Porovnání dvou metod měření volného hemoglobinu v supernatantu erytrocytových transfuzních přípravků

Súhrn

Úvod: Při skladování erytrocytových transfuzních přípravků stoupá hladina volného hemoglobinu, markeru probíhající hemolýzy. Doporučení Rady Evropy (Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components, 21^st Edition) a česká legislativa (Vyhl. č. 143/2008 Sb.) určují jeho maximální hodnotu jako 0,8 % erytrocytové hmoty na konci doby použitelnosti transfuzního přípravku. Měření % hemolýzy je také doporučeno u erytrocytových transfuzních přípravků, které jsou dále upravovány, např. promytím. Cílem práce bylo porovnat dvě metody měření volného hemoglobinu v supernatantu erytrocytových transfuzních přípravků přímou spektrofotometrií a zjistit vhodnost metody stanovení volného hemoglobinu v transfuzních přípravcích dle Harboea. Soubor a metodika: Do studie bylo zařazeno 20 jednotek erytrocytových transfuzních přípravků. Na konci exspirace byly odebrány vzorky supernatantu a změřena hodnota volného hemoglobinu metodou přímé spektrofotometrie stanovením absorbance vzorku při 540 nm (A) a změřením absorbance při vlnových délkách 415 nm, 450 nm a 380 nm dle Harboea (B). Procento hemolýzy erytrocytární masy pak bylo přepočítáno na objem a hematokrit erytrocytového transfuzního přípravku. Výsledky: Hladina volného hemoglobinu na konci doby skladování erytrocytových transfuzních přípravků nepřesáhla 0,8 % erytrocytové masy u všech jednotek – průměrně 0,31 % (A) a 0,29 % (B). Mezi oběma soubory nebyl zjištěn statisticky ani klinicky významný rozdíl. Závěr: Metoda měření absorbance při vlnových délkách 415 nm, 450 nm a 380 nm dle Harboea odpovídá běžně používané metodě měření při 540 nm a je vhodná k měření obsahu volného hemoglobinu v transfuzních přípravcích.

Klíčová slova:

erytrocyty – hemolýza – spektrofotometrie

ÚVOD

Při skladování erytrocytových transfuzních přípravků dochází k poškození erytrocytů, které je doprovázeno metabolickými změnami, tzv. red cell storage lesion, které se odrážejí v poklesu pH, zvýšení kalia (K⁺), laktátu dehydrogenázy (LDH), konsumpci glukózy, produkci laktátu a poklesu 2,3-difosfoglycerátu (2,3-DPG) a adenosintrifosfátu (ATP). Současně stoupá hladina volného hemoglobinu (vHb), markeru probíhající hemolýzy [1–3]. Doporučení Rady Evropy (Guide to preparation, use and quality assurance of blood components, 21^st Edition [4], dále EU Guide), a česká legislativa (Vyhl. č. 143/2008 Sb. [5]) určují jeho maximální hodnotu jako 0,8 % erytrocytové hmoty na konci doby použitelnosti transfuzního přípravku. Ke zvýšené hemolýze erytrocytů může dojít již během zpracování a skladování přípravků, v důsledku nesprávného promíchání s antikoagulačním nebo aditivním roztokem, nesprávnou centrifugací nebo nedodržením správných skladovacích podmínek (např. teploty) [6]. Kromě nesprávného odběru, manipulace, zpracování nebo skladování může být zvýšená hemolýza v transfuzním přípravku (TP) způsobena také bakteriální kontaminací, vnitřními defekty v membránách erytrocytů dárce nebo jinými abnormalitami na straně dárce [6]. Některé erytrocytové transfuzní přípravky, jako jsou erytrocyty promyté, které jsou dodatečně upravovány, se proto mají kontrolovat již po jejich výrobě.

Volný hemoglobin způsobuje již při malé koncentraci v plazmě nebo resuspenzním roztoku zřetelně růžové zabarvení. Orientačně lze jeho přítomnost hodnotit vizuální kontrolou supernatantu TP, přesnější stanovení poskytuje měření absorbance vzorku při různých vlnových délkách. Při výpočtu % hemolýzy se vychází z objemu transfuzního přípravku, hodnoty hematokritu a z absorbance volného hemoglobinu změřené pomocí spektrofotometrického stanovení.

Běžně používaná metoda měření obsahu volného hemoglobinu [7] vychází z měření absorbance vzorku při 540 nm, která je podle Lambert-Beerova zákona přímo úměrná koncentraci volného hemoglobinu.

Metoda stanovení dle Harboea [8–10] vychází z hodnot absorbance při vlnových délkách 415 nm, 450 nm a 380 nm. Díky tomu lze odstranit interferující vliv bilirubin-albuminového komplexu a lipidů, které také vykazují absorpci při 415 nm (peak pro oxyhemoglobin).

Cílem práce bylo porovnat tyto dvě metody měření volného hemoglobinu v supernatantu erytrocytových transfuzních přípravků přímou spektrofotometrií a zjistit vhodnost metody stanovení vHb v transfuzních přípravcích dle Harboea.

 

MATERIÁL A METODIKA

Odběr krve a výroba transfuzních přípravků

Celkem bylo pro studii využito 20 jednotek erytrocytových TP vyrobených různým způsobem (EBR, ERD, EARD a EP). Odběr plné krve byl proveden standardním způsobem od dobrovolných bezpříspěvkových dárců. Odebírali jsme 460 ± 10 ml plné krve do vaků CompoFlowFlex CT32150 (Fresenius KABI, SRN) s antikoagulačním roztokem CPD v poměru 1: 7 pro zpracování na EBR nebo do vaků CQ32250 Compoflow 4F C3 CPD / SAG-M pro zpracování na ERD. Plná krev byla následně zpracována na a) EBR centrifugací na centrifuze Cryofuge 6000i (Thermo Fisher Scientific, SRN) (14 min, 3 250 ot./min, teplota 22 °C, akcelerace 6, brzda 6) s oddělením plazmy na lisech Optipress II (Baxter Healthcare Corporation, USA) a resuspenzí 100 ml SAG-manitolu; nebo na b) ERD centrifugací na centrifuze Cryofuge 6000i (Thermo Fisher Scientific, SRN) (14 min, 3 250 ot./min, teplota 22 °C, akcelerace 6, brzda 6) s oddělením plazmy na lisech CompoMat G5 (Fresenius Kabi AG, SRN) a resuspenzí 100 ml SAG-manitolu. EARD byly připraveny aferézou při použití odběrových setů Trima Accel^® Auto RBC, Plasma Set na separátoru Trima Accel (Terumo BCT Europe, Belgium). Erytrocyty promyté (EP) byly připraveny následným zpracováním ERD, promytím chlazeným NaCl v Ery wash setu uzavřeným způsobem (Fresenius HemoCare Austria GmbH) a centrifugací na centrifuze Cryofuge 6000i (Thermo Fisher Scientific, SRN) (10 min, 3 000 ot./min, teplota 6 °C, akcelerace 5, brzda 5).

 

Hodnocené parametry

U všech TP jsme v den odběru (den 0) hodnotili objem, obsah hemoglobinu, hematokrit. K posouzení měření % hemolýzy byly přípravky vyšetřeny po výrobě na začátku skladování (den 1) u erytrocytů promytých a na konci exspirace (den 42) u erytrocytů bez buffy coat resuspendovaných (EBR), u erytrocytů resuspendovaných deleukotizovaných (ERD) a u erytrocytů z aferézy (EARD). Hodnotili jsme hodnotu volného hemoglobinu (vHb) v % hemolýzy v supernatantu transfuzních přípravků.

 

Laboratorní analýza

Laboratorní analýza byla provedena v akreditované laboratoři na Oddělení klinické biochemie, KNL, a. s. Vyšetření obsahu vHb bylo provedeno spektrofotometricky (Shimadzu UV-2101 PC, Japonsko).

 

Odběr vzorků

Vzorky na biochemická stanovení byly získány v den vyšetření ze supernatantu po sterilním navaření na vak a následné centrifugaci (5 min, 3 400 ot. /min).

 

Výpočet hodnoty volného Hb

Výpočet % hemolýzy se stanovuje z objemu transfuzního přípravku, hodnoty hematokritu a z absorbance volného hemoglobinu změřené pomocí spektrofotometrického stanovení.

Běžně používaná metoda měření [7] je založena na měření absorbance vzorku při 540 nm, která je podle Lambert-Beerova zákona přímo úměrná koncentraci volného hemoglobinu. Z hodnot absorbance je vypočítána koncentrace volného hemoglobinu v mg/l dle vzorce cHb = A540nm × 10 000 / 8,5.

Metoda měření dle Harboea [8–10] je založena na měření absorbance vzorku při vlnových délkách 415 nm (peak pro oxyhemoglobin), 450 nm a 380 nm. Vzorec pro výpočet koncentrace volného hemoglobinu v g/l: cHb = (2 × A415 – A380 – A450) / 11,96.

V obou případech se pak koncentrace volného hemoglobinu přepočítává na objem TP. Vypočtená hodnota volného hemoglobinu v mg se pak vztahuje k povolené ztrátě Hb hemolýzou, což je 0,8 % erytrocytové masy.

 

Statistické zpracování

Základní statistická analýza byla provedena v programu Excel 2010 (Microsoft Corporation, USA). Hodnotili jsme obsah vHb u jednotlivých typů přípravků změřených dvěma způsoby. Data byla hodnocena pomocí průměru, mediánu a směrodatné odchylky. K porovnání výběrů jsme použili dvouvýběrový t-test a párový test. Statistická významnost byla posouzena na hladině p < 0,05. Dále bylo provedeno porovnání výsledků měření obou metod dle doporučení České společnosti klinické biochemie ČLS JEP pomocí Bland-Altmanova diagramu.

 

VÝSLEDKY

Všechny hodnocené erytrocytové TP měly standardní parametry jakosti pro jednotlivé typy TP podle specifikací TO KNL, a. s. v souladu s Vyhl. č. 143/2008 Sb. a EU Guide. Výsledky uvádí tab. 1.

Předepsaný stupeň hemolýzy (< 0,8 % erytrocytové masy na konci skladování) byl vyhovující v obou sledovaných skupinách. Průměrná hodnota hemolýzy na konci skladování erytrocytových přípravků byla při měření vHb dle Fořtové 0,31 %, při měření dle Harboea 0,29 %.

Výsledky uvádějí tab. 2 a graf 1.

Mezi oběma soubory nebyl pro různé způsoby měření volného hemoglobinu v supernatantu TP zjištěn statisticky významný rozdíl. Obě metody měření byly shledány jako vyhovující.

Porovnání výsledků měření obou metod pomocí Bland-Altmanova diagramu uvádí graf 2. Vypočtený průměrný relativní bias (průměrná hodnota rozdílů) je výrazně menší, než je kritická diference metody. Obě metody jsou tedy pro klinické účely zaměnitelné. Mezi oběma metodami existuje statisticky zanedbatelný bias. Úroveň bias se s 95 % pravděpodobností pohybuje v rozmezí hodnot 0,01–0,03 se střední hodnotou 0,02, což znamená, že metoda měření při 540 nm bude dávat na celém intervalu hodnoty o 0,02 vyšší než měření podle Harboea.

DISKUZE

Hladina volného Hb na konci doby skladování byla u všech erytrocytárních TP pod hranicí, kterou stanovují Vyhl. č. 143/2008 Sb. [5] a EU Guide [4]. Cílem práce bylo stanovit, zda je metoda měření vHb pomocí spektrofotometrického stanovení dle Harboea vhodná k rutinnímu použití při kontrolách jakosti erytrocytových TP v zařízení transfuzní služby.

Neexistuje žádná stanovená metoda měření % hemolýzy erytrocytárních TP. Velmi častou metodou stanovení je metoda měření dle Fořtové [7], která vychází z měření absorbance vzorku při 540 nm, která je podle Lambert-Beerova zákona přímo úměrná koncentraci volného hemoglobinu. Některá ZTS používají ke stanovení % hemolýzy optické měření metodou POCT na hemoglobinometru HemoCue, kdy je absorbance vzorku měřena při 570 nm a 880 nm. Výsledky při stanovení hemoglobinu v plazmě pomocí HemoCue mohou velmi dobře korelovat s výsledky získanými měřením klasickou spektrofotometrií [11]. HemoCue je velmi rychlý a jednoduchý na použití. Hemoglobinmetr může mít pro některá pracoviště i své nevýhody, jako je vyšší cena analýzy, obtížnější udržení přesnosti a správnosti analýzy a zajištění kontroly kvality.

Další možná metoda stanovení dle Harboea vychází z měření hodnot absorbance při vlnových délkách 415 nm, 450 nm a 380 nm. Díky tomu lze odstranit interferující vliv bilirubin-albuminový komplexu a lipidů, které také vykazují absorpci při 415 nm (peak pro oxyhemoglobin). V. Han et al. ve své studii stanovili metodu dle Harboea jako nejlineárnější a nejpřesnější pro měření koncentrace hemoglobinu v supernatantu TP s ohledem na měření v přítomnosti interferujících složek, jako jsou lipidy a bilirubin-albuminový komplex [8–10].

Další možná metoda měření je kyanomethemoglobinová (Drabkinova) metoda založená na měření koncentrace HiCN [12] a měření absorbance vzorku při 550 nm, kdy se koncentrace vHb vzorku počítá z lineární rovnice kalibrační křivky. Tato metoda je doporučena Mezinárodním výborem pro standardizaci v hematologii jako standardní metoda pro stanovení koncentrace Hb v plné krvi [13].

Jiná studie prokázala, že měření plazmatického hemoglobinu je mnohem přesnější za použití Harboeovy metody než při použití Drabkinovy metody [14]. Z tohoto důvodu jsme pro naši studii zvolili metodu měření dle Harboea. Dalším důvodem bylo také to, že pro metodu je dostupná EHK u společnosti INSTAND e.V., kontrolní cyklus Freies Hämoglobin.

 

ZÁVĚR

Metoda měření absorbance při vlnových délkách 415 nm, 450 nm a 380 nm dle Harboea odpovídá běžně používané metodě měření při 540 nm a je na základě námi získaných výsledků vhodná k měření obsahu volného hemoglobinu v supernatantu erytrocytových transfuzních přípravků.

 

POUŽITÉ ZKRATKY

CPD – antikoagulační roztok: citrát, fosfát, dextróza

EARD – erytrocyty z aferézy resuspendované deleukotizované

EBR – erytrocyty bez buffy-coat resuspendované

EHK – externí hodnocení kvality

EP – erytrocyty promyté

ERD – erytrocyty resuspendované deleukotizované

Hb – hemoglobin

HCT – hematokrit

KNL, a. s. – Krajská nemocnice Liberec, a. s.

LDH – laktát dehydrogenáza

NaCl – fyziologický roztok: chlorid sodný

POCT – Point of Care Testing

SAG-M – SAG-manitol: konzervační roztok

TP – transfuzní přípravek

V – objem

vHb – volný hemoglobin

ZTS – zařízení transfuzní služby