutovaným NPM mají tyto mechanismy vliv na vývoj nemoci.

Příklad nukleofosminu a jeho specifických mutací poukazuje na význam porozumění molekulárním mechanismům vzniku a perzistence nádorových onemocnění pro možnost jejich individuální léčby. Vzhledem k závažnosti onemocnění AML a vysoké frekvenci výskytu charakteristických mutací NPM může například aplikace vhodné formy imunoterapie významně přispět ke zvýšení účinnosti léčby. Znalost leukemogenních procesů spojených s mutacemi NPM je také potenciálně využitelná pro vývoj nových cílených terapeutik.

Použité zkratky

actD – aktinomycin D

AML – akutní myeloidní leukemie

HLA – human leukocyte antigen

LmB – leptomycin B

MRN – minimální reziduální nemoc

NPM – nukleofosmin

NPM1 – gen pro nukleofosmin

ÚHKT – Ústav hematologie a krevní transfuze

Podíl autorů na přípravě rukopisu

KK – námět a příprava rukopisu

BB – námět a příprava rukopisu

PS – léčba pacientů

Poděkování

Výzkum role imunitní odpovědi proti nukleofosminu ve vývoji AML je podpořen grantem 16-30268A (AZV MZd ČR).

Čestné prohlášení

Autor práce prohlašuje, že v souvislosti s tématem, vznikem a publikací tohoto článku není ve střetu zájmů a vznik ani publikace článku nebyly podpořeny žádnou farmaceutickou firmou. Toto prohlášení se týká i všech spoluautorů.

RNDr. Kateřina Kuželová, Ph.D.

Oddělení proteomiky

Ústav hematologie a krevní transfuze

U Nemocnice 1

128 20 Praha 2

e-mail: kuzel@uhkt.cz