Virulentný profil a rezistencia Escherichia coli izolovaných od imunokompromitovaných pacientov pri urosepse

Souhrn

Študovali sme vlastnosti kmeňov E. coli izolovaných z krvi imunokompromitovaných pacientov pri uro­sepse. Od každého pacienta (n = 25) bol testovaný jeden kmeň. U kmeňov sme najčastejšie zaznamenali prítomnosť génov adherencie fimA (96 %) a pap (56 %). Z génov, kódujúcich produkciu toxínov, sme v našom súbore kmeňov dokázali prítomnosť cnf (20 %), α-hly (16 %), lt (12 %) a st (8 %). Výskyt génov aer a iucC, podporujúcich prežívanie E. coli v extracelulárnych priestoroch hostiteľa a spojených z utilizáciou Fe²⁺, bol potvrdený v 84 % a 80 %. Fylogeneticky boli študované E. coli najčastejšie zatriedené k fylogenetickým skupinám B₂ a D (53 %, 32 %). Najvyššiu rezistenciu proti antibakteriálnym látkam sme za­znamenali proti trimetoprim/sulfamethoxazolu a ciprofloxacinu (32 %) a proti ampicilin/sulbaktamu (20 %). Všetky kmene boli citlivé voči piperacilín/tazobactamu, kolistínu, amikacínu a meropenemu.

Klíčová slova:
Escherichia coli - urosepsa - virulencia j- rezistencia - fylogenetická príslušnosť

Escherichia coli je súčasťou fyziologickej mikroflóry hrubého čreva. Patrí k oportúnnym patogénom, ktoré sa za určitých okolností uplatňujú v etiológii črevných a mimočrevných infekcií. S izoláciou pato­génnych E. coli sa v našich podmienkach najčastejšie stretávame pri infekciách urinárneho traktu (UTI), pyogénnych infekciách, sporadicky sa vyskytuje pri gastrointestinálnych infekciách. Infekcie E. coli môžu byť sprevádzané komplikáciami, ktoré vyúsťujú do vážnych klinických sta­vov, spojených s bakteriémiou, neonatálnou meningitídou, ascendentnou cholangi­tí­dou, spontánnou peritonitídou, nozo­ko­miál­­nou pneumóniou, resp. inými klinickými prejavmi [1,2].

Na základe klinických príznakov u pa­cienta, vyšetrovaného klinického mate­riálu, fenotypových vlastností izolovaných kmeňov E. coli a spektra dokázaných gé­nov virulencie sa kmene E. coli ozdeľujú na enterovirulentné (EVEC) a extraintes­tinálne (ExPEC). Medzi enterovirulentné patotypy patria enteropatogénne E. coli (EPEC), enterotoxigénne (ETEC), enteroinva­zívne (EIEC), enteroagregatívne (EAggEC), šigatoxigénne (syn. verotoxigénne, enterohemoragické) (STEC, VTEC, EHEC), difúzno--adherentné E. coli (DAEC), adherentno-invazívne (AIEC) a E. coli spôsobujúce odlu­povanie buniek na tkanivových kultú­rach (CDEC) [3]. V roku 2011 pribudol nový patotyp enteroagregatívnych hemoragic­kých E. coli (EAHEC) [4]. Z extraintestinálnych sú najvýznamnejšie uropatogénne E. coli (UPEC), neonatálnu meningitídu vy­vo­lávajúce (NMEC) a septikémiu vyvolávajúce E. coli (SEPEC) [5,6].

Širokú ekologickú diverzitu patogénnych E. coli umožňuje ich genomová plasti­cita. Patogénne kmene obsahujú o 10–20 % viac genetickej informácie ako nepato­génne referenčné kmene E. coli K-12. Každý kmeň izolovaný pri infekciách sa môže vyznačovať unikátnou kombináciou génov virulencie, pričom niektoré sú jedinečné a vyskytujú sa iba u virulentných kmeňov [7,8]. Faktory virulencie v ko­neč­nom dôsledku poškodzujú hostiteľa a prispievajú k vzniku a klinickej manifestácii ochorenia [9,10]. Najväčšiemu riziku nákazy sú vystavení novorodenci, deti, starší ľudia a pacienti po operačnom zákroku. Zvýšené riziko nákazy je u ľudí so zavedeným močovým katétrom, transplantovanou obličkou, poškodenou chrbticou, diabetes mellitus a u pacientov s nádo­rovým ochorením, zvlášť v období ťažkej neutropénie, ktorá vzniká ako následok chemoterapie či celkovej imunodeficiencie [11,12].

Cieľom našej práce bolo otestovať kmene E. coli izolované z krvi pacientov pri urosepse. Pre pacientov s urosepsou bola charakteristická prítomnosť UTI (Urinary Tract Infection), sprevádzaná celkovou systémovou reakciou organizmu na infekciu.

PACIENTI A POUŽITÉ METÓDY

Pacienti

V štúdii boli zahrnuté kmene E. coli izolované od 25 pacientov hospitalizovaných v Univerzitnej nemocnici L. Pasteura v Košiciach, u ktorých došlo k diseminácii E. coli do krvného riečišťa po primárnej infekcii urinárneho traktu. Údaje o primár­nej klinickej diagnóze, pohlaví a veku pacientov sú v tab. 1.

Testované kmene

Študovali sme vlastnosti 25 kmeňov E. coli izolovaných z hemokultúr (od kaž­dého pacienta bol testovaný jeden kmeň). U kmeňov sme vyhodnotili prítomnosť faktorov virulencie, fylogenetickú príslušnosť, prevalenciu virulentných patotypov a citli­vosť voči pôsobeniu antibakteriálnych látok.

V práci sme použili tieto referenčné kmene: E. coli C 600^RIF (hly ^-, cnf1 ^-, pap ^-, sfa ^-, afa ^-, aer ^-, ial ^-, ipaH ^-, iucC ^-, pCVD432 ^-, eaeA ^-, bfpA ^-, lt, st ^-) ^-, E. coli 248/65 (ial⁺, ipaH⁺, iucC⁺), E. coli 378/80 (lt⁺, st⁺), E. coli O29/A (eaeA⁺, bfpA⁺), E. coli F46 (pCVD432⁺), E. coli EB 28 (hly⁺, cnf1⁺, pap⁺, sfa⁺, aer⁺), E. coli KS 52 (afa⁺, aer⁺, pap⁺, fimA⁺), E. coli Nissle 1917 (fimA⁺, aer⁺, iucC⁺).

Hemokultivácia

Na hemokultiváciu sme použili automatizovaný hemokultivačný systém (Bactec 9050). Kmene E. coli z pozitívnej hemokultúry boli izolované a identifikované štandardnými mikrobiologickými postupmi.

Dôkaz génov virulencie

K detekcii génov virulencie u E. coli bola použitá reakcia PCR. Metodické postupy sú popísané v prácach Kmeťová et al [13], Čurová et al [14]. Z génov, ktoré sú zodpovedné za schopnosť prichytenia E. coli na mukózne povrchy, sme metódou PCR dokazovali prítomnosť: fimA (fimbrie typu 1), bfpA (zväzky tvoriace fimbrie), pap (P fimbrie), sfa (S fimbrie), eae (intimín), pCVD (agregatívny typ adherencie), afa (afimbri­álny adhezín). Z génov, kódujúcich tvorbu toxínov, boli detegované gény: α-hly (α-he­molyzín), cnf1 (cytotoxický nekrotizujúci faktor), lt a st (produkcia enterotoxínov). Invazivitu sme posudzovali na základe detekcie génov invazivity ipaH. Z ďalších génov virulencie sme sledovali výskyt génov iucC (aerobaktínsyntetáza) a aer (produkcia aerobaktínu), ktoré súvisia so schopnosťou baktérií utilizovať železo viazané v telových tekutinách:

• Fylogenetické zatriedenie – kmene izo­lo­vané od pacientov sme zatriedili do fylogenetických skupín B₂, D, B₁ a A na základe identifikácie génov chuA, yjaA a fragmentu TSPE4 C podľa Clermonta et al [15].
• Rezistenciu proti antibiotikám – rezisten­ciu proti antibakteriálnym látkam (ampicilin, piperacilin/tazobactam, tri­me­toprim/sulfam, cefepim cefotaxim, ceftazidim, cefuroxim, ciprofloxacin, aztreonam, tobramycin) sme zisťovali štandardnou mikrodilučnou metódou. Rezistenciu proti cefoperazónu a imi­pe­nemu sme určili difúznou metódou.

VÝSLEDKY

Na Oddelení klinickej mikrobiológie Ústavu lekárskej a klinickej mikrobiológie Lekár­skej fakulty UPJŠ a Univerzitnej nemocnice L. Pasteura v Košiciach sa E. coli izoluje z hemokultúr ako druhý najčastejší gramnegatívny patogén (po Klebsiella pneumoniae) (tab. 1). Prítomnosť génov virulencie a rezistenciu sme študovali u 25 klinic­kých izolátov E. coli. Až 24 kmeňov E. coli (96 %), bolo vybavených fimbriami typu 1, ktoré sme detegovali na základe prítomnosti génov fimA. U 14 z testovaných kmeňov boli prítomné P fimbrie, ktoré sú kódované pap génmi (56 %). Výskyt ďal­ších génov, asociovaných so schopnosťou adherencie, klesal v poradí sfa 7 kmeňov (28 %) a afa 4 kmene (16 %), bfpA 5 kme­ňov (20 %) a gén eae u jedného kmeňa (4 %). Z génov kódujúcich produkciu toxí­nov sme dokázali v našom súbore kmeňov prítomnosť cnf (5 kmeňov), α-hly (4 kmene), lt (3 kmene) a st (2 kmene). Výskyt génov aer a iucC, podporujúcich prežívanie E. coli v extracelulárnych priestoroch hostiteľa a spojených z utilizáciou Fe²⁺, bol potvrdený u 21 kmeňov (84 %) a 20 kmeňov (80 %). Gény, kódujúce invazívne vlastnosti ipaH neboli v študovanom súbore doká­zané (obr. 2). Fylogeneticky boli študované E. coli najčastejšie zatriedené k skupinám B₂ a D (53 %, 32 %). Príslušnosť k fylo­genetickej skupine B1 bola zistená v 11 % a k skupine A v 4 %. Desať z testovaných kmeňov bolo na základe spektra dokáza­ných faktorov virulencie zatriedených medzi typické uropatogénne patotypy, 5 patrilo k EPEC patotypu, 1 kmeň k ETEC a 1 kmeň bol EIEC patotypu. Sedem kmeňov nebolo na základe charakteris­tických génov zatriedených k známym patotypom E. coli. Najvyššiu rezistenciu proti antibakteriálnym látkam sme zaznamenali proti trimetoprim/sulfa­metho­xa­zolu a ciprofloxacinu (32 %) a proti ampicilin/sulbaktamu (20 %). Všetky kmene boli citlivé voči piperacilín/tazobactamu, kolistinu, amikacínu a meropenemu (tab. 3).

DISKUSIA

Urosepsa je ochorenie spojené s vysokou morbiditou a mortalitou u imunokompromitovanej populácie [16]. Vzniká na podklade ťažkej močovej infekcie hematogénnym rozsevom pôvodcu ochorenia [17]. Pre E. coli, vyvolávajúce urosepsu, je ty­pická prítomnosť génov virulencie, ktoré im umožnia uplatniť sa v patogenéze [18]. Nešpecifické a špecifické adhezíny umož­ňujú uropatogénnym kmeňom E. coli adherovať na epitel urinárneho traktu a kolonizovať ho. Prítomnosť špecifických adhezínov je jedným z najdôležitejších kritérií pri patotypovom zatrieďovaní E. coli. V našom súbore kmeňov, izolova­ných z hemokultúr, sme nezaznamenali žiadny kmeň bez prítomnosti aspoň jedného z génov adherencie. Prítomnosť špecifických génov adherencie sme využili ako charakteristický dominantný gén pri patotypovom zatriedení E. coli. Najčastej­šie detegované špecifické gény adherencie boli pap gény (56 %), kódujúce tvorbu P fimbrií. Tieto fimbrie sú primárne asociované s kmeňmi vyvolávajúcimi pyelonefri­tídu. Ich prítomnosť svedčí o urinárnom pôvode sepsy [19]. V skupine patotypovo nezatriedených kmeňov sme najčastejšie dokázali prítomnosť fimbrií typu 1 (fimA), ktoré sa môžu vyskytovať tak u kmeňov fyziologickej mikroflóry, ako aj u patogénnych kmeňov (96 % výskyt). Tieto kmene však patrili k fylogenetickej skupine B. Podľa literárnych údajov už samotné zaradenie k fylogenetickej skupine B₂ postačuje k uplatneniu E. coli v patogene­tickom procese [20]. Prítomnosť ďalších génov virulencie môže byť pri sepse alternatívna a je ovplyvňovaná rôznymi fak­tormi, napr. štádiom infekcie. Počet faktorov virulencie bol pri jednotlivých kmeňoch jedinečný, pohyboval sa od jedného do ôsmich. V asociácii s rezistenciou kmeňov proti antibiotikám môže táto skutočnosť ovplyvniť stupeň infekčného procesu a terapeutické možnosti. Aj keď niekoľko kmeňov z nášho súboru mohlo byť potenciálne toxinogénnych, o čom svedčí detekcia génov pre produkciu toxínov (lt, st, cnf1), tieto gény nie sú, podľa autorov Mokady et al [16], rozhodujúce pri rozvoji sepsy. Vyšetrované kmene E. coli, ktoré boli pôvodcami urosepsy, sme na základe fylogenetickej analýzy najčas­tejšie zatriedili do fylogenetických skupín B₂ a D (53 %, 32 %), ktoré sa vyznačujú najvyššou virulenciou. Zistenie genetic­kého profilu E. coli na základe detekcie génov virulencie prispieva k epidemiolo­gickým štúdiám a zisteniu podstaty ich patogenetického pôsobenia [21]. Pato­genézu ovplyvňuje tiež veľkosť infekčnej dávky a lokalizácia infekcie. Naše výsledky rezistencie proti antibakteriálnym látkam korelujú so zisteniami autorov Beerepoot et al [22].

Práca bola riešená s podporou projektu Centrum excelentnosti CEMIO, ITMS: 26220120058 (100 %).

doc. RNDr. Marta Kmeťová, CSc., mim. prof.

Univerzita Pavla Jozefa Šafárika

Ústav lekárskej a klinickej mikrobiológie LF a UN L. Pasteura

Trieda SNP 1, 040 11 Košice