Kapalné biopsie se přibližují rutinním klinickým laboratořím

Súhrn

Sdělení pojednává o možnostech využití velkého potenciálu kapalných biopsií při diagnostice a terapii tumorů v podmínkách rutinních klinických laboratoří. Jde o stanovení cirkulujících DNA (cfDNA a ctDNA) a snad i miRNA. Pro tyto metody se významně rozvíjí produkce a používání komerčních kitů (CDx/IVD). To vytváří podmínky pro jejich aplikaci v rutinních klinických laboratořích. Hlavními výhodami kapalných biopsií je jejich nízká invazivnost, podmiňující možnost častého použití podle potřeb pacientů a kliniků. Metody kapalné biopsie by se měly společně s aplikací big dat, genomiky (metod PCR a NGS), digitalizací diagnostiky („machine learning“) podílet na zásadním převratu v práci rutinních klinických laboratoří a laboratorních profesionálů. A také na vstupu rutinních laboratoří do oblasti precizní, na pacienty orientované medicíny. V práci jsou stručně uvedeny problémy harmonizace kapalných biopsií a informace o úrovni mezilaboratorní a mezimetodické srovnatelnosti.

Klíčová slova:

Kapalné biopsie – genomika – PCR – NGS – cfDNA – ctDNA – miRNA

Kapalné biopsie k diagnostice a monitorování terapie tumorů jsou nesporným kandidátem na brzké rutinní používání genomiky, big dat a metod digitalizované strojové diagnostiky („machine learning“, „deep learning“) v klinických laboratořích. Podstatou této skupiny metod je hodnocení mutací některých genů metodami PCR nebo NGS. Již několik let existují postupy, použitelné nejen pro analýzu tkáňových vzorků v laboratořích patologií, ale také pro klasické laboratorní vzorky tělních tekutin (krevní plasmy a dalších). Jsou známé jako kapalné biopsie (liquid biopsies) a k jejich praktickému využívání je k dispozici již nezanedbatelné množství literatury a zkušeností. Jaké jsou jejich zásadní výhody? Nízká invazivita pro pacienty a možnost častého opakování podle klinických potřeb. Metodologie kapalných biopsií a jejich klíčové analyty jsou uvedeny v Tabulkách 1 a 2. Za první přehlednou, instruktivní práci o principech a perspektivách kapalných biopsií lze považovat článek Maderové a Pantela [1].

Klíčovým faktorem k možnosti aplikace kapalných biopsií v rutinních laboratořích je stav vývoje diagnostických testů výrobců-CDx (companion diagnostics test), uvedených na trh a validovaných FDA, analogických IVD-In Vitro Devices v zemích EU. První (od roku 1998) využívaly metod imunohistochemie a byly určené k testování vzorků tkání, od roku 2016 to již byly kapalné biopsie, nejprve s hodnocením mutací genů EGFR a PIK3CA a pak i dalších (KRAS a jiné) ve vzorcích krevní plasmy [2]. Teprve masová produkce CDx (IVD) kitů umožní intenzivní používání kapalných biopsií v rutinní laboratorní praxi. Momentálně můžeme pozorovat nedořešení administrativních problémů s kity CDx/IVD v zemích EU, kde nebyl dosud vypracován způsob jejich značení CE, bez kterého není možný přístup na trh.

Diskuse expertů kapalné biopsie v časopise Clin Chem [2] shrnuje jejich aktuální problémy následně:

-    Potřeba standardizace preanalytické fáze, která je zde extrémně náročná

-    Harmonizace mezi výsledky testů v tkáních a kapalnou biopsií

-    Harmonizace mezi jednotlivými kity různých výrobců CDx (vlivy hodnot LoD, matricí vzorků, kalibrace metod)

-    Nezbytnost kooperace s geneticky vzdělanými pracovníky při interpretaci výsledků

Experti jednoznačně předvídají velký potenciál rutinního používání kapalných biopsií.

Metody, analyty, vyšetření

Jsou stručně shrnuty v Tabulkách 1-3. Metody vyžadují pořizování přístrojových platforem pro metodiky k provádění genomických vyšetření na bázích PCR nebo NGS, na jejichž obsluhu sice nejsou pracovníci rutinních klinických laboratoří ani školeni, ani cvičení, nicméně, které jsou už řadu let používány na mikrobiologických, genetických, patologických a zejména pak na mnoha soukromých pracovištích vcelku běžně. Zkušenosti s platformami Taqman (PCR), Illumina (NGS) a podobnými jsou již letité a běžně dostupné v dokumentaci výrobců (Roche, Thermo Fisher, Bio-Rad, Abbott). Jen je třeba se o ně zajímat co nejaktivněji. V tabulce 2 jsou uvedeny hlavní entity vyšetřování kapalných biopsií. Zdá se, že v současnosti jsou nejnadějnější cfDNA a specifičtější, ale vlivem nižší analytické senzitivity obtížnější ctDNA. V tabulce 3 je pak orientační přehled genů, jejichž mutace jsou obvyklým cílem kapalných biopsií. Většinou se pracuje s 1-4 geny, které se osvědčily již při biopsiích tkání. Větší počet hodnocených genů je spíš doménou NGS metod (targeted), jinak postačí techniky PCR. Je řada důvodů pro nasazení těchto metod do rutinního používání a situace kolem Covid-19 ukázala víc, než názorně, že čas pro to je již dávno tady.

Preanalytika

Zásadní podmínkou úspěšnosti metod kapalné biopsie je dosažení dostatečné úrovně harmonizace a ta zde začíná velkými nároky na preanalytickou fázi:

-    Potřeba speciálních odběrových zkumavek: typy PAXgene, Roche, Streck, Norgen, CellSave [3]

-    Podmínky centrifugace (rychlost, doba) jsou klíčové a nestejné pro různé analyty [4]

-    Počty trombocytů a podmínky skladování vzorků velmi silně ovlivňují stanovení cfDNA i miRNA [5]

-    Ani odběrové zkumavky, jmenovitě určené pro odběr kapalných biopsií nejsou zárukou dostatečné srovnatelnosti a jejich testy neposkytují u různých autorů totožné výsledky [3, 6]. Podle nejkomplexněji vypadající studie [5] byly nejstabilnější odběry do zkumavek Norgen (jak pro miRNA, tak pro cfDNA). Další srovnávané byly PAX, Roche, Streck.

-    Silně ovlivňujícími faktory byly metody extrakce ze vzorku biologického materiálu, druhy použitých antikoagulancií, hemolýza, trombocytóza, zatímco vliv použitých metod PCR nebyl tak velký [7].

-    Vysoce signifikantní diference jsou mezi sérem a plasmou, plasma je vhodnější; podrobně studováno nedávno u stanovení ctDNA [8].

CellSearch

Jedná se o více než 15 let fungující, průběžně inovovaný systém detekce a kvantifikace cirkulujících tumorových buněk (CTC), pocházejících z epitelových tkání. Jde o první funkční test kapalných biopsií, navíc s certifikací FDA. Tumorové buňky jsou separovány imunomagneticky a detekovány fluorescenční reakcí. Metoda se uplatnila zejména při detekci metastáz karcinomu prsu a kolorektálního karcinomu. Systém má podobu poloautomatické platformy [9].

Podrobná analýza struktury a složení cirkulujících tumorových buněk CTC je publikovaná v recentní práci [10]. Práce popisuje jejich genomiku (sedm genů), proteomiku (proteiny jejich povrchových membrán) a transkriptomiku (jejich miRNA).

Cirkulující volná DNA (cfDNA)

Na webových stránkách IFCC www.ifcc.org lze od září 2019 vyhledat údaje o pracovní skupině WG-cfDNA (cell-free DNA and related circulating biomarkers), která má přímou souvislost s problémy realizace kapalnými biopsiemi a seznámit se s jejími plány činnosti. Jde o harmonizaci preanalytiky, formulaci analytických požadavků a na tvorbu programů EHK. Samotný fakt ustanovení této pracovní skupiny silně podporuje domněnku, že rutinní provádění kapalných biopsií se blíží.

Důležité informace o cirkulujících tumorových buňkách a s nimi souvisejících nukleových kyselinách (cfDNA, ctDNA, miRNA) jsou k nalezení v databázích na adresách:

-    www.cancer-id.eu (cancer treatment and monitoring through identification of circulating tumour cells and tumor relating nucleic acids in blood)

-    www.nci.gov (US National Cancer Institute. Liquid Biopsy 2019)

Tyto a podobné databáze budou zřejmě patřit k základním pracovním nástrojům laboratorních profesionálů, kteří budou kapalnými biopsiemi a vůbec aplikacemi genomiky pověřováni.

Perspektivy, srovnání, multicentrické studie

Certifikovaný referenční materiál pro metabolomiku SRM-NIST 1950 obsahuje referenční hodnoty pro řadu analytů: substráty, elektrolyty, stopové prvky, aminokyseliny, hormony, vitaminy, mastné kyseliny, získané metodami hmotnostní spektrometrie. Materiál byl prověřen několika velkými multicentrickými studiemi, zahrnujícími 189 analytů a shledán cenným. Medián hodnoty preciznosti pro celý soubor laboratoří a všech analytů byl CV% = 6,7. U 83 % měření bylo dosaženo hodnot CV% ≤ 20 a u 82 % měření systematické chyby ≤ 20 % [11].

Grail testy firmy MDDI (Menlo Park US) mají za cíl vyvinout metody detekce až 12 druhů karcinomů kapalnou biopsií v séru a 20 druhů tkáňovou biopsií na bázi metylace cfDNA. Součástí plánu je tvorba databáze CCGA-Circulating Cell-free Genomic Atlas, nezbytné pro interpretaci výsledků [12].

Na webovýh stránkách německého Refererenčního institutu v Bonnu (http://www.dgkl-rfb.de) jsou volně dostupné výsledky programu EHK ctDNA. Provádí se dvakrát ročně. Testují se tři mutace EGFR, BRAF, KRAS. Počet účastníků 2019 se pohyboval mezi 22-31 ze 7-9 zemí [13].

Porovnání metod NGS a dPCR (digitální PCR) pro detekci devíti mutací genů u plicního karcinomu (EFGR, KRAS, BRAF, PIK3, ALK, TP53, MAR2K, ERBB2, MET) ukázalo velmi dobrou shodu hodnocení u obou metod [14].

Další recentní evropská multicentrická studie stanoveni cfDNA důkladně srovnávala výsledky při použití dvou typů odběrových zkumavek (Streck, PAX), devíti způsobů extrakce DNA, čtyř metod vlastního měření (2x ddPCR a 2x NGS). Výsledky jsou zamýšleny jako základ budoucího EBM doporučení o preanalytických a analytických postupech stanovení cfDNA. Studii organizovala Innovative Medicines Initiative Consortium CANCER-ID (http://cancer-id.eu). Podílelo se na ní 32 evropských autorů, materiály byly poskytnuty biobankou IBBL, Luxemburg [15].

Velmi zajímavý a extrémně důležitý pro představu o současné úrovni kvality stanovení je program externího hodnocení kvality s účastí 92 australských a čínských laboratoří od výzkumných pracovišť k laboratořím rutinním [16]. Bylo použito pěti kontrolních vzorků s obsahem, čtyř genů (EGFR, HRAS, NRAS, BRAF) a šesti jejich genotypů Pro hodnocení bylo jako indikátoru kvality použito hodnot Z-skóre. 71 laboratoří použilo metodu NGS, 18 metodu dPCR, dvě zbývající metodu microassay-čipové analýzy. Shodnost výsledků byla v intervalu 92, 5-98, 3.

Další přehled metod cfDNA s důrazem na možné chyby preanalytické fáze, řešené odběrem do speciálních zkumavek (viz výše), na možné chyby metody ddPCR (Bio-Rad), na chyby při extrakci DNA u hodnocení důležitých genových mutací (BRAF, EBV, EGFR, ESR, HRAS, TP53, PIK 3CA) je uveden v review [17].

V séru bylo zatím identifikováno přes 2800 miRNA. Složitost interpretace multiplexních analýz v séru použitím RTqPCR vyhodnocené 566 miRNA patrně vyžaduje použit k optimalizaci vyhodnocení náročných počítačových programů typu „machine learning“ i „deep learning“ [18]. Tyto problémy by měly být vzaty do úvahy, jak reagovat na počínajícím úsilí některých výrobců stanovení miRNA nabízet.

V tabulce 4 jsou shrnuta data, potřebná k standardizaci a srovnatelnosti výsledků miRNA [19]. Řešení problémů standardizace miRNA je stále na počátku a zejména chybí zatím obecně akceptovaný standardizační postup a obecně akceptované referenční geny [20].

Vcelku lze říci, že z hlediska harmonizace a srovnatelnosti je sice nutno vykonat řadu práce, ale prozatímní výsledky jsou nadějné.

Kapalné biopsie v rutinních klinických laboratořích

Proč by měly být metody kapalné biopsie bez velkého zdržování zařazeny do repertoáru aspoň větších rutinních klinických laboratoří? Tvoří součást procesu digitalizace laboratorní medicíny. Na používání big dat, jejich velkého množství, zpracovaného za použití „umělé inteligence“ programy, které jsou již dobře vyzkoušeny. Tvorba EHR-electronic health results jako nástroje diagnostiky a terapie. Doposud byla laboratorní data v obrovském počtu obvykle bez užitku skladována (a ztrácena). Zpracování big dat do podoby diagnostického nástroje je primárně podmíněné jejich obrovským počtem, získávaným zejména genomickými metodami (obzvláště metodami NGS) a sekundárně právě možností jejich zpracování pomocí metod AI (arteficial intelligency). V současnosti je možné vyústění big dat do programů strojové diagnostiky - „machine learning“nebo do sítě biomarkerů  „deep learning“. Všechno to je pak nezbytným nástrojem precizní medicíny, kam kapalné biopsie nepochybně patří [21-23].

Je také logické a nebezpečné, že v případě nezájmu o tyto metody se vždy najdou subjekty, které využijí situace k realizaci svých komerčních zájmů, subjekty, od nichž nemůžeme očekávat kooperaci s klinickými pracovišti [22]. Tato skutečnost by měla znít našim laboratořím důvěrně známě. A údaje Tabulek 5 a 6 zřetelně ukazují, že digitalizace medicíny a laboratoří nejsou zdaleka již záležitostí exkluzivní, určené pouze pro zvídavé jedince, ale právě naopak faktem, indikujícím budoucnost, rozvoj a životaschopnost rutinních klinických laboratoří.

Limitujícím faktorem je dosavadní profesionální a odborné zaměření laboratorních profesionálů, jehož reálný stav a odbornou způsobilost v oblasti digitalizace a genomiky je dost troufalé predikovat. Nicméně na druhé straně je jasné, jaký typ pracovníků (zejména mladých) bude v laboratořích nezbytný, aby bylo držení kroku s požadavky velmi blízké budoucnosti vůbec možné.

Převrat v laboratorní medicíně, sestávající z aplikací big dat, genomiky (včetně kapalných biopsií, zásadní digitalizace a ustanovení precizní medicíny, je již cca 3 roky brán jako vývojový trend, který je nezbytné respektovat. Soudobý přístup k laboratorní medicíně v ČR, založený na číselníku metod, sdílení kódu pojišťoven, atomizaci na autonomní podobory, je beznadějně zastaralý a v příkrém rozporu s tímto trendem.

Několik zajímavých aplikací v klinické praxi

Velmi dobře se metoda stanovení cfDNA uplatňuje při screeningu Downova syndromu [24, 25]. Ve srovnání se standardní metodou screeningu se při použití cfDNA (metoda NGS Illumina) snížila falešná pozitivita na 0,3 % z původních 3,6 % a hodnota NPV byla prakticky 100 %. Bylo dosaženo četnosti použití cfDNA u 50 % pacientů oblasti Rhode Island (Providence). První provedený cyklus EHK (CAP US) měl 59 participantů, 70 % z nich použilo metody NGS. Bylo zaznamenáno velké zlepšení diagnostiky [26].

Velmi zajímavá je korejská práce o měření ctDNA metodou ddPCR (droplet digital PCR) po předchozí extrakci cena, jehož je ctDNA částí [8]. Byla použita metoda ddPCR výrobce Bio-Rad a hodnoceny mutace genu KRAS. Popisuje jasnou prioritu použití EDTA plasmy vůči séru při paralelních analýzách u stejných pacientů ve stejných časech.

Etické problémy metod kapalné biopsie

Mají souvislost s  aplikací umělé inteligence a big dat [21, 22] i s riziky, která s oběma přístupy běžně souvisí. S možností zneužití dat a s neosobním, nehumánním přístupem k pacientům. Z aspektů, které nejčastěji patří do řešení etických rizik, uvádíme [27]:

-    Použité zařízení a postupy jsou přístupné nezávislému testování

-    Eliminace zneužití reklamy pro jiné, než zdravotnické potřeby

-    Ochrana osobních dat pacientů při práci s big daty

Procesy digitalizace jsou nezastavitelné, schopné poskytovat velký benefit pacientům, ovšem za předpokladu, že ani v nejmenším nepovedou k omezování humanitárních aspektů zdravotnictví.

Biobanking

Biobanky jsou nenahraditelným zdrojem stabilizovaného materiálů vzorků tělesných tekutin a tkání a jejich dat o původu a složení (včetně sekvencí DNA/RNA), potřebných pro výzkum, experimenty, validace a externí hodnocení kvality v moderní laboratorní medicíně. Biobanking se týká postupů získávání, skladování a zacházení jak se vzorky tekutin a tkání, tak i registru příslušných dat vzorků. Názory a zkušenosti panelu diskutujících expertů, probírající aspekty biobankingu byly publikovány v Clinical Chemistry [23]. Zásadním obsahem pravidel biobankingu jsou:

-    dokonalá preanalytika při skladování materiálů,

-    důkladné SOP pro registry dat,

-    harmonizace s etickými pravidly a zásadami ochrany dat (GDPR).

Problémům biobankingu a všech jeho aspektů bylo věnováno celé speciální číslo časopisu J Lab Med 2019, 43, 6. V uvedených pracích lze naleznout dostatek poznatků o dílčích problémech procesu [28]:     

-    centralizace, organizace, sítě biobank,

-    automatizace procesů, mechanismy,

-    kryoprezervace, kryozkumavky,

-    možnost skladování při extrémně nízkých teplotách (až -190°C),

-    současná kapacita (miliony zkumavek),

-    norma kvality biobankingu ISO20387:2018,

-    demonstrace nejčastějších zdrojů chyb [29].

První výsledky dotazníku o preanalytickém zacházení se vzorky krve pacientů, určenými k dalšímu výzkumu v genomice, proteomice a metabolomice (v biobankingu) v dánských laboratořích a institucích ukazují (podle očekávání) nedostatečně nízkou harmonizaci postupů a nutnost jejího zlepšení [30].

Autor prohlašuje, že není ve střetu zájmů.

Do redakce došlo 31. 3. 2020.

Adresa pro korespondenci

RNDr. Bedřich Friedecký, Ph.D.

Střelničná 1680

182 00 Praha 8 

e-mail: friedecky@sekk.cz