Využití stanovení glykogenfosforylázy BB v diagnostice algické formy akutních koronárních syndromů

Souhrn

Úvod:
Glykogenfosforyláza BB je považována za časný a specifický ukazatel akutního koronárního syndromu. Nedávno byl uvolněn pro rutinní diagnostické využití kit pro stanovení glykogenfosforylázy BB.

Cíl studie:
Ověřit využití stanovení glykogenfosforylázy BB v diagnostice akutního koronárního syndromu.

Metodika:
Vyšetřeno 70 osob s podezřením na akutní koronární syndrom. Konečná diagnóza akutní koronární syndrom/nekoronární obtíže byla sestavena na základě kritérií ESC/ACC/AHA. U všech vyšetřen po příjmu, za 2 a 6 hod troponin I, myoglobin a GPBB v žilní plazmě (heparin-lithium).

Výsledky:
Osoby s akutním koronárním syndromem (n = 52) měly významně vyšší hodnoty glykogenfosforylázy BB po příjmu a za 2 hod po jejich příjmu (21,9 vs 6,2; 18,7 vs 5,9 µg/l; p < 0,01). Hodnoty glykogenfosforylázy BB měly i vyšší diagnostickou efektivitu pro přítomnost akutního koronárního syndromu než hodnoty troponinu I (plocha pod křivkou ROC 0,89 vs 0,78; 0,87vs 0,67). V prvních 2 hod po příjmu byly do regresního modelu pro výskyt akutního koronárního syndromu zahrnuty jako nezávislé proměnné pouze hodnoty glykogenfosforylázy BB (p < 0,05). Pokud byla ze skupiny s akutním koronárním syndromem vyjmuta skupina osob s myokardiální nekrózou (n = 39; akutní infarkt myokardu bez elevace úseku ST na EKG; non-STEMI), bylo zjištěno, že v regresním modelu vyšly při vstupním vyšetření i za 2 hod po příjmu jako nezávislé proměnné pouze hodnoty GPBB a cTnI (p < 0,05). I po provedení adjustace GPBB na cTnI byly zjištěny významně vyšší hodnoty GPBB adjustovaného na troponin I u osob s non-STEMI (14,5 vs -48,0; p < 0,01).

Závěr:
Stanovení glykogenfosforylázy BB má vynikající, na troponinu nezávislou diagnostickou efektivitu pro první hodiny po vzniku akutního koronárního syndromu a v kombinaci s troponinem by mělo zajistit správnou diagnostiku akutního koronárního syndromu.

Klíčová slova:
glykogenfosforyláza BB - akutní koronární syndromy - non-STEMI - koronární markery

Úvod

Rutinně využívané laboratorní ukazatele přítomnosti myokardiální nekrózy jsou typické tím, že diagnostikují myokardiální nekrózu relativně pozdě (např. srdeční troponiny), nebo se vyznačují nízkou specificitou (např. myoglobin nebo albumin vázající kobalt - ACB) [2,4,11]. Ještě problematičtější je situace v diagnostice přítomnosti myokardiální ischemie bez nekrózy, při níž jsou běžně používané ukazatele nespecifické a diagnostika může být zatížena poměrně významnou chybou (např. albumin vázající kobalt - ACB) [2].

Z tohoto pohledu se jeví jako zajímavý ukazatel glykogenfosforyláza BB (GPBB). Glykogenfosforyláza (Glycogen phosphorylase; α-1,4-D-glucan:orthophosphate D-glucosyltransferase; GPBB; EC 2.4.1.1) je glykolytický enzym, který hraje zásadní roli v regulaci metabolizmu sacharidů, jelikož katalyzuje první krok glykogenolýzy, ve kterém je glykogen konvertován na glukózo-1-fosfát (dochází k mobilizaci glykogenu, která je spojena s dodávkou glukózy). Tyto stavy se objevují při ischemii nebo hypoglykemii. Glykogenfosforyláza je spojena s glykogenem v makromolekulárním komplexu, který je strukturálně navázán na sakroplazmatické retikulum (sarcoplasmic reticulum glycogenolysis complex). Stupeň spojení glykogenfosforylázy s tímto komplexem závisí především na metabolickém stavu jedince. Při výskytu hypoxie se glykogenfosforyláza uvolňuje z vazby a převažuje tzv. solubilní forma glykogenfosforylázy, která se dostává difuzí mimo buňku. Časné uvolnění glykogenfosforylázy do krve bývá obvykle následkem kombinace vystupňované glykogenolýzy a zvýšené permeability buněčné membrány, která je pro myokardiální ischemii i nekrózu typická [2].

Glykogenfosforyláza je za fyziologických podmínek dimer (monomer má Mr ≈ 97 kDa), který se skládá ze dvou identických podjednotek (homodimer). V lidských tkáních se běžně vyskytují 3 izoenzymy - GPLL (jaterní izoforma), GPMM (svalová izoforma) a GPBB (mozková izoforma). Tyto izoenzymy jsou kódovány různými geny, mají různou strukturu i funkci. Izoenzym BB byl nalezen v mozku a srdečním svalu; v malém množství i v příčně pruhovaném svalu a dalších tkáních (v leukocytech, slezině, ledvinách, močovém měchýři, varlatech, játrech, zažívacím traktu nebo aortě) [2]. Izoenzym glykogenfosforylázy BB je považován za časný specifický ukazatel myokardiální nekrózy (uvolňuje se během prvních 2 hodin po jejím vzniku), objevily se také informace o jeho diagnostickém využití v odhadu přítomnosti myokardiální ischemie [2,7,9].

Jelikož se před několika měsíci na trhu objevila první komerční diagnostická souprava na stanovení GPBB (IVD-CE) [1], položili jsme si otázku o možném využití tohoto stanovení v diagnostice akutního koronárního syndromu.

Metodika

Soubor vyšetřovaných

K testování bylo vybráno 70 osob, hospitalizovaných v roce 2006 na interním oddělení nemocnice Šternberk pro podezření na algický akutní koronární syndrom (AKS) [12]. U všech osob byl vypočten z hodnot výšky a hmotnosti index BMI a vypočtena střední hodnota arteriálního krevního tlaku podle vzorce: „diastolický tlak + 1/3 (systolický tlak - diastolický tlak)“ [17].

Konečná diagnóza AKS/nekoronární obtíže byla sestavena na základě kritérií ESC/ACC/AHA (anamnéza, klinický nález, EKG, troponin, echokardiografie) [18]; pacienti byli rozděleni na 2 skupiny: 1. skupina byla tvořena pacienty s potvrzenou diagnózou nestabilní anginy pectoris či infarktu myokardu a současně s pozitivním koronarografickým nálezem, 2. skupina byla tvořena pacienty beze změn na EKG, laboratorních ukazatelů možné ischemie myokardu a současně s jasným průkazem jiné vysvětlující příčiny bolesti na hrudi. U těchto jedinců nebyla koronarografie provedena. Znamená to tedy, že 1. skupina pacientů s algickým AKS měla vyjma klasických diagnostických kritérií i pozitivní koronarografii (stenóza velké koronární tepny nad 50 %); ze vstupních kritérií také vyplývá, že do studie nebyli zařazeni pacienti splňující klinická kritéria algického AKS, kteří měli negativní koronarografii.

Laboratorní vyšetření

V rámci diagnostiky algického AKS bylo provedeno opakované vyšetření srdečního troponinu I (cTnI, LEIA, Siemens Medical Solutions Diagnostic) a myoglobinu (LEIA, Siemens Medical Solutions Diagnostic) při příjmu, za 2 a 6 hod po příjmu pacienta (analyzátor IMMULITE 2500, Siemens Medical Solutions Diagnostic, USA). Oba ukazatele byly vyšetřeny z žilní plazmy bezprostředně po separaci (lithium-heparin, centrifugace 3 000 g, 10 min při 4 °C). Současně byl z každého vzorku vytvořen alikvot plazmy na stanovení GPBB, který byl zamražen při -80 °C. Glykogenfosforyláza BB byla stanoven v jedné sérii do 4 měsíců od zamražení metodou ELISA v sendvičovém uspořádání (Diagenics, Německo) na lince Marc+Max (Dynex, USA) s uspokojivými analytickými charakteristikami (opakovatelnost < 8 %, kalibrační rozmezí 3-50 μg/l). Při příjmu pacienta byl ještě vyšetřen C-reaktivní protein (CRP, Diasys, imunoturbidimetrie) na analyzátoru Advia 1650 (Bayer, USA).

Statistická analýza

Data byla zpracována statistickým programem Medcalc (Medcalc, Belgie). K hodnocení normality rozložení dat byl použit test Komolgorovův-Smirnovův. Spojité veličiny byly vyjádřeny jako průměr ± směrodatná odchylka a medián. K hodnocení měřených ukazatelů vzhledem k přítomnosti AKS byla použita ANOVA nebo Kruňkalův-Wallisův test (podle typu rozložení dat), ev. bylo vyšetření doplněno nepárovými srovnávacími testy (t-test nebo Mannův-Whitneyův test). K hodnocení diagnostické efektivity byla použita ROC analýza. Pro zjednodušení interpretace byla vypočtena ještě suma troponinu a suma GPBB jako součet hodnot troponinu (Suma_cTnI) a GPBB (Suma_GPBB) ve všech 3 náběrech. K hodnocení závislosti jednotlivých proměnných na přítomnosti AKS byla použita stepwise regrese a k adjustaci GPBB na cTnI bylo použito údajů získaných z regresních rovnic. Hodnota p < 0,05 byla považována za statisticky signifikantní. Diagnostická efektivita byla hodnocena pomocí operační křivky ROC (stanovení plochy pod křivkou, optimální senzitivita a specificita při definované koncentraci analytu).

Výsledky

U 52 jedinců byl prokázán algický AKS (26 mužů a 26 žen), u 18 pacientů byly hodnoceny obtíže jako nekoronární (8 mužů, 10 žen). Z 52 osob s algickým AKS mělo 13 osob nestabilní anginu pectoris a 39 jedinců akutní infarkt myokardu bez elevace ST úseku na EKG (non-STEMI).

Osoby s algickým AKS se významně lišily od pacientů bez koronárního syndromu v hodnotách GPBB po příjmu a za 2 hod od příjmu (p < 0,01) a v koncentracích troponinu I (cTnI) ve všech 3 náběrech (p < 0,05). Také hodnoty suma troponinu a suma GPBB se významně lišily. Hodnoty věku ani zastoupení pohlaví se u obou skupin nelišily (tab. 1).

Pro hodnocení závislosti sledovaných proměnných na přítomnosti algického AKS byla provedena stepwise regrese. V regresním modelu vyšly jako významně nezávisle proměnné u vstupního vyšetření pouze hodnoty GPBB (p < 0,05). Koncentrace myoglobinu, cTnI, CRP, věku ani pohlaví nebyly do modelu zahrnuty. Po 2 hod po příjmu v regresním modelu vyšly opět jako významně nezávisle proměnné pouze hodnoty GPBB (p < 0,05). Koncentrace myoglobinu, cTnI, věku ani pohlaví nebyly opět do modelu zahrnuty. Po 6 hod nevyšly jako nezávisle proměnné žádné ze sledovaných ukazatelů.

Poté byli pacienti s AKS rozděleni podle diagnózy ještě na podskupinu osob s akutním infarktem myokardu (non-STEMI, 39 probandů), která byla srovnávána se skupinou osob bez AKS. Bylo zjištěno, že jedinci s non-STEMI měli vyšší hodnoty cTnI ve všech 3 náběrech, GPBB při příjmu a za 2 hod po příjmu a stejně tak vyšší hodnoty Suma_GPBB i Suma_cTnI (p < 0,01), tab. 2.

Pro hodnocení závislosti sledovaných proměnných na přítomnosti non-STEMI byla provedena pro každý odběr stepwise regrese. V regresním modelu vyšly při vstupním vyšetření i za 2 hod po příjmu jako významně nezávisle proměnné pouze hodnoty GPBB a cTnI (p < 0,05). Koncentrace myoglobinu, CRP, LD, věku ani pohlaví nebyly do modelu zahrnuty. Za 6 hod po příjmu vyšel jako nezávisle proměnný parametr pouze cTnI. Vzhledem k uvedenému byla provedena u parametrů, vyšetřených při příjmu, adjustace GPBB na cTnI (od hodnoty GPBB byla odečtena hodnota absolutního koeficientu výpočtu regrese GPBB na cTnI a výsledek dělen cTnI). I po této korekci byly zjištěny významně vyšší hodnoty GPBB adjustovaného na cTnI u osob s non-STEMI (14,5 vs -48,0; p < 0,01).

Při hledání souvislostí mezi GPBB a dalšími ukazateli bylo zjištěno, že hodnota GPBB souvisí s řadou kardiálních ukazatelů, nicméně tato souvislost nic neříká o přímém vztahu těchto hodnot (tab. 3).

Diagnostická efektivita GPBB pro přítomnost algického AKS po příjmu a za 2 hod po příjmu pacienta byla ze všech vyšetřených proměnných nejvyšší pro GPBB; v 6. hod bylo možno diagnostikovat přítomnost AKS pouze podle stanovení cTnI. Stanovení myoglobinu nebylo pro přítomnost AKS diagnostické vůbec, výhodou stanovení GPBB byla především vyšší časná senzitivita než u stanovení cTnI (tab. 4, obr. 1 a 2).

Diskuze

Naše výsledky potvrdily vysokou senzitivitu i diagnostickou efektivitu stanovení GPBB při příjmu a za 2 hod po příjmu pacienta pro algický akutní koronární syndrom. V souladu s výsledky dříve provedených klinických studií se domníváme, že GPBB lze považovat za vysoce senzitivní ukazatel přítomnosti akutního infarktu myokardu (AIM), který se uvolňuje během 2-4 hod po jeho vzniku (1-3,13-16). Literární údaje také hovoří o tom, že GPBB je také senzitivním ukazatelem pro detekci perioperační myokardiální ischemie a je možné, že jej lze využít i jako ukazatel časné reperfuze [6]. Hodnoty se normalizují během 1-2 dnů po vzniku myokardiálního postižení [2,4,6,8]. Falešně pozitivní zvýšení GPBB nacházíme u pacientů s traumaty nebo významným postižením centrální nervové soustavy [1].

Za velice zajímavou skutečnost lze považovat informace o tom, že se GPBB zvyšuje také u pacientů s akutním koronárním syndromem (AKS) bez přítomnosti myokardiální nekrózy; stanovení GPBB má u těchto osob významnou prognostickou hodnotu [7,9,13]. Je pravděpodobné, že GPBB by mohl diskriminovat (na rozdíl od myoglobinu nebo troponinů) přítomnost myokardiální ischemie, protože pouze GPBB se u těchto stavů zvyšuje nad horní referenční mez [9,15].

Současně jsme, stejně jako jiní autoři, prokázali, že hodnoty GPBB byly v prvních 2 hod po příjmu pacientů na troponinu nezávislé [14,16]. V podobné studii bylo zjištěno, že se hodnoty GPBB v plazmě zvyšují u 90,9 % osob s AKS již po 1 hod od vzniku bolesti, ve 100 % byly zvýšené za 4-5 hod. Během prvních 6 hod měl GPBB také vyšší senzitivitu (95,5-100 %) a specifičnost (94-96 %) než myoglobin, CK-MB mass a srdeční troponin (ten měl vyšší senzitivitu než GPBB až po prvních 3-4 hod po vzniku příhody) [8,16].

Uvedené nálezy by mohly být výzvou pro výrobce automatických imunoanalytických systémů, aby zařadili toto vyšetření do svého portfolia. Z prvních vlastních zkušeností také víme, že i využití stanovení GPBB v režimu POCT je použitelné pro rutinní klinickou diagnostiku akutního infarktu myokardu [10].

Komerční soupravy na stanovení GPBB nebyly ještě před několika lety ve světě dostupné (existovaly pouze in house metody ELISA) [2,3,5,7]. Teprve před několika měsíci se objevily na trhu diagnostické soupravy (schválené US Food and Drug Administration a označené jako IVD-CE) na bázi ELISA a pro režim rychlé diagnostiky u lůžka (POCT - Point-of-Care testing) [1]. Teoretický přínos tohoto stanovení je jistě zajímavý a pro akutní medicínu možná i zásadní. Problémem však zůstává cena jednoho vyšetření, která se pohybuje okolo 12-15 EUR (podle způsobu využití testu buď na bázi ELISA nebo POCT). V současné době nejsou k dispozici ani údaje o způsobu hodnocení tohoto testu v ČR zdravotními pojišťovnami. Tyto fakta jistě mohou zatím omezit rutinní využití tohoto testu v ČR.

V naší práci jsme sice také zjistili vysokou senzitivitu stanovení myoglobinu, nicméně operační křivka (ROC) potvrdila opakovaně prezentované závěry řady studií o nedostatečné diagnostické efektivitě myoglobinu a tudíž nevhodnosti použití této analýzy pro laboratorní diagnostiku akutního koronárního syndromu (nedostatečná plocha pod křivkou) [2,5,7,11].

Výsledky naší práce by mohly být limitovány nejasnými údaji o době prodlení od vzniku bolesti do příjmu pacienta na interní oddělení. Vzorky plazmy na stanovení GPBB byly získávány z odběrů u pacientů, kdy pouze u přibližně 2/3 z nich bylo možné odhadnout dobu prodlení do jejich příjmu, která činila průměrně 3 hod. Především starší pacienti nebyli často schopni přesně odhadnout dobu trvání bolesti, která také často nebývá vždy přesně určitelná, protože bolesti oscilují, mají atypický charakter atd. Někdy se ani nejednalo o typické bolesti, ale např. o nevolnost s pocením a nějakou formou atypické oprese na hrudi, změnami na EKG, zvýšenou hodnotou troponinu atp. Výpovědní hodnotu GPBB (diagnostickou efektivitu) jsme pak také srovnávali s efektivitou troponinu, který je považován za zlatý standard laboratorní diagnostiky AIM.

Lze uzavřít, že stanovení GPBB pomocí uvedené soupravy ELISA má vysokou diagnostickou efektivitu pro první hodiny po vzniku algické formy akutního koronárního syndromu a koncentrace GPBB je na hodnotách troponinu nezávislá. Toto vyšetření lze doporučit pro časnou diagnostiku algické formy AKS; v kombinaci se stanovením troponinu by mělo diagnosticky pokrýt první dny po vzniku koronární příhody.

prim. MUDr. Bořek Lačňák

www.nemstbk.cz

e-mail: lacnakb@seznam.cz

Doručeno do redakce: 18. 3. 2007

Přijato po recenzi: 12. 6. 2007