Základní bioinformatické pojmy a postupy využívané pro analýzu DNA pomocí sekvenování nové generace

Souhrn

Metoda sekvenování nové generace (NGS) se stala velmi populární v biomedicínském výzkumu i v klinické praxi zejména proto, že umožňuje rychlý a detailní vhled do genomu pacienta. V kontextu nádorových onemocnění umožňují metody NGS přesnou detekci jak zárodečných záměn, tak zejména somatických mutací, které mohou pomoci rychle a precizně stanovit diagnózu a přizpůsobit léčbu podle individuálních potřeb pacienta. Vývojem nových výpočetních metod a jejich aplikací za účelem precizního zpracování NGS dat se zabývá vědní obor bioinformatika. Bioinformatická analýza je komplexní proces, jehož správné nastavení je klíčové pro získání relevantních výsledků. Je proto nutné, aby bioinformatik detailně porozuměl biologické podstatě sledovaného jevu, jako je například vznik genových mutací v průběhu onemocnění. Z hlediska bioanalytika i lékaře je naopak užitečné znát jak možnosti a limity NGS technologie, tak i základní bioinformatickou terminologii, na základě které jsou pak schopni s bioinformatiky efektivně komunikovat. V této souhrnné práci se proto autoři snaží obecně popsat bioinformatickou analýzu sekvenačních dat s důrazem na vysvětlení základních pojmů používaných v oblasti analýzy NGS dat.

Klíčová slova:

sekvenování nové generace – bioinformatika – pipeline

SEKVENOVÁNÍ NOVÉ GENERACE – PRINCIP A VYUŽITÍ

Sekvenování DNA je proces určování pořadí nukleotidů v molekule nukleové kyseliny. První pokusy přečíst pořadí nukleotidů spadají do 70. let minulého století [1]. Sekvenování nové generace (NGS) je moderní způsob sekvenování, označovaný také jako “masivně paralelní sekvenování”, který umožňuje souběžné čtení milionů až miliard sekvenovaných úseků o délce desítek až tisíců nukleotidů. NGS se objevilo začátkem 21. století a v posledních letech se začalo využívat v mnoha oblastech biologie a medicíny. Svou popularitu získalo zejména díky své vysoké kapacitě, rychlosti zpracování a citlivosti analýzy. V těchto ohledech NGS zdaleka převyšuje klasickou metodu Sangerova sekvenování. Zatímco Sangerovým sekvenováním můžeme sekvenovat v jednom experimentu desítky až stovky sekvencí o délce maximálně 1 kb s citlivostí detekce alelické varianty okolo 15 % [2], pomocí technologie NGS lze analyzovat desítky milionů až miliardy sekvencí v délce až 600 bází, přičemž limit detekce lze při správném provedení snížit pod 1 % [3–5]. V důsledku značného rozšíření NGS došlo postupně i k výraznému snížení nákladů na sekvenování, které byly v počátku zavedení metody extrémně vysoké.

Na poli NGS se postupně vystřídalo několik technologických platforem, např. pyrosekvenování (Roche, 454), sekvenování pomocí ligace – SOLiD (Thermo Fisher Scientific, Inc.) nebo sekvenování založené na změně elektrického potenciálu – Ion semiconductor sequencing (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Dnes je dominující technologií tzv. sekvenování syntézou (sequencing by synthesis – SBS) firmy Illumina. V současné době se v laboratořích setkáváme nejčastěji se sekvenátory MiSeq, NextSeq či HiSeq, které se liší svou kapacitou. Poptávka po technologiích, které mohou pracovat ještě rychleji a produkovat delší čtení, vyústila v rozvoj sekvenování tzv. “třetí” generace, které je schopno analyzovat velmi dlouhé fragmenty DNA (desítky až stovky kilobazí) v reálném čase bez potřeby PCR. Ke třetí generaci patří přístroje PacBio RSII a Sequel (Pacific Biosciences) či přenosný sekvenátor minION (Oxford Nanopore Technologies). Jejich využití v klinické praxi je však zatím omezené, zejména kvůli náročnosti na přípravu vzorku a nižší kvalitě výstupních dat.

NGS technologie přináší celou řadu možností využití. Mohou například sloužit k identifikaci zárodečných variant ve velkém počtu genů současně. Oproti klasickým metodám sekvenování, které sloužily k detekování jednonukleotidových záměn nebo krátkých inzercí a delecí, umožňují NGS technologie navíc určit také změny v počtu kopií celých genomových oblastí nebo identifikovat strukturní varianty, čímž může do jisté míry konkurovat cytogenetickým vyšetřením. Trendem poslední doby jsou tzv. genové panely. Jedná se o soubory desítek až stovek vyšetřovaných genů, jejichž výběr je definován cílem vyšetření. Tyto panely jsou vhodné pro diferenciální diagnostiku konkrétní skupiny onemocnění nebo lze využít obecnější panely např. pro analýzu genů spojených s hereditárními onemocněními. Existují i sady umožňující testování celého exomu, tzn. všech přepisovaných genů. Nejpokročilejší metodou z hlediska rozsahu sekvenovaných oblastí je potom sekvenování celých genomů, které je ale zatím v klinické praxi využíváno pouze okrajově.

Významnou oblastí využití NGS je nádorová genetika. I zde se uplatňují různé varianty genových panelů navržených pro konkrétní onemocnění (např. ClearSeq AML panel) nebo panely zahrnující stovky genů asociovaných s různými typy nádorů (např. Truseq Pan cancer panel). Vysoká citlivost, kterou NGS umožňuje, je s výhodou využívána kromě detekce zárodečných variant také k detekci somatických klonálních mutací nebo dokonce ke sledování zbytkové choroby u hematologických malignit. Tato vysoká citlivost detekce umožňuje zachytit DNA s nízkým zastoupením ve vzorku – toho se využívá u metod sledujících tzv. cirkulující DNA z rozpadajících se nádorových buněk (circulating tumor DNA; ctDNA), která je izolována z krevní plazmy; tento způsob vyšetření nádoru se označuje jako “liquid biopsy”. Mimo onkologii lze podobný postup uplatnit pro stanovení genetických aberací plodu z fetální frakce v krvi matky (cffDNA – cell free fetal DNA).

NGS analýzy produkují obrovské množství primárních dat, které je nutné vhodně upravit a správně vyhodnotit, což přispělo k dynamickému rozvoji nového vědního oboru – bioinformatiky, která se zabývá analýzou biologických dat pomocí výpočetních metod. Volba způsobu bioinformatického zpracování je kritickým krokem NGS každé analýzy. Jeho správné nastavení a provedení vyžaduje jak porozumění biologické podstatě experimentu, tak znalost relevantních softwarových nástrojů a analytických postupů.

Běžnou součástí komunikace, která se týká NGS experimentů a zpracování dat, jsou anglické pojmy označující jednotlivé kroky nebo součásti analýzy. České ekvivalenty se zatím příliš nevžily. V textu jsme se proto vyvarovali násilných překladů a dali jsme přednost původním anglickým výrazům.

NÁVRH A PŘÍPRAVA SEKVENAČNÍHO EXPERIMENTU

Považujeme za nutné pro úplnost zmínit laboratorní část NGS procesu, která je pro zpracování dat do značné míry určující. Možnosti přípravy vzorku pro NGS experiment jsou vzhledem k prudkému rozvoji této oblasti velmi široké. V první řadě je potřeba stanovit si oblasti zájmu, tzv. ROI (regions of interest), které chceme pomocí NGS analyzovat, a shromáždit příslušnou informaci o těchto oblastech do přehledného souboru (např.bed). Pokud se jedná o jednotlivé geny, popř. několik málo genů, volíme většinou přípravu vzorku založenou na PCR amplifikaci. U většího souboru genů jsou metodou volby jak PCR přístupy, tak postupy využívající tzv. enrichment probes [6], tedy hybridizační sondy, kterými je možné obohatit sekvenační knihovnu o oblasti zájmu a zároveň minimalizovat nežádoucí sekvence. Vzorek připravený k sekvenování se označuje jako sekvenační knihovna. Jedná se o směs náhodných fragmentů DNA o předem stanovené délce, jenž jsou ohraničeny známými, synteticky připravenými sekvencemi, označovanými jako tzv. adaptéry. Tyto adaptéry obsahují sekvence, které umožňují:

• a) amplifikaci knihovny pomocí PCR;
• b) identifikaci vzorků, a tedy jejich míchání do jedné sekvenační reakce, tzv. multiplexing;
• c) hybridizaci fragmentů v sekvenačním čipu.

Modifikací, která zvyšuje detekční limit pro záchyt varianty, je přidání tzv. unikátních molekulárních identifikátorů (UMI) do sekvence adaptéru. Jedná se o sekvenci 8–10 náhodných nukleotidů, která je unikátní pro každý vstupní fragment DNA [7]. Výběr vlastní sekvenační platformy závisí na typu experimentu, velikosti analyzovaného genomu, požadované hloubce pokrytí, přesnosti a ceně.

Bioinformatická analýza NGS dat

Bioinformatická analýza by měla být přizpůsobena na míru použité sekvenační technologii, sekvenačnímu kitu, experimentálnímu designu a v neposlední řadě biologické hypotéze či diagnostickým potřebám. Každé vyhodnocení NGS dat zahrnuje sekvenci kroků, výpočetní postup, který se označuje jako tzv. pipeline. Jako modelová je zde popsána pipeline sloužící k identifikaci variant na úrovni DNA (obr. 1). Běžně používané nástroje pro jednotlivé kroky jsou popsány v tabulce 1.

Obecná pipeline pro účely detekce mutací v DNA zahrnuje tyto základní kroky:

1. Kontrola kvality vstupních dat
2. Úpravy dat před mapováním
3. Mapování individuálně čtených sekvencí (tzv. reads; dále sekvenační čtení) na referenční genom
4. Úpravy dat po mapování
5. Detekce variant
6. Anotace detekovaných variant
7. Vizualizace

V průběhu analýzy je využíváno několik různých datových formátů, jejichž základní přehled je uveden v tabulce 2.

Kontrola kvality (QC) vstupních dat

Po dokončení sekvenační reakce musí být zkontrolován její správný průběh a zhodnocena kvalita generovaných dat. Data jsou získána nejčastěji v podobě souborů formátu.fastq, který obsahuje sekvence analyzovaných fragmentů a informaci o jejich kvalitě [8].

Úprava dat před mapováním

Pro zvýšení kvality sekvenačních čtení se využívají některé analytické postupy [9]:

• spojování překrývajících se konců párových sekvenačních čtení tzv. merging
  • párová sekvenační čtení představují fragment DNA čtený z obou jeho konců. V oblasti překryvu je tak informace o sekvenci získána ze dvou sekvenačních čtení, a proto je spolehlivější;
• odstranění nekvalitních konců sekvenačního čtení tzv. trimming
  • přesnost sekvenační reakce se v jejím průběhu snižuje, a tak se snižuje i kvalita bází s rostoucí délkou sekvenačních čtení. Z tohoto důvodu je v určitých případech vhodné odstranit nekvalitní konce, které mohou být zdrojem nepřesných výsledků;
• filtrování na požadovanou délku sekvenačního čtení, tzv. length filtering

používá se zejména pro odstranění kontaminace jak adaptérovými, tak biologickými sekvencemi.

Mapování sekvenačních čtení na referenční genom

V dalším kroku jsou jednotlivá sekvenační čtení zarovnány k referenčnímu genomu. Tento krok je označován jako tzv. read alignment/read mapping [10]. Referenční genom představuje jednovláknovou konsenzuální sekvenci určitého organismu. V případě člověka obsahuje referenční genom 3 miliardy bazí. Tato část bioinformatické analýzy je stěžejní a její přesnost významně ovlivňuje celkovou kvalitu výsledků.

Účelem mapování sekvenačních čtení na referenční genom je:

• identifikovat, jakou část genomu sekvenační čtení představují;
• zjistit rozdíly mezi referenční sekvencí a sekvencí sekvenačních čtení;
• stanovit statistiku pokrytí a podíl sekvencí mimo ROI.

Výsledky mapování jsou typicky uloženy do souboru formátu .sam nebo .bam. Po mapování se často provádí další kontrola kvality, která je zaměřena na analýzu pokrytí, tzv. coverage. Cílem je ověřit, zda byly regiony zájmu (obvykle definované v souboru formátu .bed, .gff nebo .gtf) osekvenovány. Od hloubky pokrytí, tzn. počtu překrývajících se sekvenačních čtení na určité pozici, tzv. coverage depth, je odvozena citlivost detekce. Obecně platí, že čím větší hloubka pokrytí, tím větší citlivost [11]. Vysoká citlivost NGS je využívána zejména u experimentů analyzujících subklonální somatické mutace u nádorových onemocnění, případně při sledování zbytkové choroby u léčených hematoonkologických pacientů.

Úpravy po mapování sekvenačních čtení

Kvalita mapování může být vylepšena několika analytickými kroky zahrnujícími např. odstranění PCR duplikátů, které vznikají jako artefakt při amplifikaci [12]. Jejich přítomnost může zkreslit informaci o frekvenci variantních alel (VAF – „variant allele frequency“). Odstranění PCR duplikátů není vhodné provádět v případě knihoven založených na obohacení regionů zájmu pomocí PCR, jejíž produkty mohou být s PCR duplikáty zaměněny. Výjimkou jsou knihovny využívající technologii UMI, která slouží právě pro odstranění PCR duplikátů a korekci sekvenačních chyb [13].

Detekce variant

Detekce variant se označuje jako tzv. variant calling. Principem tohoto procesu je identifikace pozic, kde se nukleotidy v sekvenačních čtení liší od referenčního genomu a zejména pak ověření, zda není konkrétní nalezená nukleotidová záměna jen sekvenační či analytický artefakt, a zda se skutečně jedná o variantu v testované DNA.

Softwarový nástroj pro tyto účely se označuje jako, tzv. variant caller. Tyto programy jsou vyvíjeny specificky pro detekci konkrétních typů záměn, ať somatických, nebo zárodečných [14, 15]:

• jednonukleotidových záměn (SNV) a krátkých inzercí a delecí (InDels)
• změn počtu kopií (CNV)
• strukturních variant (SV).

Detekce zárodečných variant se soustředí zejména na genotypování, tj. určení, zda jsou alely shodné s referenční sekvencí či zda jsou variantní, a zda jsou v homozygotním, či heterozygotním stavu. V případě heterozygota by měly být obě varianty alely zastoupené přibližně stejným počtem sekvenačních čtení.

V případě somatických mutací je pozornost soustředěna na frekvenci variantní alely, která odráží zastoupení nádorového klonu ve vzorku. Pro analýzu somatických mutací se v ideálním případě používají 2 druhy materiálu: nádorová tkáň a zdravá tkáň pro odečtení zárodečných variant. U některých malignit může být obtížné definovat správný zdroj nenádorové DNA. Běžným zdrojem DNA pro určení zárodečných variant u solidních nádorů jsou jaderné krevní buňky. V případě hematoonkologických onemocnění je zdrojem nenádorové DNA stěr bukální sliznice. Nicméně v případě některých onemocnění, jako je například akutní myeloidní leukemie, může být bukální sliznice infiltrována nádorovými buňkami. Standardním výstupem detekce variant je soubor .vcf nebo .maf. Tato část analytického postupu patří spolu s mapováním sekvenačních čtení mezi klíčové a zároveň technicky nejnáročnější kroky analýzy. Optimalizace detekce variant je velmi náročná z důvodu velkého počtu dostupných programů a komplexity jejich možností nastavení.

Anotace detekovaných variant

K zjištěným záměnám jsou následně přiřazeny doplňující informace z vybraných databází, tzv. anotace, na základě kterých je možno odhadnout funkční dopad záměn a jejich klinický význam, případně varianty filtrovat a řadit podle individuálních potřeb závislých na biologické hypotéze. Mezi základní a nejčastěji používané databáze patří dbSNP [16], HapMap [17], Cosmic [18], HGMD [19], ClinVar [20], PolyPhen [21] atd.

Seznam anotovaných variant převedený do přehledné tabulky je pak nejčastější formou výsledků NGS analýz vydaných bioanalytikem lékaři či klinickému genetikovi.

Vizualizace

Důležitým krokem vyhodnocení NGS dat je vizualizace generovaných výsledků, která je obzvláště užitečná pro validaci a interpretaci získaných výsledků.

Nástroje tohoto typu nabízí vizualizaci namapovaných sekvenačních čtení [22], čehož se velmi často využívá pro kontrolu detekce inzercí a delecí, a zobrazení variant v kombinaci s anotacemi z různých veřejných databází. Jako příklad jsou na obrázku 1 uvedeny sekvenační čtení namapované na referenční genom se zvýrazněnými záměnami, které mohou představovat jak reálné varianty, tak chyby vzniklé při laboratorním zpracování nebo bioinformatické analýze.

ZÁVĚR

I přes skutečnost, že je dnes sekvenování nové generace dobře zavedenou metodou ve výzkumu, pro klinickou aplikaci nejsou stále dostatečně definovány standardy, jak na úrovni laboratorního zpracování a přípravy vzorků, tak následné bioinformatické analýzy. Pro správnou interpretaci výsledků NGS analýzy je velmi důležité, aby lékař rozuměl možnostem a limitům NGS technologie včetně základů analýzy dat. V textu jsme si kladli za cíl shrnout a objasnit nejdůležitější pojmy a kroky bioinformatické analýzy určené k detekci variant v DNA.

Seznam zkratek

AML – Acute myeloid leukemia

cffDNA – cell-free fetal DNA

CNV – Copy number variation

ctDNA – Circulating tumor DNA

DNA – dezoxyribonukleová kyselina

InDels – inzerce delece

NGS – Next-generation sequencing

PCR – Polymerase chain reaction

QC – Quality control

ROI – Region of interest

SNV – Single Nucleotide Variant

SV – Structural variation

UMI – Unique molecular identifier

VAF – Variant allele frequency

Poděkování

Tato práce byla podpořena projektem CEITEC 2020 (LQ1601) za finančního přispění Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy České republiky v rámci účelové podpory z prostředků Národního programu udržitelnosti II.

Čestné prohlášení autorů

Autoři práce prohlašují, že v souvislosti s tématem, vznikem a publikací tohoto článku nejsou ve střetu zájmů, a vznik ani publikace článku nebyly podpořeny žádnou farmaceutickou firmou.

Podíl autorů na přípravě rukopisu

NT – hlavní autor práce, příprava první verze rukopisu, finalizace rukopisu

FP – spoluautor práce, příprava první verze rukopisu

JK – spoluautor práce, revize a finalizace rukopisu

KP – spoluautor práce, revize a finalizace rukopisu

ŠP – korespondující autor, spoluautor práce, schválení finální verze rukopisu

Doručeno do redakce dne 26. 4. 2018.

Přijato po recenzi dne 15. 5. 2018.

prof. RNDr. Šárka Pospíšilová, Ph.D.

Centrum molekulární medicíny, CEITEC,Masarykova univerzita

Kamenice 5

625 00 Brno

e-mail: pospisilova.sarka@fnbrno.cz