Předběžné sdělení - Dovedeme využít potenciál kmenových buněk v traumatologii a ortopedii?

Úvod

V posledních letech došlo k velkému rozvoji traumatologie a ortopedie především v používání nových biomateriálů, sofistikovaných implantátů a kloubních náhrad. V praxi se začaly uplatňovat velmi přesné navigační metody. Využívání těchto nových materiálů a metodik představuje přínos nejen pro pacienty, ale také pro traumatology a ortopédy.

Je však potřeba hledat i další směry rozvoje medicíny. Předpokládá se, že budoucnost lze nalézt v regenerativní medicíně s využitím růstového potenciálu tkání a orgánů. V současné době má největší perspektivu využití kmenových buněk.

Kmenové buňky

Kmenové buňky dělíme na embryonální a kmenové buňky dospělých jedinců.

Kmenové buňky embryonální (ESCs – Embryonal stem cells) jsou pluripotentní, mají schopnost diferenciace v mnoho různých buněčných linií. V traumatologii a ortopedii se však dosud z mnoha důvodů nedají využít .

Kmenové buňky dospělých jedinců (ASCs - Adult stem cells) se na rozdíl od kmenových buněk embryonálních mohou dále diferencovat jen v prostředí mateřské tkáně, např. kmenové hepatocyty v játrech a kmenové krevní buňky v krvi.

Pro traumatology a ortopédy jsou zajímavé především kmenové mesenchymální buňky, které se za určitých podmínek diferencují a proliferují v mateřské tkání v buňky kosti, svalu, chrupavky, ligament a tukové tkáně, což skýtá řadu možností pro jejich využití.

Experimentálně bylo dokonce prokázáno, že za určitých podmínek se tyto kmenové buňky dospělých jedinců stávají multipotentními. To platí také o kmenových buňkách mesenchymu, které se nacházejí v kostní dřeni, kůži, tukové tkáni a mnoha dalších tkáních mesenchymálního původu. U těchto buněk byl prokázán fenomén transdiferenciace, při němž se buňky jedné linie mění v intermediální buňky, které jsou schopny rediferenciace v jinou buněčnou linii.

V současné době existují dvě skupiny kmenových buněk dospělých jedinců s významným klinickým potenciálem:

1. Hematopoetické kmenové buňky (Hemato-poietic stem cells – HSCs)
2. Mesenchymální kmenové buňky (Mesenchy-mal stem cells – MSCs)

Ad 1) Transplantace hematopoetických kmenových buněk se již klinicky využívá řadu let k léčbě leukemie, thalassemie a mnohočetného myelomu.

Ad 2) Kmenové mesenchymální buňky představující heterogenní populaci buněk retikulárních, osteogenních, chondrogenních, tukových, hladkého svalstva a endoteliálních.

Transplantace těchto kmenových mesenchymálních buněk se začínají provádět na mnoha světových traumatologických a ortopedických pracovištích v indikacích podpory tvorby a hojení kosti (paklouby, kostní defekty, defektní zlomeniny, benigní kostní cysty a aseptické kostní nekrózy) a také v léčbě chondrálních defektů.

Nejsnadněji se klinicky získávají aspirací z kostní dřeně, ale jejich zdrojem může být i periost, tuková tkáň a kůže. Při jejich autologním využití se vylučuje riziko imunogenetické neshody.

Získaný aspirát kostní dřeně se zpracovává centrifugací (l ml aspirátu zpracovaného centrifugací obsahuje až 40 milionů jaderných buněk, z nichž je asi 1 500 vlastních mesenchymálních progenitorů kostního hojení). Získaný koncentrát buněk kostní dřeně obsahuje mesenchymální kmenové buňky a také trombocyty, jež jsou zdrojem růstových faktorů, především VEGF (Vascular endothelial growth factor).

Tento koncentrát buněk kostní dřeně lze aplikovat přímo do místa kostního defektu perkutánně trokarem nebo jej můžeme peroperačně navázat na nosiče s osteokonduktivními vlastnostmi (trikalciumfosfát, hydroxyapatit) a peroperačně vyplnit kostní defekt.

Předpokládáme, že tímto způsobem dodáváme do kostního defektu směs kmenových mesenchymálních buněk se dvěmi základními funkcemi:

1. přímé buněčné progenitory kostní reparace,
2. vehikulum nesoucí genovou výbavu, která může ovlivnit i jiné kmenové buňky k produkci růstových kostních faktorů a jejich následné dediferenciaci a proliferaci.

V současné klinické praxi pravděpodobně využíváme k produkci kostní tkáně jen část kmenových mesenchymálních buněk kostní dřeně, které jsou v koncentrátu obsaženy v různých stadiích vývoje prechondroblastu a preosteoblastu. 

Kmenové mesenchymální buňky jsou charakterizovány expresí stěnových antigenů CD 105, CD 44, CD 29, CD 71; je možná jejich laboratorní kvantifikace.

Nevyužíváme však jen mesenchymální kmenové buňky. Koncentrát buněk kostní dřeně obsahuje i kmenové buňky nesoucí antigen CD 34, které jsou silnými progenitory angiogeneze, jsou nezbytné ve vývoji primární sítě cév vytvářející síť pro migraci osteogenních buněk v inicializační fázi kostního hojení. Také tyto buňky můžeme v koncentrátu buněk kostní dřeně kvantifikovat.

Důležitá je také přítomnost trombocytů v koncentrátu kostní dřeně, které jsou významným zdrojem důležitých růstových faktorů pro proces angiogeneze (VEGF-Vascular endothelial growth factor). Řada dalších růstových faktorů obsažených v granulích trombocytů má na fázi angiogeneze a osteogeneze také vliv (PDGF - Platelet derived growth factor, TGF alfa – Transforming growth factor alfa, IGF- Insulin like growth factor, FGF- Fibroblast growth factor, EGF – Epidermal growth factor). Někteří autoři považují přítomnost trombocytů za nezbytnou, v některých pracích se pro podporu kostního hojení používá jen trombocytární gel.

Hojení kosti (tvorba kosti) je složitý proces s převahou anabolismu. Probíhá dvěma základními způ-soby: ossifikací enchondrální a ossifikací intramembranózní.

Obecně existují 4 základní principy ovlivňující kostní produkci:

1. Osteoindukce

Koncept osteoindukce byl zaveden do praxe v roce 1969 R. Uristem a spolupracovníky po jejich vlastním objevu BMP (Bone morphogenetic protein). Výzkum v oblasti kostních morfogenetických proteinů pak v roce 1990 vedl k objevu celé řady dalších osteoinduktivních proteinů. Tyto proteiny indukují k tvorbě kosti přirozené osteogenní buňky. Podporují a regulují chemotaxi, mitózu a diferenciaci osteogenních buněk a hrají důležitou roli v inicializaci kostního hojení (BMP2, BMP 7). Stimulují vlastní kostní hojení a minimalizují vznik opožděného hojení a tvorbu pakloubů (TGF Beta a IGF). Kostní růstové faktory jsou přirozeně obsaženy ve vitálních autologních kostních štěpech, v koncentrátu buněk kostní dřeně, ale začínají se již vyrábět rekombinantní technikou a využívat v praxi. Nevýhodou těchto rekombinantních růstových kostních faktorů je krátký biologický poločas a tedy obtížné udržení dostatečných terapeutických hladin v místě kostního defektu či fraktury. Nicméně existují již práce dokazující efektivitu v léčbě zlomenin (Hladina významnosti II).

2. Osteoprodukce

Přímá tvorba kostní hmoty (nejčastějším příkladem praktického využití jsou kostní štěpy, protože vitální kostní hmota obsahuje osteoblastické buňky i růstové kostní faktory). Podobné osteoproduktivní vlastnosti by měly mít i mesenchymální kmenové buňky obsa-žené v koncentrátu buněk kostní dřeně.

3. Osteokondukce

Jde o podpůrnou síť, jakési lešení (anglicky: „scaffold“), po kterém osteogenní buňky migrují do místa kostního defektu. Tuto vlastnost má především anorganická část kostního transplantátu a materiály typu trikalciumfosfátu a hydroxyapatitu.

4. Mechanická stimulace

Experimentálně i klinicky bylo prokázáno, že mechanická a biofyzikální stimulace kosti má příznivý efekt na tvorbu kostní tkáně proliferací a diferenciací kostních buněk včetně její mineralizace.

Ve výše uvedené metodě aplikace autologního koncentrátu buněk kostní dřeně k podpoře kostního hojení využíváme výše uvedených principů osteoindukce a osteoprodukce, protože tento koncentrát obsahuje jak kmenové buňky osteogenní, tak řadu růstových kostních faktorů uvolňujících se z mesenchymálních kmenových buněk a trombocytů.

Závěr

Výsledky léčby kostních defektů, pakloubů a opožděného hojení zlomenin metodou autologního koncentrátu buněk kostní dřeně v literatuře posledních let nejsou jednoznačné. Existuje již řada publikací s výbornými výsledky v těchto indikacích, ale nejsou k dispozici randomizované prospektivní studie.

Na našem pracovišti jsme metodu perkutánní aplikace koncentrátu autologních buněk kostní dřeně použili v roce 2008 u 11 pacientů. Protože se u této metody jedná o transplantaci tkáně, bylo nutné požádat o schválení SUKL a Etickou komisi naší nemocnice.

Do uvedeného souboru jsme zařadili pacienty s atrofickými i hypertrofickými paklouby dlouhých kostí a defektními tříštivými zlomeninami bérce s prodlouženým hojením, u jedné pacientky jsme současně ošetřili i poúrazovou aseptickou nekrózu hlavice kosti stehenní. Z prvních získaných zkušeností můžeme říci, že metoda je prakticky bezbolestná a pacienti ji velmi dobře tolerují. Vpichy po odběru kostní dřeně z lopat kosti kyčelních ošetřujeme jen sterilními tampóny, vpichy po aplikaci koncentrátu buněk do místa pakloubu ošetřujeme kožním stehem. Pacienti jsou pak zváni na první kontrolu po 6–10 týdnech k provedení prvních rtg snímků, dále v šestitýdenních intervalech. První výsledky však nejsou povzbudivé, zhojili se pouze 3 pacienti. Nicméně hodláme ve využívání koncentrátu buněk kostní dřeně pokračovat. Jsme přesvědčeni o tom, že při perkutánní metodě nedovedeme udržet koncentrát buněk kostní dřeně v místě pakloubu po dostatečnou dobu, proto je naším cílem v další etapě najít vhodný nosič těchto buněk, aby nedocházelo k úniku do okolí kostních defektů.

MUDr. Milan Šír

Traumacentrum FN Ostrava

milan.sir@fno.cz