Chronické ochorenie obličiek a vápniková homeostáza bunky

Súhrn

Koncentrácia voľného cytosolového vápnika ([Ca²⁺]_i) je veľmi dôležitým signálnym mediátorom pre množstvo biologických systémov. Katióny vápnika (Ca²⁺) sú významnými ubikvitárnymi poslami, ktoré kontrolujú široké spektrum bunkových procesov. [Ca²⁺]_i je kontrolovaná mechanizmami, ktoré regulujú vstup vápnika z extracelulárneho priestoru a jeho uvoľnenie z intracelulárnych priestorov. Aktivitou ATP-dependentných Ca²⁺ púmp a výmenníkových systémov sa vápnik vracia do intracelulárnych zásobníkov alebo sa odčerpáva z bunky. Chronické ochorenie obličiek je spojené so signifikantným zvýšením [Ca²⁺]_i, ktoré je pre bunky toxické a môže byť zodpovedné za mnohé orgánové poruchy. Za zmeny vápnikovej homeostázy buniek u pacientov s chronickým ochorením obličiek zodpovedá navzájom prepojený komplex procesov. Naše štúdie objasňujú patofyziologické mechanizmy, podieľajúce sa na zmenenej homeostáze vápnika v periférnych mononukleárnych bunkách, ktoré sú modelom neexcitabilných buniek. [Ca²⁺]_i je signifikantne zvýšená už v skorých štádiách chronického ochorenia obličiek. Koncentrácia intracelulárnych vápnikových rezerv a kapacitný vstup vápnika sú v porovnaní so zdravými dobrovoľníkmi významne zvýšené. Na tomto zvýšení sa podieľajú aj „pore-forming“ P2X₇ receptory, ktoré majú u pacientov s chronickým ochorením obličiek zmenenú funkciu a vo zvýšenej miere sa exprimujú. Na druhej strane je aktivita plazmatických Ca²⁺-ATPáz zodpovedných za odstraňovanie nadbytočného vápnika z bunky znížená o 25 %. To znamená, že pri chronickom ochoreniu obličiek sú porušené ako mechanizmy vstupu, tak aj výstupu vápnika z bunky. Všetky tieto poruchy sa v signalizácii vápnika podieľajú na zvýšenej [Ca²⁺]_i už v skorých štádiách renálneho ochorenia.

Kľúčové slová:
intracelulárny vápnik – chronické ochorenie obličiek – vápniková signalizácia a regulácia

Úvod

Vápnikové katióny (Ca²⁺) majú významnú úlohu vo vnútrobunkovej signalizácii mnohých fyziologických procesov. Sú centrálnou veličinou, od ktorej závisia takmer všetky regulačné mechanizmy bunky. Rozloženie Ca²⁺ v bunke je presne regulované transportnými systémami udržiavajúcimi nízku koncentráciu voľného cytosolového vápnika ([Ca²⁺]_i) (50–100 nmol/l) v porovnaní s extracelulárnou koncentráciou Ca²⁺ (okolo 1,3 mmol/l). Vápniková homeostáza bunky je regulovaná vstupom Ca²⁺ rôznymi typmi vápnikových/katiónových kanálov plazmatickej membrány, uvoľnením Ca²⁺ z intracelulárnych kompartmentov, aktívnym prenosom Ca²⁺-ATPázami a sodíkovo-vápnikovými výmennými prenášačmi, ktorými sa Ca²⁺ transportuje do intracelulárnych zásobníkov (endoplazmatické retikulum, mitochondria, vezikuly, jadro) alebo sa odčerpáva z buniek do extracelulárneho priestoru. Prechodné zvýšenie [Ca²⁺]_i, ktorými bunka odpovedá na extracelulárne podnety, je nevyhnutným signálom pre životne dôležité procesy od krátkotrvajúcich (kontrakcia, sekrécia) až po dlhotrvajúce (regulácia rastu, proliferácia). Pri pretrvávajúcom zvýšení [Ca²⁺]_i však môže dochádzať k ireverzibilnému poškodeniu funkcií bunky a/alebo bunkových štruktúr, prípadne až k smrti bunky apoptózou alebo nekrózou. Tieto pretrvávajúce zmeny môžu byť vyvolané vlastným ochorením a/alebo farmakami, ktoré ovplyvňujú regulačné mechanizmy bunky. Niektoré bunky reagujú na určitý podnet sériou krátkodobých, pravidelne sa opakujúcich oscilácií Ca²⁺. Vtedy nie je kvantitatívnym signálom pre odpoveď bunky absolútna hodnota [Ca²⁺]_i, ale frekvencia Ca²⁺ oscilácií.

Poruchy transportu Ca²⁺ môžu byť spôsobené defektom na rôznom stupni regulácie vápnikovej homeostázy (zníženou aktivitou Ca²⁺-ATPáz, dysfunkciou vápnikových a katiónových kanálov a/alebo zmenou ich expresie). Štúdiu mechanizmov regulácie vápnikovej homeostázy excitabilných i ne­excitabilných buniek, ako aj účasti Ca²⁺ na procesoch vnútrobunkovej signalizácie, sa už dlhšiu dobu venuje zvýšená pozornosť. Z medicínskeho hľadiska je významné objasňovanie vzťahu medzi funkciou jednotlivých typov vápnikových, resp. katiónových kanálov a niektorými chronickými ochoreniami ako ateroskleróza, hypertenzia, choroby obličiek a osteoporóza, pričom sa skúmajú aj možnosti terapeutického využitia inhibítorov týchto kanálov [1].

Je známym faktom, že [Ca²⁺]_i je u hemodialyzovaných (HD) pacientov zvýšená a je modulovaná rôznymi parametrami, ktoré zahŕňajú stupeň anémie, porušenie metabolizmu vápnika a minerálov, trvanie dialyzačnej terapie [2,3]. Poznatky o vzťahu chronického ochorenia obličiek (CKD) a intracelulárnej vápnikovej homeostázy, ako aj jej regulácie, sú však nedostačujúce a vo včasných štádiách tohto ochorenia chýbajú. Cieľom našich štúdií bolo zistiť a porovnať stav intracelulárnej koncentrácie vápnika a jeho zásob, sledovať zmeny v regulácii základných mechanizmov podieľajúcich sa na udržiavaní vápnikovej homeostázy bunky, ako je funkčnosť a expresia vybraných vápnikových/katiónových kanálov, aktivita plazmatických Ca²⁺-ATPáz u zdravej populácie a pacientov s chronickým ochorením obličiek v štádiu 2–3.

Základný mechanizmus bunkovej vápnikovej homeostázy – fyziologický stav

Vápnik vstupuje do bunky z extracelulárneho priestoru v smere koncentračného gradientu rôznymi typmi kanálov. Ich priepustnosť môže byť regulovaná zmenami elektrického potenciálu plazmatickej membrány alebo informačnými molekulami. Z vnútrobunkových rezerv sú Ca²⁺ uvoľňované do cytosolu kanálmi lokalizovanými na membráne endoplazmatického/sarkoplazmatického retikula. Toto uvoľnenie Ca²⁺ nastáva po aktivácii receptora plazmatickej membrány, ktorý stimuluje tvorbu intracelulárnych poslov. Z cytosolu bunky sa Ca²⁺ odčerpáva aktívnym transportom Ca²⁺-ATPázami a sodíkovo-vápnikovými výmenníkmi do extracelulárneho priestoru a endoplazmatického retikula proti koncentračnému gradientu (obr. 1) [4].

Intracelulárna koncentrácia vápnika a CKD

Intracelulárnu koncentráciu vápnika sme sledovali v periférnych mononukleárnych bunkách (PBMCs) izolovaných z heparinizovanej krvi zdravých dobrovoľníkov a pacientov s CKD v štádiu 2–3. Už v tomto štádiu ochorenia dochádza k štatisticky významnému zvýšeniu [Ca²⁺]_i (102 ± 1 vs 125 ± 1,8 nmol/l; p < 0,001) (graf 1a), ako aj vnútrobunkových vápnikových rezerv (160 ± 16,9 vs 113 ± 7,7 nmol/l; p < 0,01) (graf 1b). [Ca²⁺]_i bola meraná fluorescenčnou spektroskopiou s použitím fluorescenčného indikátora Fluo-3 AM. Na kvantifikáciu intracelulárnych Ca²⁺ zásob bol použitý thapsigargin (Tg), inhibítor Ca²⁺-ATPázy endoplazmatického retikula [5]. Celkový status Ca²⁺ v bunke je u pacientov v skorých štádiách CKD zvýšený, čo poukazuje aj na zmenu bunkových mechanizmov podieľajúcich sa na udržiavaní vápnikovej homeostázy buniek. Ďalšou otázkou bolo, ktoré základné mechanizmy sa podieľajú na tomto stave buniek.

Vstup vápnika a CKD

Na zvýšenej [Ca²⁺]_i sa podieľa predovšetkým vtok Ca²⁺ do bunky (obr. 2) [6]. Pre neexcitabilné bunky je charakteristický vstup Ca²⁺ prostredníctvom vápnikových kanálov nezávislých od napätia, ktoré sú aktivované uvoľnením vápnika z intracelulárnych priestorov – SOC kanály. V lymfocytoch sa tento typ kanálov nazýva CRAC (Calcium Release-Activated Calcium) kanály. Vstup Ca²⁺ prostredníctvom CRAC kanálov aktivuje príslušné transkripčné faktory, čím reguluje expresiu génov pre cytokíny, ktoré sú zodpovedné za imunitnú odpoveď [7]. Dysregulácia Ca²⁺ homeostázy spôsobená zmenami funkcie práve tohto typu kanálu bola zistená pri neurodegeneratívnych ochoreniach ako Alzheimerova choroba, u imuno-deficientných pacientov, pri akútnej pankreatitíde a polycystických obličkách [8–11].

Vstup Ca²⁺ do PBMCs cez CRAC kanály bol kvantifikovaný ich nepriamou aktiváciou (uvoľnením Ca²⁺ z endoplazmatického retikula použitím Tg) a následnou inhibíciou CRAC kanálu 2APB (2 aminoetoxydifenyl borát). Vstup Ca²⁺ prostredníctvom tohto kanálu bol u CKD pacientov zvýšený v porovnaní so zdravými dobrovoľníkmi (80 ± 5,9 nmol/l vs 36 ± 2,7 nmol/l; p < 0,001) (graf 2).

Mnohé doterajšie štúdie ukázali, že na aktiváciu a proliferáciu T-lymfocytov má vplyv aj L-typ Ca²⁺ kanálov závislých od napätia [12]. Neexcitabilné bunky exprimujú Ca²⁺ kanály, ktoré majú zhodné štruktúrne vlastnosti s napäťovo-závislými Ca²⁺ kanálmi elektricky excitabilných buniek, ale neotvárajú sa zmenou membránového potenciálu. Existencia L-typu Ca²⁺ kanálov v lymfocytoch v pokojovom stave však bola potvrdená až v roku 2003 [13].

Extracelulárne puríny (adenozín, ADP a ATP) sú dôležitými signalizačnými molekulami, ktoré sprostredkovávajú rôzne biologické účinky (kontrakcia hladkých svalov, neuro­transmisia, exokrinná a endokrinná sekrécia, zápal, imunitné odpovede, agregácia krvných doštičiek, bolesť, modulácia srdcových funkcií, atď.) prostredníctvom receptorov na povrchu bunkovej membrány. Na aktivácii lymfocytov sa podieľajú purínové receptory patriace do skupiny P2X receptorov [14]. Bolo identifikovaných sedem podtypov P2X receptorov P2X₁–P2X₇ [15], pričom P2X₇ receptor je charakteristický hlavne pre bunky imunitného systému, erytrocyty, bunky obličiek, osteoblasty, hepatocyty [16].

P2X₇ receptory sú bifunkčné receptory, ktoré po aktivácii otvárajú katiónový kanál a následne neselektívny cytolytický pór. Permeabilita tohto póru závisí od typu buniek (lymfocyty – molekuly s molekulovou hmotnosťou do 320 Da, žírne bunky, makrofágy do 900 Da). Po aktivácii P2X₇ receptora dochádza k depolarizácii bunkovej membrány, vstupu katiónov (Na⁺, Ca²⁺) do bunky a výstupu K⁺ do extracelulárneho priestoru, zvyšuje sa [Ca²⁺]_i, čo spúšťa intracelulárnu signalizačnú kaskádu. P2X₇ receptory sprostredkovávajú spustenie zápalovej reakcie a jej kontrolu reguláciou expresie zápalových mediátorov. Kľúčovým faktorom P2X₇-dependentnej cytotoxicity je masívne pretrvávajúce zvýšenie [Ca²⁺]_i. Toto zvýšenie môže viesť k „blebbingu“ membrány a smrti bunky apoptózou alebo nekrózou. Vzťah P2X₇ receptorov k niektorým typom ochorení, ako reumatoidná artritída, chronická obštrukčná choroba pľúc, neurologické choroby, nefropatie, hypertenzia, chronická leukémia z B-lymfocytov, sa intenzívne študuje [17–20].

V našej štúdii sme porovnávali vstup Ca²⁺ prostredníctvom P2X₇ receptorov v PBMCs zdravých dobrovoľníkov a pacientov s CKD. Sledovanie funkčnosti týchto receptorov pozostávalo z merania účinku aktivátora a inhibítora P2X₇ receptorov na katiónový kanál a funkčnosť jeho póru, meraním fluorescencie etídia bromidu. Zistili sme, že funkčnosť „pore-forming“ P2X₇ receptorov je u pacientov s CKD zmenená [21]. Katiónový kanál aj pór sú čiastočne otvorené a nereagujú dostatočne citlivo na aktivátory a inhibítory.

Nedávne štúdie poukazujú na fakt, že P2X₇ receptory sú v bunkách odlišne exprimované za fyziologických a patologických podmienok [22,23]. V lymfocytoch pacientov s CKD v štádiu 2–3 bola expresia P2X₇ receptorov 1,3-násobne zvýšená v porovnaní so zdravými bunkami (graf 3) [24]. Na zvýšenom vstupe Ca²⁺ v PBMCs pacientov sa teda P2X₇ receptory podieľajú nielen zmenenou funkčnosťou, ale aj ich zvýšenou expresiou.

Plazmatické Ca²⁺-ATPázy a CKD

Úlohou plazmatických Ca²⁺-ATPáz (PMCA) je odčerpávať Ca²⁺ z bunky do extracelulárneho priestoru. Tento proces prebieha proti koncentračnému gradientu, preto je pre jeho uskutočnenie potrebná energia z ATP. Znížením aktivity PMCA dochádza k nahromadeniu Ca²⁺ v bunke a následne k ovplyvneniu ďalších vnútrobunkových procesov. Ca²⁺-ATPázy sú lokalizované nielen na plazmatickej membráne, ale aj na membránach ďalších intracelulárnych organel, preto sú erytrocyty najlepším modelom na štúdium vlastností plazmatickej membrány, a tým aj aktivity PMCA. Gafter et al sledovali aktivitu PMCA u pacientov s terminálnym zlyhaním obličiek, kde zaznamenali jej 50 % pokles [25]. Znížená aktivita PMCA bola zistená aj u detí s CKD v štádiu 2–4, pričom pokles aktivity PMCA inverzne koreloval s [Ca²⁺]_i [26]. V našej štúdii sme potvrdili predpoklad, že aktivita PMCA CKD pacientov v štádiu 2–3 je znížená a v porovnaní so zdravými dobrovoľníkmi klesla o 25 % (graf 4) [24]. Výsledky spomínaných štúdií svedčia o tom, že s progresiou ochorenia dochádza k poklesu aktivity PMCA.

Diskusia

Pri CKD sú poruchy vápnikového metabolizmu bežné a vyvíjajú sa už vo včasnej fáze ochorenia spolu s poruchami fosfátov, vitamínu D a následným rozvojom sekundárnej hyperparatyreózy. Viacerí autori už v minulosti predpokladali, že parathormón (PTH) je uremický toxín [27], ktorý sa v pokročilej renálnej insuficiencii podieľa na vývoji rôznych porúch ako uremická neuropatia, kardiálna dysfunkcia, poruchy imunity a iné. Túto hypotézu podporuje aj nález zvýšeného obsahu vápnika v myokarde a iných tkanivách (mozog, pankreas, polymorfonukleárne leukocyty, T bunky, krvné doštičky) v klinických [28,29] aj experimentálnych štúdiách [30,31]. Vzostup [Ca²⁺]_i indukovaný PTH v kostrovom svale a srdci je spojený so zníženou spotrebou kyslíka, čo má za následok zníženú tvorbu ATP. Pokles ATP vedie k zníženiu aktivity ATP dependentných enzýmov, ktoré sa podieľajú na transporte Ca²⁺ z bunky do extracelulárneho priestoru. Zvýšená [Ca²⁺]_i v lymfocytoch pacientov s chronickým zlyhaním obličiek je výsledkom zvýšeného vstupu Ca²⁺ do bunky a zníženého výstupu Ca²⁺ z bunky pri poklese aktivity Ca²⁺-ATPázy a Na⁺-K⁺-ATPázy [32]. Pri hodnotení viacerých parametrov Kárpáti et al zistili, že [Ca²⁺]_i v polymorfonukleárnych leukocytoch u dia­lyzovaných pacientov koreluje so zvýšenou sérovou koncentráciou intaktného PTH a fosfátov a zníženou sérovou koncentráciou vápnika [2]. Významná pozitívna korelácia sa zistila aj s dĺžkou dialyzačnej liečby. Paratyreoidektómia znižuje [Ca²⁺]_i v polymorfonukleárnych leukocytoch CKD pacientov, ale nenormalizuje ju [33]. Predpokladá sa, že okrem PTH sa na vzostupe [Ca²⁺]_i podieľajú aj ďalšie faktory.

Nie sú dostupné práce, ktoré sa komplexne a systematicky zaoberajú štúdiom mechanizmov regulácie bunkovej vápnikovej homeostázy u pacientov s CKD. Sú publikované len čiastočné sledovania u dialyzovaných pacientov. Poruchy minerálového a kostného metabolizmu, ako aj ďalšie komplikácie sa u pa­cientov vyvíjajú už vo včasných štádiách CKD. Preto sme sa zamerali na štúdium mechanizmov regulácie vápnikovej homeostázy práve u týchto pacientov. Sledovali sme mechanizmy udržiavania rovnováhy medzi vstupom Ca²⁺ do bunky a jeho odčerpávaním do extracelulárneho priestoru a/alebo do intracelulárnych rezerv. Zaznamenali sme zvýšenú [Ca²⁺]_i a tiež rezerv Ca²⁺ v endoplazmatickom retikule. Na tomto zvýšení sa podieľa zvýšený vstup katiónov vápnika do bunky prostredníctvom CRAC kanálu a P2X₇ receptorov, ktoré majú zmenenú funkčnosť a vo zvýšenej miere sa exprimujú. Okrem zvýšenia vstupu Ca²⁺ z extracelulárneho priestoru, dochádza aj k zníženiu aktivity PMCA, a tým zníženiu výstupu Ca²⁺ z bunky. Predpokladáme, že zmenená bunková homeostáza vápnika je u pacientov v skorých štádiách CKD modulovaná nielen poruchou minerálového metabolizmu, ale aj ďalšími komplikáciami, ktoré sa u týchto pacientov vyvíjajú. Dôležitou otázkou zostáva zistiť vplyv farmakoterapie používanej u týchto pacientov na jednotlivé, v súčasnosti už známe, mechanizmy vápnikovej signalizácie, čo by v budúcnosti mohlo viesť k cielenejšej terapii na spomalenie progresie renálneho ochorenia.

RNDr. Ingrid Lajdová, PhD.

www.szu.sk

e-mail: ingrid.lajdova@szu.sk

Doručeno do redakce: 18. 5. 2012