Subpopulace CD34⁺buněk a jejich význam pro přihojení štěpu u příbuzenských alogenních transplantací periferních kmenových buněk

Souhrn

Východiska:
Hodnocení kvality štěpu kostní dřeně a periferních kmenových buněk se standardně provádí stanovením koncentrace CD34⁺ buněk. Ačkoliv u autologních transplantací je souvislost mezi dávkou CD34⁺ buněk a rychlostí přihojení štěpu prokázána, u alogenních transplantací tomu tak vždy být nemusí.

Pacienti a metodika:
U pacientů indikovaných k alogenní transplantaci hematopoetických kmenových buněk byla sledována korelace mezi dávkou subpopulací CD34⁺ buněk a rychlostí přihojení. Pacienti byli v analýze rozděleni podle typu přípravného režimu na skupinu s myeloablativním a s nemyeloablativním režimem. Data byla analyzována analýzou variance v regresních modelech a pomocí neparametrických testů.

Výsledky:
Ze sledovaných subpopulací měla největší vliv na přihojení subpopulace CD34⁺36⁺ buněk, které byly také nejvýznamnějším prediktorem rychlosti přihojení u pacientů s myeloablativním režimem. U pacientů s nemyeloablativním režimem nicméně zůstala nejlepším prediktorem přihojení dávka CD34⁺ buněk. Signifikantní vliv na rychlost přihojení v obou skupinách měly rovněž subpopulace CD34⁺38⁺ a CD34⁺61⁺.

Závěr:
U pacientů s odlišnými předtransplantačními režimy se v přihojení pravděpodobně různým mechanizmem uplatňují hematopoetické kmenové buňky a progenitorové buňky definované koexpresí specifických antigenů. Zatímco dávka CD34⁺ buněk stále nejlépe koreluje s rychlostí přihojení u pacientů transplantovaných po nemyeloablativním režimu, po myealoablativních režimech se dávka CD34⁺36⁺ buněk jeví jako lepší prediktor rychlosti přihojení.

Klíčová slova:
hematopoetické kmenové buňky - imunofenotypizace - subpopulace CD34⁺ buněk - alogenní transplantace krvetvorných buněk

Úvod

Transplantace kostní dřeně nebo periferních kmenových buněk krvetvorby (peripheral blood stem cells - PBSC) jsou často jedinou možnou potenciálně kurativní alternativou pro pacienty s nádory typu leukemií či lymfomů. Alogenní transplantace jsou již léčbou první volby zejména u diagnóz akutních leukemií, chronické myeloidní leukemie či relabujících lymfomů [1]. V posledních letech rovněž nemyeloablativní přístup otevřel cestu k této léčbě pacientům vyšších věkových skupin zatížených komorbiditami.

Periferní kmenové buňky krvetvorby se v posledních letech stále více uplatňují jako zdroj hematopoetických kmenových buněk jak u autologních [2–5], tak i u alogenních transplantací [4,6,7]. Výhodou transplantace PBSC je časnější přihojení [8–10] a odběr štěpu bez nutnosti celkové anestezie [11].

Pro úspěšnost transplantace PBSC i kostní dřeně je rozhodující dávka CD34⁺ buněk. CD34⁺ buňky však představují nestejnorodou skupinu, z níž pouze velmi malé procento tvoří pluripotentní hematopoetické kmenové buňky, které ještě neexprimují antigeny specifické pro jednotlivé hematopoetické linie a netvoří CFU-GM (colony forming unit - granulocyte macrophages). Z pluripotentních hematopoetických buněk se formují v dalším vývoji progenitorové buňky, které již exprimují vedle antigenu CD34 i další antigeny charakteristické pro danou vývojovou řadu [12]. Nicméně korelace mezi dávkou transplantovaných CD34⁺ buněk a rychlostí přihojení není jednoznačná. Některé práce naopak popisují větší vliv určitých subpopulací CD34⁺ buněk než samotných CD34⁺ buněk, jak u alogenních [13], tak i u autologních transplantací [2,3,5].

V této práci jsme analyzovali význam dávky CD34⁺ buněk a jejich subpopulací pro rychlost přihojení po transplantaci alogenních PBSC. Vzhledem k tomu, že v námi hodnoceném souboru byli pacienti s odlišnými předtransplantačními režimy, které mohou ovlivnit průběh přihojení, rozdělili jsme pacienty do skupiny s myeloablativním a s nemyeloablativním přípravným režimem.

Metodika

Dárci

Dárcům PBSC byl po podpisu informovaného souhlasu podáván filgrastim (Neupogen; rekombinantní lidský granulocyte-colony stimulating factor; r-metHuG-CSF) v subkutánní injekci v celkové denní dávce 16 µg/kg/den. Separace PBSC byla zahájena vždy 4. den aplikace filgrastimu, pokračovala 5. den a výjimečně i den 6.

Pacienti

Nemocní s diagnózami akutní leukemie lymfoblastické i myeloidní, chronické myeloidní i lymfatické leukemie, nonhodgkinského lymfomu, aplastické anémie a myelomu byli indikováni transplantační komisí Interní hematoonkologické kliniky k příbuzenské transplantaci, byl-li nalezen vhodný příbuzný HLA-identický dárce. Přípravné režimy v souboru pacientů zahrnovaly myeloablativní schémata (busulfan/cyklofosfamid a cyklofosfamid/TBI (total body irradiation - celotělové ozáření) a nemyeloablativní schéma (režim fludarabin/busulfan/anti-T-lymfocytární globulin). Celkem bylo vyhodnoceno 41 pacientů, u nichž byla provedena příbuzenská alogenní transplantace PBSC. Věkový medián příjemců byl 46 let (rozmezí 20 - 65 let). Přehled diagnóz sledovaných pacientů je uveden v tab. 1.

Odběr PBSC a flow cytometrická analýza

Odběr byl prováděn pomocí separátoru COBE Spectra (COBE BCT, Inc., Lakewood, Colorado, USA) zpravidla cestou v. femoralis. Vzorky všech transplantátů byly analyzovány ve trojbarevném režimu na flow cytometru Epics XL (Beckman-Coulter, CA, USA) vybaveném argonovým laserem. Byly použity monoklonální protilátky CD33, CD38, CD45, CD61, CD117 a HLA-DR (Caltag Laboratories, Inc., CA, USA); CD7, CD19, CD36, CD90 (Beckmann-Coulter, Immunotech); CD34 (Becton-Dickinson, NJ, USA). Protilátky byly přímo konjugovány s fluorochromy FITC (fluorescein-isothiocyanate), R-PE (R-phycoerythrin), PE-Cy5 (R-phycoerythrin-Cy5).

Populace CD34⁺ buněk byla identifikována na základě protilátky anti-CD34-PE a parametrů side-scatter (SS). Byly analyzovány následující subpopulace CD34⁺ buněk: CD7, CD19, CD33, CD36, CD38, CD61, CD90, CD117 a HLA-DR (obr. 1).

Analýza krevního obrazu a kvality štěpu

Analýza krevního obrazu byla prováděna na analyzátoru Cell Dyne 3500 (Abbott Laboratories, IL, USA). Procentuální zastoupení CD34⁺ buněk bylo hodnoceno pomocí flow cytometrie. Hodnoty CD34⁺ buněk byly přepočítány na kilogram hmotnosti příjemce. Kultivace CFU-GM byla prováděna standardní metodou v systému kompletního metylcelulózového média MethoCult HCC-4434 (StemCell Technologies Inc., Vancouver, Kanada). Kolonie byly odečítány po 14 - 16 dnech inkubace při 37 °C ve zvlhčené 5% atmosféře CO₂.

Sledování posttransplantačního průběhu

V periferní krvi byl denně stanoven krevní obraz včetně diferenciálního rozpočtu. Den přihojení byl pro jednotlivé populace buněk stanoven následovně: pro leukocyty den vzestupu koncentrace nad 1 x 10⁹/l, pro granulocyty den vzestupu koncentrace nad 0,5 x 10⁹/l a pro trombocyty den vzestupu koncentrace nad 50 x10⁹/l. Dále byly prováděny rutinní biochemické a mikrobiologické analýzy, sledován klinický stav, nutnost substituce krevními deriváty a hodnoceny komplikace související toxicitou přípravného režimu a s reakcí štěpu proti hostiteli (GvHD).

Statistická analýza

Data byla statisticky vyhodnocena v softwaru NCSS verze 6.0 (Dr. J. L. Hintze, UT, USA). Pracovali jsme s dávkou buněk subpopulací CD34⁺ přepočtenými na kilogram hmotnosti příjemce. Pro každou subpopulaci CD34⁺ buněk byla data analyzována pomocí neparametrických testů (Spearman) a dále analýzou variance v regresních modelech kombinujících příspěvek jednotlivých populací pro přihojení.

Výsledky

Buněčné složení transplantátu

Množství CD34⁺ buněk v transplantátu se pohybovalo v rozmezí 0,6 - 4,9 %, s mediánem 1,8 % ze všech leukocytů štěpu. U všech sledovaných subpopulací CD34⁺ buněk (s výjimkou CD34⁺19⁺ buněk) byla zaznamenána poměrně vysoká variabilita v jejich relativní koncentraci. Nejvíce byly ze subpopulací CD34⁺ buněk zastoupeny CD34⁺38⁺ a CD34⁺HLA-DR⁺ buňky (medián 57,8 % a 57,7 % z CD34⁺ buněk).

Pacientům bylo transplantováno minimálně 2,65 x 10⁶ CD34⁺ buněk/kg, medián 7,85 x 10⁶/kg. Ze subpopulací CD34⁺ buněk obsahoval transplantát nejvíce CD34⁺HLA-DR⁺ buněk (medián 4,95 x 10⁶/kg). Nejméně byly ze subpopulací zastoupeny v transplantátu CD34⁺19⁺ buňky (medián 0,17 x 10⁶/kg). Výsledky složení transplantátu všech hodnocených populací jsou shrnuty v tab. 2.

Korelace mezi buněčným složením transplantátu a rychlostí engraftmentu

Při současném hodnocení obou skupin pacientů bylo dosaženo přihojení v linii trombocytární s mediánem 13 dní. Nejkratší doba do přihojení leukocytů byla 9 dní, s mediánem 16 dní. Přihojení granulocytů bylo dosaženo s mediánem 15 dnů od transplantace.

Při analýze celé skupiny pacientů nerozdělené podle typu přípravného režimu významně korelovala dávka transplantovaných CD34⁺ buněk pouze s rychlostí přihojení granulocytů (p < 0,05). Ze subpopulací byl zjištěn nejvýznamnější vliv CD34⁺36⁺ buněk. Jejich množství v transplantátu korelovalo s přihojením leukocytů (p < 0,001), granulocytů (p < 0,01) i trombocytů (p < 0,05). Významná korelace byla také prokázána mezi dávkou CD34⁺38⁺ a CD34⁺61⁺ buněk a přihojením leukocytů a granulocytů (vše p < 0,05).

Rozdíly se však ukázaly po rozdělení pacientů do skupin léčených myeloablativním a nemyeloablativním režimem. Zatímco ve skupině pacientů s nemyeloablativním režimem dávka transplantovaných CD34⁺ buněk korelovala s přihojením leukocytů, granulocytů i trombocytů (p < 0,001), u skupiny s myeloablativním režimem nebyla prokázána pro CD34⁺ buňky korelace žádná (obr. 2). Nejvýznamnějším parametrem pro přihojení u skupiny s myeloablativním režimem byla dávka transplantovaných CD34⁺36⁺ buněk korelující s rychlostí přihojení leukocytů (p < 0,01). Věk pacientů ani dárců neměl významný vliv na sledované parametry.

Diskuse

V současné době jsou standardně hodnocenými parametry určujícími kvalitu transplantátu množství CD34⁺ buněk a CFU-GM [14] ve štěpu. Nicméně byly publikovány práce poukazující na subpopulaci CD34⁺CD38^- buněk jako lepší prediktor úspěšnosti přihojení v linii leukocytů i trombocytů [3,5,15] a rovněž byla prokázána korelace také s dalšími subpopulacemi CD34⁺CD33^- [2] a CD34⁺CD41⁺ [13].

V naší práci jsme analyzovali vliv 9 vybraných subpopulací CD34⁺ buněk na přihojení štěpu u pacientů po alogenní transplantaci. Pokud odhlédneme od typu přípravného režimu, výsledky zahraničních prací jsou nejednotné. Zatímco některé studie popisují vliv dávky CD34⁺ buněk na rychlost přihojení do linie neutrofilů i trombocytů [7,16,17], jinými autory tato korelace prokázána nebyla [18,19]. Lickliter et al [8] vyhodnotili ve své práci výsledky transplantace alogenních PBSC u 42 pacientů a korelaci mezi dávkou CD34⁺ a přihojením neutrofilů neprokázali, naopak ale korelovalo množství transplantovaných CD34⁺ buněk s rychlejším přihojením trombocytů. Podobně se liší i výsledky u autologních transplantací [15,20,21]. Tyto rozdíly ve vlivu CD34⁺ buněk na přihojení mohou být způsobeny rozdíly v souborech nemocných zahrnující pacienty s různými diagnózami a tedy i rozdílnou léčbou.

Ze sledovaných subpopulací jsme zjistili statisticky významný vliv na přihojení u 3 z nich. Vliv CD34⁺38⁺ buněk, které v naší práci korelovaly s přihojením leukocytů a granulocytů, byl prokázán také na linii trombocytů [3]. Jiné studie naopak popisují korelaci dávky méně diferencovaných CD34⁺38^- buněk s rychlostí přihojení neutrofilů [3], leukocytů [5,15] a trombocytů [2,15] u autologních transplantací. Signifikantní byla korelace mezi dávkou transplantovaných CD34⁺61⁺ buněk a přihojením leukocytů a granulocytů, překvapivě však nikoliv trombocytů. Korelace s rychlostí přihojení trombocytů je popsána v práci Bojko et al [22], ale u méně diferencované populace CD34⁺HLA-DR^-61⁺. Nejvýznamnější efekt na přihojení ve všech třech sledovaných liniích byl prokázán u CD34⁺36⁺ subpopulace. Antigen CD36 patří mezi adhezivní molekuly a během hematopoézy je exprimován na povrchu erytrocytárních progenitorů [12]. Vliv CD34⁺36⁺ buněk na přihojení dosud nebyl žádnou skupinou analyzován.

Ve skupině pacientů s nemyeloablativním režimem dávka transplantovaných CD34⁺ buněk významně korelovala s přihojením leukocytů, granulocytů i trombocytů. Subpopulace CD34⁺36⁺ buněk měla signifikantní efekt na přihojení granulocytů, podobně jako transplantované CD34⁺61⁺ buňky.

U pacientů, kteří byli léčeni myeloablativním režimem, již nebyla shledána korelace mezi dávkou transplantovaných CD34⁺ buněk a přihojením do žádné ze sledovaných linií. Subpopulace CD34⁺36⁺ buněk ale jednoznačně korelovala s přihojením leukocytů, granulocytů i trombocytů.

Závěr

Výsledky této práce poukazují na rozdíly v působení CD34⁺ subpopulací na přihojení v závislosti na předchozí léčbě pacienta. Z našich výsledků je patrné, že vyšší transplantované množství CD34⁺ buněk vedlo k signifikantnímu urychlení přihojení pouze u pacientů s nemyeloablativním režimem. U myeloablativní skupiny již nebyl zjištěn signifikantní vliv samotných CD34⁺ buněk, nýbrž větší roli zde hrála dávka subpopulace CD34⁺36⁺ buněk. Není ovšem vyloučen výrazný vliv i jiných subpopulací, především exprimujících adhezivní molekuly, které ovlivňují homing hematopoetických kmenových buněk v kostní dřeni. Naše výsledky hodnotily rychlost přihojení, která je důležitá pro snížení výskytu časných posttransplantačních komplikací a peritransplantační mortality. Pro stabilitu dlouhodobého přihojení může hrát důležitější roli naopak dávka transplantovaných buněk, které představují méně diferencované subpopulace CD34⁺ kompartmentu.

Poděkování

Tato práce byla plně podpořena grantem IGA MZ ČR č. NR/8003-3/2004.

MUDr. Martin Klabusay, Ph.D.

www.fnbrno.cz

e-mail: mklabus@fnbrno.cz

Doručeno do redakce: 9. 1. 2007

Přijato po recenzi: 22. 1. 2007