Genetické vyšetření u pacientů s hypertrofickou kardiomyopatií

Souhrn

Hypertrofická kardiomyopatie (Hypertrophic CardioMyopathy – HCM) se řadí mezi nejčastější hereditární srdeční choroby. V klasické podobě je popisována jako onemocnění způsobené mutací genů pro sarkomerické proteiny s autosomálně dominantní dědičností. Genetika HCM je však mnohem složitější. V současné době je popsáno mini­málně 27 genů asociovaných s HCM a více než 2 000 kauzálních mutací. Onemocnění HCM se vyznačuje velkou feno­typovou a genotypovou heterogenitou. Tato heterogenita, společně s neúplnou penetrancí a variabilní expresivitou, komplikuje interpretaci genetického vyšetření. Současná klasifikace nalezených genetických variant je velmi komplexní a vyžaduje spolupráci kardiologa, klinického genetika a molekulárního biologa. Genetické vyšetření je doporučováno u všech pacientů s HCM pro kaskádovitý screening příbuzných. Diagnostická výtěžnost vyšetření je však pouze 20–40 %. K lepší selekci pacientů indikovaných ke genetickému vyšetření pomáhají skórovací systémy predikující jeho výtěžnost. Budoucností genetického vyšetřování je identifikace rizikových jedinců v preklinickém stadiu a plné pochopení molekulární patogeneze onemocnění s možností cíleného ovlivnění jeho vývoje.

Klíčová slova:

genetika – sekvenování nové generace – genetické vyšetření – genotyp – hypertrofická kardiomyopatie

Historie

Na základě genetických studií z 80. a 90. let minulého století byly objeveny mutace v genech kódujících proteiny sarkomery asociované s těžkou hypertrofií LK. V roce 1990 byla popsána první mutace v genu pro těžký řetězec β-myozinu (MYH7) zodpovědná za vznik HCM [6]. Během následující dekády pak byly postupně reportovány další geny asociované se vznikem onemocnění [7]. Jejich stručný přehled uvádíme v tab. 1 a tab. 2. V současné době, tedy téměř 30 let od publikace první kauzální mutace MYH7, je popsáno více než 2 000 mutací a geny asociované s HCM postupně přibývají [8–11]. Databáze Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) uvádí aktuálně 27 kauzálních genů [12]. Ze sarkomerických genů je 8 považováno za silně asociované s HCM. Jedná se o geny MYH7, MYBPC3, TNNI3, TNNT2, TPM1, ACTC1, MYL2, MYL3 [1,13], které jsou blíže popsány v tab. 1. Toto spektrum sarkomerických genů bylo postupem času rozšířeno i na nesarkomerické geny kódující např. desmosomální proteiny či iontové kanály [14,15]. Ačkoli je HCM je především onemocněním sarkomerických proteinů, genetický podklad je zřejmě složitější. Mutace genů pro sarkomerické proteiny jsou totiž kromě HCM dále asociovány s dilatační kardiomyopatií (DCM), restriktivní kardiomyopatií (RCM) i nonkompaktní kardiomyopatií (LVNC) [16,17].

Sekvenování nové generace

Pro pacienty s HCM je charakteristická velká fenotypová i genotypová heterogenita. Heterogenita HCM komplikuje genetické vyšetření jak z hlediska časové, tak i finanční náročnosti [18,19]. Dříve bylo molekulárně genetické vyšetření možné pouze ve výzkumných centrech, byly vyšetřovány rodiny se zjevnou dědičnou HCM a nákladné vyšetření DNA zahrnovalo pouze několik genů s nejsilnější asociací s HCM. V posledních 2 dekádách byla vyvinuta řada metod označovaných jako tzv. sekvenování nové generace (Next Generation Sequencing – NGS). Jedná se o vysokokapacitní metody, které v porovnání s klasickými metodami sek­venování (např. Sangerova metoda) umožňují analýzu velkého množství genetického materiálu rychleji a levněji. NGS využívá principu paralelizace procesu sekvenování, umožňuje sekvenování tisíců až milionů vláken DNA současně. Kromě klasických vyšetření genetické variability, mutační analýzy konkrétních genů a kvantifikace jednotlivých alel je pomocí NGS možné vyšetřit celý exom (Whole Exome Sequencing – WES), případně provést i celogenomové sekvenování (Whole Genome Sequencing – WGS). Výsledkem NGS je produkce obrovského množství výstupních dat s následnou potřebou data utřídit a analyzovat. Vyšetřování velkého množství genů má totiž za následek nálezy velkého množství tzv. variant nejasného významu (Variants of Uncertain Significance – VUS) [19,20] a ztěžuje tak interpretaci výsledku genetické analýzy, jak bude popsáno dále v textu. Výhodou NGS je naopak díky relativně nízké ceně a rychlosti vyšetření jeho postupné rozšíření do klinické praxe.

Klasifikace genetických variant

Pro klinické využití molekulárně-genetického vyšetření má zásadní význam klasifikace nalezených variant. Vzhledem k velkému množství výstupních dat je v současnosti používán kombinovaný přístup, jehož podkladem jsou následující údaje:

• frekvence variant v kontrolní populaci s využitím mezinárodních databází (např. 1 000 Genomes Project, Exome Sequencing Project, Exome Aggregation Consortium) [21–23]
• publikované varianty asociované s onemocněním (např. Clinvar, Human Gene Mutation Database) [24,25]
• in silico klasifikace s užitím softwaru (např. Polyphen 2, Sorting Intolerant From Tolerant) predikujícího možný dopad mutace na strukturu a funkci výsledného proteinu
• mutace v tzv. evolučně vysoce konzervovaných funkčních doménách proteinů
• segregační analýzy genotypu s fenotypem v postižených rodinách (silná evidence)
• funkční studie na animálních modelech či in vitro (nákladné, složité)

V roce 2015 byla publikována doporučení pro klasifikaci genetických variant Americkou společností pro lékařskou genetiku a genomiku (American College of Medical Genetics and Genomics – ACMG) [26], která vychází z výše uvedených principů. Tato klasifikace dělí nalezené varianty do 5 následujících tříd:

• benigní
• pravděpodobně benigní
• VUS – varianta nejasného významu
• pravděpodobně patogenní
• patogenní

Genetický screening

Genetický screening má v péči o pacienty s HCM a jejich příbuzné významné postavení. Standardním postupem je získání detailní rodinné anamnézy (alespoň 3 generace) a molekulárně-genetické vyšetření probanda se zaměřením na minimálně všechny známé geny asociované s HCM dle databáze OMIM [12]. Pokud je klinické podezření na specifickou příčinu či HCM v rámci komplexního syndromu, pak je vhodné panel rozšířit (tab. 2).

V případě pozitivního nálezu poté provedeme specifické vyšetření prvostupňového příbuzného na konkrétní gen a mutaci již nalezenou u probanda. Pokud je i u příbuzného zachycena patogenní mutace, je možné kaskádovité vyšetření dalších příbuzných (vzhledem k převažující AD dědičnosti). Detailní rodinná anamnéza a sestavení rodokmenu nám pomůže odhalit pravděpodobně dědičnou příčinu onemocnění a obvykle stanovit i typ dědičnosti. Je možná genetická analýza post mortem tkáňových vzorků s kaskádovitým screeningem příbuzných. Relativně častým nálezem u HCM rodin jsou tzv. privátní mutace, tedy takové, které jsou specifické pro konkrétní rodinu nebo malou populaci pacientů. Hlavní klinickou výhodou je, pokud specifická příčinná mutace u probanda není nalezena u prvo­stupňového příbuzného. Příbuzného je pak možno vyřadit z dispenzarizace, pravděpodobnost onemocnění je nízká, nicméně de novo mutace jsou samozřejmě možné. Vždy proto v případě symptomatologie upozorňujeme pacienty na nutnost návštěvy lékaře. Vyšetření dětí je podle současných doporučení vhodné okolo 10. roku věku [1]. Hranice byla stanovena na základě pediatrických studií, které ukázaly raritní výskyt závažných komplikací HCM před nástupem puberty [27,28].

Pokud je molekulárně genetické vyšetření u probanda negativní, pokračujeme v zavedeném pravidelném klinickém sledování prvostupňových příbuzných dle aktuálních doporučení. U HCM se jedná o echokardiografické vyšetření, 12svodové EKG, holterovskou EKG moni­toraci, bicyklovou ergometrii, u vybraných pacientů (obvy­kle při nedostatečné echokardiografické vyšetřitelnosti) zobrazení srdce magnetickou rezonancí, případně u mladých pacientů s časným nástupem onemocnění screening metabolických chorob [1,29].

Opačnou klinickou situací je klinicky negativní fenotyp příbuzného s nálezem patogenní mutace. Na rozdíl od DCM, při níž je např. mutace v genu LMNA spojena s nepříznivou prognózou a je dokonce dle ESC guidelines součástí indikace k implantaci ICD [30], u HCM nemáme k dispozici dostatek dat o vývoji onemocnění u asymptomatických nosičů mutací bez klinicky vyjádřeného fenotypu. Riziko náhlé srdeční smrti je u jedinců bez vyjádřené hypertrofie obecně nízké. Výjimkou mohou být mutace v TNNT2, jak naznačují některé publikace [31,32], nicméně se nejedná o silné důkazy. Není jednoznačné, zda pouze na základě pozitivního genotypu bez vyjádřeného fenotypu (G+/F-) činit specifická doporučení a navrhovat omezení, např. u profesionálních atletů [10,33,34]. Většina (G+/F-) pacientů má totiž pravděpodobně příznivou prognózu [1,34–36]. Vzhledem k variabilní penetranci, která je věkově vázaná (55 % do 30 let věku až po 95 % nad 50 let věku [37]), je však nutno pokračovat v pravidelném klinickém sledování těchto jedinců [38].

Obecně vzato, genetické vyšetření je vhodné u všech HCM pacientů s cílem umožnit kaskádovitý screening příbuzných probanda [1]. Jeho hlavní přínos tedy obvykle nespočívá ve zpřesnění diagnostiky HCM (např. u atletického srdce či arteriální hypertenze), protože negativní výsledek neznamená vyloučení diagnózy HCM. Pokud jsou však přítomny neobvyklé symptomy či známky suspektní ze specifické příčiny (např. syndromy, metabolická onemocnění), lze genetické vyšetření využít ke stanovení definitivní diagnózy. Nezbytnou podmínkou je provádění v expertních centrech se zkušenostmi s molekulárně-genetickým vyšetřováním a jeho klinickou interpretací. Mezioborová spolupráce je nevyhnutelná. Bez ohledu na použitou metodu by měla genetická analýza vždy zahrnovat nejčastější sarko­merické geny (tab. 1). V případě příznaků ukazujících na možné vzácnější příčiny je nutné vyšetřit i další geny (tab. 2).

Diagnostická výtěžnost genetického vyšetření

Diagnostická výtěžnost genetického vyšetření (tj. záchyt patogenní mutace) je velmi variabilní a relativně nízká. Pravděpodobnost záchytu patogenní mutace je obecně vyšší u mladších pacientů a pacientů s pozitivní rodinnou anamnézou (může dosahovat 50–60 %) [1]. U ostatních pacientů se pohybuje maximálně okolo 30–40 % [3] a se zavedením přísnějších klasifikačních kritérií ACMG je záchyt ještě nižší [26,39,40]. Vysoká senzitivita genetického testování s nástupem metod NGS tak byla postupně vystřídána vyšší specificitou související s aplikací komplexních klasifikačních kritérií. Ukazuje se, že genetická data a klasifikaci patogenních mutací z minulých dekád bude vhodné revidovat v kontextu současných poznatků [26].

Relativně nízká výtěžnost genetického vyšetření si vyžádala vznik klinických skórovacích systémů pro predikci jeho pozitivity. Nejznámějším a pravděpodobně nejpřes­nějším je tzv. Mayo HCM Genotype Predictor score (Mayo Score), který je založen na základních klinických a echokardiografických parametrech a byl poprvé publi­kován v roce 2014 [41]. Mezi prediktory výtěžnosti gene­tického vyšetření patří: věk < 45 let, tloušťka stěny levé komory ≥ 20 mm, rodinná anamnéza HCM, rodinná anamnéza náhlé srdeční smrti a tzv. reverzní (katenoidní) tvar septa. Negativním prediktorem je pak přítomnost arteriální hypertenze. V původní kohortě pacientů dosahovala celková výtěžnost genetického vyšetření 34 % při vyšetřování 9 genů pro sarkomerické proteiny (ACTC1, MYBPC3, MYH7, MYL2, MYL3, TNNC1, TNNI3, TNNT2, TPM1) [41]. S rozvojem NGS se v současné době použité panely genů mohou výrazně lišit v počtu a typu jednotlivých genů v závislosti na lokální dostupnosti a finančních možnostech pracovišť.

Na Kardiologické klinice 2. LF UK a FN Motol, Praha byla provedena genotypizace rozsáhlého souboru českých pacientů s HCM a validace Mayo Score za použití nejnovějších klasifikačních kritérií patogenních variant dle ACMG [40]. V naší práci jsme použili ke genetickému vyšetření panely obsahující až 229 genů asociovaných se srdečními onemocněními [40], které byly vytvořeny na zakázku. Všechny naše panely genů samozřejmě obsahovaly i 9 genů vyšetřovaných v původní Mayo Score publikaci. Celková výtěžnost genetického vyšetření činila pouhých 21 % [40]. Tuto nízkou výtěžnost si vysvětlujeme použitím přísných ACMG kritérií [26], která v době publikace Mayo Score práce nebyla k dispozici. V roce 2016 autoři Mayo Score publikovali validační studii své původní práce [42]. Ve validační studii byl genetický test považován za pozitivní (G+), pokud byla genetická varianta klasifikována jako patogenní, pravděpodobně patogenní nebo VUS [42]. Pokud bychom stejný postup (tj. zahrnutí VUS do pozitivního vyšetření) použili i v našem souboru HCM-pacientů, výtěžnost genetického vyšetření by stoupla na 42 % [40]. Ve všech zmiňovaných případech Mayo Score konzistentně predikuje genetickou výtěžnost. Jeho použití se jeví v klinické praxi, v níž je patrna limitace finančními prostředky, jako racionální. Vzhledem k časové náročnosti molekulárně-genetického vyšetření (obvykle měsíce) tak lze pečlivou selekcí pacientů zamezit velkému množství negativních výsledků a nad­užívání metody NGS.

Vztah fenotypu a genotypu

Genetická heterogenita HCM je obrovská [8–10]. Většina dosud publikovaných genů asociovaných s HCM kóduje sarkomerické proteiny [13,43]. Pouze relativně malá část identifikovaných mutací je klasifikována jako patogenní či pravděpodobně patogenní, některé z nich jsou tzv. privátní mutace a tedy není možná korelace genotyp-fenotyp na větším souboru pacientů [9,10,26]. S dostupností NGS můžeme vyšetřovat stále větší množství genů. Výsledkem těchto vyšetření pravděpodobně není větší záchyt patogenních mutací, ale záchyt většího množství VUS, jejichž interpretace je na základě dostupných dat často svízelná a k jejich definitivnímu zařazení bude potřeba více korelovaných geno­typů s fenotypy a provedení segregačních analýz [19,20]. Užitečnou veřejně dostupnou databází pro reportování mutací a jejich vztahu k fenotypu je např. ClinVar [24].

Data pro vztahy genotyp-fenotyp jsou zatím nedostatečná. Některé práce ukazují, že nález patogenní mutace (G+) u HCM pacientů zhoršuje kardiovaskulární mortalitu, zvyšuje riziko cévní mozkové příhody a progrese symptomatologie ve třídě NYHA ve srovnání s genotyp-negativními (G-) pacienty [31]. Většina publikovaných dat o vztahu konkrétních mutovaných genů a závažnosti fenotypu je na relativně malém počtu pacientů z jednoho centra. V dětském věku byla popsána asociace mutace MYH7 s časným nástupem onemocnění a rizikem kardiovaskulárních příhod (Major Adverse Cardiac Events – MACE) [44]. Recentně (prosinec roku 2018) publikovaná data z portugalského registru dospělých HCM-pacientů naznačují asociaci mutace ve stejném genu se systolickou dysfunkcí LK [45]. V tomto relativně rozsáhlém registru nemocných s HCM (528 pacientů bylo geneticky vyšetřeno) byl nález jakékoli pato­genní mutace (G+) asociován s vyšším rizikem náhlé srdeční smrti [45].

Dalším důležitým faktorem v interpretaci nálezů je neúplná penetrance a variabilní expresivita, která je pro HCM typická. Není výjimkou, že naprosto identické mutace stejných genů i ve stejné rodině vedou ke zcela odlišnému fenotypu. To naznačuje, že roli v dlouhodobém klinickém průběhu onemocnění mají i jiné faktory než pouze mutace na úrovni sarkomerických proteinů. Tyto další genetické a epigenetické faktory, stejně jako modifikace environmentální, pravděpodobně hrají důležitou roli, kterou zatím neumíme uspokojivě charakterizovat. Pokud tedy hovoříme o HCM jako onemocnění s autosomálně dominantní mendelovskou dědičností, jedná se o výraznou (a nejspíše nepravdivou) simplifikaci [46–48]. Mezi genetické modifikátory se řadí obvykle metylace a acetylace DNA, v poslední době se diskutuje význam miRNA [11]. Je možné, že nově objevené varianty nesarkomerických genů, např. pro iontové kanály, desmosomy či titin, nejsou primární příčinou HCM, nýbrž právě zmiňovanými modifikátory [14,49].

V klinické praxi, vzhledem k její prevalenci, je častá koincidence HCM s arteriální hypertenzí. Hemodynamický stav při arteriální hypertenzi nutně modifikuje feno­typ HCM. Setkáme se též s pacienty s těžkou aortální stenózou, konkomitantní arteriální hypertenzí a HCM. Fyzická zátěž, životní styl, a kromě arteriální hypertenze i další komorbidity jako např. diabetes mellitus, obezita a chronická renální insuficience vedou nutně též k modifikaci výsledného fenotypu HCM. Obezita a arteriální hypertenze jsou asociovány s větším objemem myokardu LK. Obezita je dále asociována s arteriální hypertenzí a rovněž i diabetes mellitus, tedy je v klinické praxi často nemožné rozlišit, co je skutečnou příčinou či hlavním modifikátorem hypertrofie LK. V současné době je velmi zkoumaným onemocněním tzv. senilní (wild-type transtyretinová) amyloidóza, u které se předpokládá relativně vysoká prevalence a poddiagnostikování choroby v běžné populaci [50]. V terénu všech výše uvedených komorbidit je stanovení etiologie hypertrofie LK svízelné. Nález VUS při genetickém vyšetření, do kterého jsme předtestově vkládali neadekvátní očekávání, nás v diagnostice příliš neposune. Hlavním klinickým přínosem genetického vyšetření tedy nadále zůstává možnost kaskádovitého vyšetřování příbuzných (v případě VUS) a provedení segregačních analýz, nikoli „zpřesňování“ diagnostiky probanda. Výsledek genetického vyšetření v populaci příbuzných má zásadní vliv na další sledování, méně často vede k diagnostice před klinickou manifestací choroby. Znovu je třeba zopakovat, že nález patogenní mutace nutně nemusí znamenat rozvoj HCM. V populaci mladých sportovců zůstává zásadním klinickým nástrojem pro odlišení sportovního srdce od HCM echokardiografické a EKG vyšetření [51].

Budoucnost

Objasnění genetické příčiny srdečních onemocnění otevírá příležitost plně pochopit patogenezi onemocnění a v budoucnu i uvažovat o jeho specifické léčbě. Dlouhodobým cílem genetického vyšetřování je identifikace rizikových jedinců ještě před klinickou manifestací choroby. Pokud budeme schopni charakterizovat jasnou příčinu na úrovni molekulárně-genetické, kromě pochopení patogeneze budeme moci uvažovat o cílené modifikaci těchto příčin. V experimentálních studiích na myších již byly některé mutantní alely „utlumeny“ pomocí interferující RNA [52]. Tyto „mutation-silencing therapies“ pravděpodobně nejsou efektivní v regresi již rozvinuté hypertrofie a k zamezení rozvoje onemocnění by bylo potřeba je aplikovat ve velmi časných stadiích života jedince [53].

Recentní rychlý rozvoj technik tzv. editace genomu a jejich aplikace na animálních modelech slibuje nadějné možnosti modifikace i humánních zárodečných mutací. Nejvíce diskutovaný je v současnosti (i z etického pohledu) systém CRISPR-Cas9. Jedná se o užitečný nástroj pro rozpoznávání specifických sekvencí genomu s následnou indukcí tzv. double-strand breaks (DSBs) [54]. V srpnu roku 2017 byla v časopisu Nature publikována „oprava“ zárodečné mutace v genu MYBPC3 u lidského embrya pomocí systému CRISPR-Cas9 s následnou indukcí endo­genní DNA reparace v preimplantační diagnostice [55]. Z etického hlediska je možnost editace lidské zárodečné linie přinejmenším kontroverzní. Zvláště u HCM, s přihlédnutím k neúplné penetranci a variabilní expresivitě, bude od preimplantační či jiné prenatální diagnostiky např. k umělému přerušení těhotenství jistě komplikovaná cesta. Nález patogenní mutace i jinak zdravého embrya či plodu totiž nemusí znamenat rozvoj onemocnění během života a i v případě rozvoje HCM je klinický průběh variabilní a prognóza je u většiny pacientů téměř srovnatelná s běžnou populací [36].

Závěr

Pro HCM je charakteristická výrazná nejen fenotypová, ale i genotypová variabilita. Při genetickém vyšetření současnými metodami NGS u více než poloviny pacientů nezachytíme žádnou významnou mutaci [40]. S moderními metodami přichází možnost vyšetření velkého množství genů, včetně WES i WGS. Objem těchto dat, zejména interpretace VUS, si vyžaduje úzkou spolupráci kardiologa, molekulárního biologa a klinického genetika. Faktory ovlivňující rozvoj HCM u genotyp negativních pacientů (G-/F+) i asymptomatických nosičů mutací (G+/F-) dosud nejsou uspokojivě vysvětleny. K plnému porozumění vztahu genotyp-fenotyp, vlivu genetického pozadí a komorbidit na rozvoj a průběh onemocnění by bylo potřeba rozsáhlých genetických studií na velkých souborech příbuzných pacientů. I přes relativně vysokou prevalenci onemocnění toho bude možno dosáhnout pouze mezinárodní spoluprací velkých center, standardizace podrobného genetického vyšetřování a mezioborovou spoluprací kardiologů, klinických genetiků a molekulárních biologů.

Podpořeno z programového projektu Ministerstva zdravotnictví ČR s reg. č. 15–34904A.

Doručeno do redakce 29. 3. 2019

Přijato po recenzi 23. 9. 2019

MUDr. Jiří Bonaventura

jiri.bonaventura@fnmotol.cz

Kardiologická klinika 2. LF UK a FN Motol, Praha

www.fnmotol.cz