Mikropartikule

Souhrn

Za mikropartikule (MP) můžeme považovat částice s velikostí 0,05–1 mm. Jejich složení je značně variabilní dle jejich původu. Vždy však nesou na svém povrchu glykoproteiny exprimované taktéž na povrchu buněk. Této vlastnosti se také využívá k jejich detekci pomocí monoklonálních protilátek. MP se uvolňují jako fragmenty z plazmatické membrány prakticky všech typů eukaryotických buněk po jejich stimulaci nebo v rámci jejich apoptózy. MP se mohou tvořit také při procesu narušení buněčné tkáně. Vznik MP takto může reprezentovat širokou odpověď podněty typu buněčného stimulu nebo stresu. V patogenezi zánětu patří mezi klíčové kroky poškození endotelu a uvolnění membrány mikročástic. Metody detekce MP vychází jednak ze snahy stanovit jejich absolutní počet a jednak stanovit jejich trombogenní potenciál. Pro stanovení počtu MP lze s úspěchem využít průtokovou cytometrii, kdy bylo v poslední době popsáno mnoho metod využívajících široké spektrum monoklonálních protilátek. V současné době se využívají zejména stanovení trombocytárních MP pomocí detekce exprese CD41 znaku a endoteliální MP pomocí CD144 znaku. ELISA metodiky naopak slouží pro stanovení trombogenního potenciálu MP pomocí detekce exprese P-selektinu. Specifickou metodou se jeví použití trombin generačního testu v kombinaci s ultrafiltrací pro stanovení trombogenního potenciálu MP. Patologie spojené s MP vychází zejména z poznání jejich patofyziologických vlastností. Trombogenní potenciál je benefitem u trombocytopenií, kde vysoké hladiny MP jsou detekovány u pacientů bez krvácivých komplikací. Tato vlastnost však může být příčinou trombotických komplikací. Naopak negativní vliv mohou mít MP u infarktu myokardu, zánětlivých procesů nebo roztroušené sklerózy.

Klíčová slova:
mikropartikule – trombofilní riziko – P-selektin – průtoková cytometrie – generace trombinu

Úvod

Poškození endotelu a uvolnění membrány mikročástic jsou klíčovými kroky v patogenezi zánětu, v širším pojetí smyslu slova [1,2]. V místě poranění endotelu, sekrece pro-zánětlivých cytokinů a exprese cytoadhesivních endotelových buněk umožní rozšíření a diapedezi zánětu. Současné rozdělení endoteliální bariéry umožňuje infiltraci cévní stěny či perivaskulárního prostoru buňky a v jejich důsledku mediátory zprostředkovaný projev zánětlivé reakce. Dlouhou dobu byly MP považovány za inertní zbytky buněk nebo průvodce buněčné smrti. MP vzniklé apoptózou nebo poškozením buňky jsou nyní popisovány jako silné (dys) regulátory endoteliální funkce. Interakce s proximálními nebo distálními buňkami přispívá k přenosu biologických informací na relativně velké vzdálenosti, což může v konečném důsledku změnit endoteliální funkce samostatně [2].

Ve skutečnosti jsou oba děje – zánět a trombóza – propojeny interakcí cirkulujících buněk, krevních destiček, endotelu (včetně mastocytů) a z něj odvozených mikročástic. Dva odlišné skladovací pooly mikročástic se mohou podílet na patofyziologii trombózy jako: mikročástice uvolněné z periferních cév a krevních buněk, mikročástice uvolněné z apoptotických buněk sekvestrované v cévní stěně a uvolněné v případě ruptury ateromatózního plaku. Zde je důkaz, že trombóza je vyvolána tkáňovým faktorem (TF). TF je hlavním iniciátorem v koagulační kaskádě rozšířeným do krevního oběhu pomocí mikropartikulí. Je známo, že škodlivé cirkulující mikropartikule různého původu mohou vyvolat nežádoucí reakce endoteliálních buněk, včetně amplifikace pro-inflamatorní a pro-koagulační reakce. Experimentální a klinické údaje potvrzují škodlivé vlastnosti MP jako příčinu řady patofyziologických mechanizmů při zánětlivých reakcích, modulaci cévního průtoku, vaskulární remodelaci, angiogenezi a apoptóze, což se promítá řadou chorobných stavů, jako jsou aterotrombóza, vaskularitida, sepse a anafylaxe. Např. při aterotrombóze byl zjištěn podíl mikročástic na: uvolňování cytokinů a cytoadhesivní expresi endotelu a leukocytů, monocytární infiltraci aterosklerotického plaku, proliferaci buněk hladké svaloviny, proteolýze (v neovaskularizaci plaku, jako zdroji krvácení u pokročilé léze), zvýšení oxidativního stresu a také zvýšení trombogenicity [2]. Na druhé straně, protože mikročástice mohou odrážet jemnou rovnováhu mezi stimulací buněk, proliferací a smrtí, je možné, že působí jako signály pro udržení homeostázy u mnohobuněčných organizmů.

Pro-protizánětlivé účinky mikročástic na endoteliálních buňkách a cévní stěně

Účinky mikročástic na změny pro-zánětlivého fenotypu endotelu byly zdokumentovány řadou prací z poslední doby. První monitorování mikročástic a jejich vlivu na endoteliální fenotyp byl ve studiích zkoumajících účinky destičkových mikročástic na kultury endoteliálních buňek. V průkopnické studii zprostředkovaly transcelularní mikropartikule transport kyseliny arachidonové do endoteliální buňky a současně expresi cyklooxygenázy 2 [4]. Kromě toho byly prokázány schopnosti mikročástic: stimulovat uvolnění pro-zánětlivých cytokinů endotelu, včetně interleukinu (IL)-6, monocytárního chemosenzibilního proteinu-1, indukovat expresi endoteliálních cytoadhezinů (intercelulární adhezní molekuly-1, vaskulární adhezní molekuly-1 a E-selektin) a indukovat expresi příslušných counter-receptorů na povrchu leukocytární membrány [4,5].

Protizánětlivé účinky mikročástic

První poznatky naznačující protizánětlivý vliv membránových vesikul poskytla práce Gassera a Schifferliho [10]. Autoři zde ukázali, že neutrofilní mikrovesikula nedisponují prozánětlivou aktivitou v oblasti lidských makrofágů, což bylo hodnoceno monitorováním uvolňování IL-8 a TNF-α. Nicméně bylo zjištěno zvýšené vylučování transformačního růstového faktoru β1, který je účinným inhibitorem aktivace makrofágů. Dále se podařilo prokázat zablokování zánětlivé reakce makrofágů na lipopolysacharidy pomocí mikročástic. Uvolňování mikročástic z neutrofilů se jeví jako silný protizánětlivý efektor v brzké fázi zánětu [10]. V poslední době ukázal protizánětlivý účinek mikročástic odvozených z neutrofilů na endoteliálních buňkách novou cestu aktivace koagulace zprostředkovanou mikročásticemi nesoucí Anexin A1, endogenní protein schopný inhibovat adhezi neutrofilů k endotelu [11].

Protrombogenní potenciál mikročástic na endoteliálních buňkách

Různí endoteliální antagonisté, jako jsou cytokiny, mikroorganizmy (včetně Chlamydia pneumoniae), mohou indukovat membránovou remodelaci a expozici prokoagulačních fosfolipidů, expresi tkáňového faktoru a jeho uvolnění ve formě vázané na mikropartikule. Na jedné straně může být uvolňování endoteliálních mikročástic (EMP) považováno za přínosné k rozpoznání škodlivých pro-apoptotických faktorů, jako jsou kaspázy-3, a tím zabránění apoptóze endoteliálních buněk a jejich oddělení z endotelu [12]. Na druhé straně, v blízkosti cévních poškození může prokoagulační charakter mikročástic měnit rovnováhu hemostázy. Dokladem této hypotézy byla práce Mesriho a Altieriho, kteří prokázali up-regulaci cirkulujících leukocytárních mikročástic. Zánětlivá stimulace MP in vivo byla provedena pomocí stresu stejně jako aktivace signální cesty koagulační kaskády u endotelových buněk, která vede ke zvýšení aktivity tkáňového faktoru [5]. Souběžně mikročásticemi indukované rychlé uvolnění von Willebrandova faktoru na povrchu umožňuje přechodné přilnutí neaktivovaných destiček k endotelu. Tyto dvě hlavní buněčné odpovědi se zdají být pod kontrolou reaktivních kyslíkových radikálů (ROS) uvolněných mikročásticemi [13].

Antikoagulační potenciál mikročástic

Aniontové fosfolipidy odhalené na aktivovaných cévních buňkách nebo uvolněné z mikročástic mohou podpořit tvorbu jak prokoagulačních komplexů, tak protein C antikoagulačních enzymových komplexů (vyžadují přibližně desetkrát vyšší koncentrace fosfatidylserinu). V závislosti na původu MP dochází k expresi trombomodulinu, inhibitoru zevní cesty tkáňového faktoru, endoteliálního protein C receptoru (ePCR) nebo proteinu S, a tím k eventuálnímu zapojení do antikoagulační cesty [14]. Pozoruhodné je, že i když jsou mikročástice uznávány jako silné prokoagulační mediátory v cévách, zvláště pokud slouží jako nosič tkáňového faktoru, mikročástice uvolněné indukcí APC po interakci s funkčním ePCR disponují antikoagulační aktivitou, jako je inaktivace faktoru Va na povrchu mikropartikulí. Obě aktivní místa, jak pro aktivovaný protein C, tak pro proteázou aktivovaný receptor-1 (PAR-1), jsou nezbytná pro formování mikropartikulí [16].

Cirkulující mikročástice a cévní dysfunkce

Několik studií z poslední doby předpokládá, že mikročástice v oběhu lze považovat za doprovodný marker vulnerabilního plaku nebo globální poškození cév [17,18]. Zvýšení plazmatické hladiny endoteliálních MP (EMP) odráží zejména buněčné poškození a jeví se jako marker cévní dysfunkce. EMP koreluje s cirkulující endoteliální dysfunkcí u pacientů s ischemickou dysfunkcí levékomory.

Metody detekce mikropartikulí

Laboratorní metody detekce mikropartikulí až do nedávné doby narážely na zásadní komplikace, které vycházely z charakteru mikročástic, tj. nelze je považovat ani za buňky, ani za plazmatický analyt. V poslední době, díky rostoucímu významu MP u řady chorobných stavů, se rozvinula řada metod pro stanovení počtu, ale zejména trombogenního potenciálu MP.

Metody na stanovení počtu mikročástic vychází z obecné vlastnosti MP, tj., že exprimují CD znak mateřské buňky. To umožňuje stanovit jednotlivé frakce MPs s ohledem na původ jejich vzniku. Naopak metody založené na stanovení trombogenního potenciálu využívají vlastnosti MP aktivovat koagulační systém. Tyto metody mají využití zejména pro monitorování protrombogenního potenciálu mikročástic.

Průtoková cytometrie

Pro stanovení průtokovou cytometrií lze použít řadu protokolů, které byly publikovány v posledních letech. Velmi elegantní je aplikace metodiky využívající průtokovou cytometrii z plné krve [19].

Vzorky plné krve jsou naznačeny příslušnou monoklonální protilátkou, která je specifická pro buňky, z kterých MP pocházejí. Následně jsou vzorky naředěny a podrobeny analýze v průtokovém cytometru. MP jsme schopni odečíst z forwardscatteru, čímž se vyhneme specifické separaci nebo dvojímu značení monoklonální protilátkou. Absolutní počet mikropartikulí je pak vypočten pomocí přídavku kalibračních kuliček o známé koncentraci.

Pro značení lze použít některou z následujících protilátek:

• CD 31 (PECAM 1) – CD31 antigen jeexprimován na destičkách, monocy-tech, granulocytech, ale ne na cirkulu-jících B-lymfocytech. Vysoká hladina je pozorována na povrchu endotelu.
• CD 41 – CD 41 znak je exprimován nadestičkách a megakaryocytech, ale také B-lymfocytech a endoteliálních buňkách.
• CD 144 – CD 144, také nazývaný Cad-herin 5 nebo VE-Cadherin je 140 kDa protein náležící do rodiny cadherinů, které představují molekuly buněčné adheze. CD 144 antigen je specifický pro endoteliální buňky a je lokalizován na intercelulárních trhlinách s poškozením endotelové tkáně.

ELISA metodiky

ELISA metodiky jsou koncipovány na základě vazby p-selektinu exprimovaného na povrchu MP [20,21]. Exprese p-selektinu je dle dostupných prací přímo úměrná trombogennímu potenciálu MP.

MP přítomné ve vzorku se vážou na Anexin V, který je imobilizován na povrchu mikrotitrační desky, a takto navázané fosfolipidové povrchy umožňují přeměnu protrombinu na trombin za přítomnosti F Xa – F Va a Ca²⁺. Koncentrace generovaného trombinu je pak přímo úměrná koncentraci vázaných fosfolipidů a lze ji monitorovat pomocí rozkladu specifického substrátu při 405 nm.

Generace trombinu v kombinaci s ultrafiltrací

Trombin generační test lze využít pro stanovení trombogenního potenciálu MP bez rozdílu jejich původu. Princip testu spočívá v měření TGA u vzorků před a po odstranění MP [22]. MP jsou pak odstraněny většinou ultrafiltrací.

Rozdíl naměřené generace trombinu je pak přímo úměrný trombogennímu potenciálu MP. Jedná se o elegantní metodiku, kterou lze používat v reálném čase bez nutnosti zamrazení vzorků, což vede k vyšší reprodukovatelnosti metodiky.

Patologie spojené s MP

V poslední době byla publikována řada sdělení o významu MP u srpkovité anémie [23], heparinem indukované trombocytopenie [24], septických stavů [25], trombotické trombocytopenické purpury (TTP) [26], paroxyzmální noční hemoglubinurie [27], systémových onemocnění [28–32], kardiovaskulárních onemocnění [33], stroku [34], aneuryzmatu aorty [35], hluboké žilní trombózy a plicní embolie [36], periferního vaskulárního onemocnění [37].

Ačkoli u řady onemocnění není role MP dosud plně objasněna, u některých stavů se MP stávají prostředkem pro terapeutické ovlivnění léčebných postupů. Objasnění patofyziologické role mikropartikulí u srpkovité anémie a TTP může být využito pro charakterizaci jednotlivých fází průběhu těchto onemocnění. Detekce chronicky zvýšené hladiny MP u pacientů se srpkovitou anémií může být využito pro rozpoznání endoteliálního ataku onemocnění, což může vést k časnějšímu terapeutickému zásahu.

Aktivní MP mohou představovat u několika chorobných stavů přímou příčinu onemocnění a představují takto důležitý terapeutický cíl. Odstranění mikročástic v průběhu plazmaferézy může tuto metodu značně zvýhodnit proti podání mražené plazmy u TTP. Stejný postup může být efektivní i u některých septických stavů.

Terapeutické využití MP u krvácejících pacientů představuje jednu z dalších možností terapeutického ovlivnění chorobných stavů [38]. Účinek mikročástic v kryoprecipátutu u pacientů refrakterních na substituci krevních destiček je vysvětlován právě působením MP jako náhradních aktivačních povrchů.

Podpořeno grantem ministerstva zdravotnictví IGA NH 6986-3/2002 a NR 9282-3(2007) a projektem LF-2010-004.

Mgr. Luděk Slavík

www.fnol.cz

e-mail: Ludek.Slavik@fnol.cz

Doručeno do redakce: 31. 3. 2010