Výsledky vyšetření mikrodelecí oblasti AZF(Yq) u mužů s reprodukčními problémy

Súhrn

Mužský faktor infertility nacházíme asi u poloviny párů s reprodukčními problémy a asi u 50 % těchto případů zůstává etiologie reprodukčních potíží zatím neznámá.

Mikrodelece Y chromozomu v oblasti AZF se podle literárních údajů vyskytují asi u 4–5 % mužů s oligospermií a asi u 15–18 % mužů s azoospermií, v průměru asi u 10 % mužů s reprodukčními problémy.

Ke komplexnímu vyšetření párů s poruchami reprodukce by dnes mělo již neodmyslitelně patřit genetické vyšetření obou partnerů, u mužů s těžkou oligospermií a azoospermií je většinou zařazeno i molekulárně genetické vyšetření zaměřené na detekce mikrodelecí oblastí AZF a, b, c.

V letech 2000 až 2006 bylo provedeno toto vyšetření u 594 mužů s patologickým spermiogramem. Mikrodeleci oblasti AZF jsme detegovali u 21, což představuje záchyt 3,54 %. V jednotlivých letech kolísal záchyt onemocnění mezi 1,34 % a 5,43 %.

Mikrodelece byla většinou zachycena u pacientů s azoospermií, pouze u 3 mužů byla uvedena těžká oligospermie s maximálním počtem spermií 1,2 mil/ml.

Z našich zkušeností i z literárních údajů jsme vyvodili přísnější indikační kritéria pro toto molekulárně genetické vyšetření a pozitivní záchyty jsme zaznamenali pouze u mužů s počtem spermií do 2 mil/ml.

Genetické poradenství je velmi důležitá součást procesu asistované reprodukce. Informace o možnosti přenosu genetické poruchy na potomky by měla být předána před použitím metod asistované reprodukce.

Klíčová slova:
reprodukční obtíže, mužský faktor, mikrodelece oblastí AZF a,b,c Yq, genetické poradenství

ÚVOD

Reprodukční genetika je součástí oboru reprodukční medicína. Věnuje se vyšetření infertilních párů, etiologii reprodukčních poruch a prevenci vzniku a opakování genetických vad. Jejím cílem je snaha umožnit rodinám mít nepostižené dítě.

Reprodukční genetika je dalším novým odvětvím lékařské genetiky, integrovaným s reprodukční medicínou, asistovanou reprodukcí a vývojovou genetikou, která se zaměřuje na preventivní prekoncepční a prenatální genetická vyšetření u párů s poruchou reprodukce. Reprodukční ge­ne­tika je úzce vázána na perikoncepčnía perinatologickou prevenci a prenatální diagnostiku, je založena na systému specializovaného genetického poradenství, klinické cytogenetiky, molekulární cytogenetiky a molekulární genetiky. řešení závažných problémů poruch reprodukce se řadí k prioritám klinické medicíny. Cílem reprodukční medicíny je umožnit partnerům mít dítě. Cílem reprodukční genetiky je umožnit partnerům mít nepostižené dítě – samozřejmě s přihlédnutím ke specifickému i obecnému gene­tickému riziku rodiny [4,8].

Pro genetické poradenství je porucha reprodukce kontroverzní termín. Porucha reprodukce může být zjevná až v případě, že pár usiluje o koncepci. V případě této po­ruchy je však třeba položit si 2 základní otázky:

1. Je infertilita projevem genetického onemocnění, které může být přenášeno na potomstvo?
2. Může korekce infertility zvýšit riziko narození postiženého dítěte?

Najít odpověï na obě tyto otázky je cílem reprodukční genetiky a pro obě otázky může být u určitého procenta párů odpověï kladná. Dostupná genetická vyšetření však dnes nemůžeme pokládat za vyčerpávající. Tam, kde jsme příčinu infertility schopni odhalit, jsme často schopni určit i riziko postižení u potomstva a většinou i nabídnout cílenou prenatální diagnostiku. U těch párů, kde dostupná genetická, ale i další vyšetření příčinu poruchy reprodukce neodhalí, může tato příčina zůstat skrytá a neumožní odhad genetického rizika ani cílené sledování a prenatální vyšetření, přičemž riziko narození postiženého potomstva ne­mů­že­me jednoznačně vyloučit [3, 10,11].

Neplodností je postiženo asi 15–20 % párů v reproduktivním věku. Dnes zvažu­jeme stejný podíl příčiny poruchy fertility na straně muže i ženy. Předpokládá se, že andrologický faktor se podílí na infertilitě asi u 1/3 párů samostatně a u 1/3 je společný podíl na straně muže i ženy. Asi 50 % případů mužské infertility zůstává neobjasněno.

K základním genetickým vyšetřením při zjištěné andrologické příčině poruchy fertility by mělo patřit především:

1. klinickogenetické a genealogické vyšetření obou partnerů - tedy sestavení podrobné anamnézy a minimálně třígeneračního rodokmenu
2. cytogenetické vyšetření obou partnerů
3. mutační analýza nejčastěji se vysky­tujících mutací v CFTR genu u muže se zjiš­těným patologickým spermio­gra­mem
4. detekce mikrodelecí oblastí AZF na Yq chromozomu u mužů s azoospermií nebo těžkou oligozoospermií [1,6,12]

Mikrodelece AZF (azoospermia factor) oblastí na dlouhém ramenu chromozomu Y (Yq11.3) jsou považovány za nejčastější příčinu těžké oligospermie nebo azoospermie, kterou můžeme detegovat moleku­lárně genetickým vyšetřením - DNA analýzou. V AZF oblasti se vyskytuje tzv. genová rodina DAZ - z anglického označení dele­ted in azoospermia. Frekvence výskytu mikrodelecí AZF oblastí se odhaduje asi na 1/10 000 živě narozených chlapců. Literární údaje hovoří o výskytu mikro­delece AZF oblasti asi u 4–5 % mužů s oligospermií a asi u 15–18 % mužů s azoospermií, v průměru asi u 10 % mužů s reprodukčními problémy. Oblast AZF je rozdělena do 3 podoblastí AZFa, AZFb a AZFc (dříve byly označovány také jako AZF 1 a AZF 2). Geny vyskytující se v tomto úseku se účastní procesu spermatogeneze a jsou nezbytné pro mužskou reprodukci. Předpokládá se, že každá podoblast je aktivní v jiné fázi spermatogeneze. Mezi genotypem a fenotypem byla vypozorována určitá korelace závažnosti postižení. Mikrodelece v podoblasti AZFb a AZFc se projeví ve fenotypu většinou pod obrazem oligozoospermie až azoospermie. Mikrodelece v oblasti AZFa má závažnější projev a ve většině případů zjišujeme azoospermii [2,5,9].

Screening mikrodelecí Yq chromozomu se stal rutinním diagnostickým testem, který může objasnit etiologii poruchy spermatogeneze a může upřesnit prognózu pro možnost získání spermií v případě využití mikrochirurgických technik a asistované reprodukce. Metody asistované reproduk­ce nyní představují účinnou symptomatic­kou terapii pro muže nesoucí mikro­deleci Yq, ale je třeba si uvědomit, že delece AZF oblastí je těmito technikami přenášena na mužské potomky, u kterých následně musíme očekávat poruchu ferti­lity [7,13]. V budoucnu lze pravděpodobně očekávat vývoj terapie založené na znalosti biolo­gické funkce genů AZF oblastí.

METODIKA

Mikrodeleci oblasti AZF Yq jsme na OLG FN Brno začali vyšetřovat u mužů s poruchou reprodukce a s těžkou oligozoospermií až azoospermií v roce 1997. Postupně se toto vyšetření stalo rutinním. Pro zjištění efektivity této analýzy jsme vyhodnotili výsledky za posledních 7 let. Na zá­kladě zhodnocení nízkého záchytu mikro­delece a v souladu s doporučeními v odborné literatuře jsme postupně zpřísnili diagnostická kritéria. Vyšetření jsme původně doporučovali u mužů s počtem spermií 10 milionů/ml a nižším, dnes je toto vyšetření indikováno pouze u hodnot pod 5 milionů spermií v ml, přičemž z našich výsledků za posledních 7 let vyplývá, že pozitivní záchyt jsme zaznamenali pouze u mužů s počtem spermií pod 2 miliony v ml.

MOLEKULÁRNĚ GENETICKÉ VYŠETŘENÍ

Vstupním materiálem pro vyšetření je DNA izolovaná z lymfocytů periferní krve pa­cienta (automatický izolátor Biorobot EZ1).

Při vyšetření používáme modifikovanou metodu PCR, tzv. multiplex PCR s více dvojicemi primerů. Ve 2 multiplex PCR reakcích syntetizujeme pomocí kitu TaqPCRMaster Mix Kit (QIAGEN) vždy 6 oblastí azoospermatických faktorů AZFa, AZFb, AZFc:

1. multiplex PCR: oblast AZFa (primery sY86F/ sY86FR), AZFb (primery sY127F/ sY127R), AZFc (primery sY254F/ sY254R), kontrolu přítomnosti chromozomu Y gen SRY (F/R), a kontrolu reakce F508del (Q1,Q2)
2. multiplex PCR: oblast AZFa (primery sY84F/ sY84R), AZFb (primery sY134F/ sY134R), AZFc (primery sY255F/ sY255R) a kontrolně SRY (F/R ), ZFY(F/R).

Sekvence primerů:

sY86-F: gtgacacacagactatgcttc

sY86-R: acacacagagggacaaccct

sY127-F: ggctcacaaacgaaaagaaa

sY127-R: ctgcaggcagtaataaggga

sY254-F: gggtgttaccagaaggcaaa

sY254-R: gaaccgtatctaccaaagcagc

SRY-F: gaatattcccgctctccgga

SRY-R: gctggtgctccattcttgag

Q1: gttttcctggattatgcctggcac

Q2: gttggcatgctttgatgacgcttc

sY84-F: agaagggtctgaaagcaggt

sY84-R: gcctactacctggaggcttc

sY134-F: gtctgcctcaccataaaacg

sY134-R: accactgccaaaactttcaa

sY255-F: gttacaggattcggcgtgat

sY255-R: ctcgtcatgtgcagccac

ZFY-F: accrctgtactgactgtgattacac

ZFY-R: gcacytctttggtatcygagaaagt

Program amplifikace:

94 °C/15 min

94 °C/30 s, 55° C/30 s,

65 °C/4 min 25x

72 °C/5 min

4 °C

Detekci přítomnosti všech syntetizovaných oblastí genu pro azoospermatický faktor provádíme pomocí elektroforézy v polyakrylamidovém gelu barveném AgNO3. Délky syntetizovaných oblastí: SRY- 472bp, ZFY- 495bp, F508del- 98bp, sY84- 326bp, sY86- 320bp, sY127- 274bp, sY134- 301bp, sY254- 400bp, sY255- 126bp.

VYŠETŘOVANÝ SOUBOR A VÝSLEDKY

V letech 2000 až 2006 byla na OLG FN Brno analyzována oblast AZF Yq u 594 mu­žů s patologickým spermiogramem. Jed­nalo se většinou o pacienty vyšetřované ve spolupráci s Urologickou klinikou LF MU a FN Brno a Centrem asistované reprodukce LF MU a FN Brno; část pacientů byla doporučena ke genetickému vyšetření jiným ošetřujícím lékařem.

Mikrodelece AZF oblastí byla po­tvrzena celkem u 21 mužů, což představuje záchyt 3,54 %. V jednotlivých letech se záchyt pohyboval mezi 1,34 až 5,43 %. Výsledky vyšetření v jednotlivých letech jsou přehledně uvedeny v tab. 1.

V tab. 2 je uveden rozsah mikrodelecí Yq u pozitivně testovaných mužů.

Z korelace našich nálezů mikrodelece Yq s výsledky spermiogramu vyšetřovaných mužů jsme zjistili, že se ve většině případů jednalo o pacienty s azoospermií. Maximální počet spermií u muže se zjištěnou mikrodelecí na Yq chromozomu v našem souboru byl 1,2 milionu/ml. Nálezy SPG jsou uvedeny v tab. 3.

ZÁVĚR

Vyšetření mikrodelecí v oblasti AZF Yq u mužů s patologickým spermiogramem se stalo rutinním screeningovým testem při vyšetřování párů s reprodukčními problémy. Mělo by být indikováno v rámci komplexního genetického vyšetření, které je provázeno genetickým poradenstvím a cytogenetickým vyšetřením, případně dalším specializovaným vyšetřením na úrovni DNA diagnostiky (mutační analýza CFTR genu). Vyšetření mikrodelecí AZF oblastí Yq doporučujeme v souladu s lite­rárními údaji pouze u mužů s těžkou oligozoospermií nebo s azoospermií, která je zjištěna opakovaným vyšetřením spermio­gramu. Molekulárně genetické analýze by mělo předcházet specializované urologic­ko-andrologické vyšetření. Z našich výsledků usuzujeme, že indikace je možno zpřísnit a vyšetření provádět pouze při hodnotách pod 2 miliony spermií v 1 ml. Vyšetřování mužů s patologickým výsledkem spermiogramu by se mělo vždy provádět ve spolupráci s andrologií a urologií a v návaznosti na specializovaná centra asistované reprodukce. V diagnostickém protokolu doporučujeme zařazení genetického vyšetření neplodného páru před první cyklus umělého oplodnění. Součástí genetického vyšetření by měla být i následná konzultace výsledků gene­tického vyšetření včetně výsledků DNA analýzy. V případě potvrzení mikrodelece oblastí AZF Yq je nezbytná nejen konzultace o dalších možnostech využití technik asistované reprodukce, ale i konzultace zaměřená na 100% riziko transferu mikrodelece a souvisejících reprodukčních potíží na všechny mužské potomky, na možnosti prenatální případně preimplantační genetické diagnostiky.

MUDr. Renata Gaillyová, Ph.D.¹RNDr. Iveta Valášková¹

MUDr. Rastislav Beharka²

prof. MUDr. Dalibor Pacík, CSc.²

doc. MUDr. Igor Crha, CSc.³

prof. MUDr. Pavel Ventruba, DrSc.³

¹Oddělení lékařské genetiky LF MU a FN Brno Černopolní 9, 613 00 Brno e-mail: gaillyova@fnbrno.cz

²Urologická klinika LF MU a FN Brno

³Gynekologicko-porodnická klinika LF MU a FN Brno