Barevnost a obsah některých biologicky aktivních látek v přírodninách a v produktech přírodního původu

Súhrn

Příspěvek upozorňuje na korelace mezi výsledky instrumentálního měření barevnosti a obsahem některých biologicky aktivních organických látek (karotenoidy, chlorofyl, anthokyaniny, kurkuminoidy aj.) v přírodninách a v produktech přírodního původu. Dostatečně těsné korelace mohou vést po doplnění regresní analýzou a kalibrací k vývoji postupů pro rychlé stanovení obsahu těchto látek a jejich skupin měřením barevnosti bez náročnější úpravy vzorků.

Klíčová slova:

biologicky aktivní látky – měření barevnosti – korelace – stanovení obsahu

Úvod

Na souvislost barevnosti organických látek s jejich strukturou bylo poukázáno již nejednou dříve¹⁾. Údaje o jejich barevnosti lze získat mimo subjektivní hodnocení měřením založeným na číselném vyjadřování barev v trichromatickém systému^2–4). Východiskem k instrumentálnímu měření barevnosti je spektrální propustnost nebo spektrální odraz látek ve viditelné spektrální oblasti. Realizovat ho lze klasickou spektrofotometrií ve viditelné spektrální oblasti a následným výpočtem, častěji ale měřením měřidlem barevnosti a zejména v posledním desetiletí také s využitím obrazové analýzy, přičemž tyto aplikace mají vzestupný trend^5–7). Výsledky měření barevnosti lze použít ke zjištění existence a těsnosti závislosti barevnosti látek a jejich koncentrace korelační analýzou. Byly popsány četné korelace některých parametrů z instrumentálního měření barevnosti ve vhodně voleném barevném prostoru a obsahu biologicky aktivních látek v přírodninách a v produktech přírodního původu, stanoveného jinou analytickou metodou. Korelační analýza nevyjadřuje funkční vztah⁸⁾, analytické využití jejich výsledků proto předpokládá doplnění regresní analýzou ke stanovení vhodného matematického modelu příslušné závislosti. Ta byla v části dále citovaných prací již provedena. Dále výběr vhodného kolorimetrického parametru^2–4) a kalibraci⁸⁾ jako výchozí předpoklady k rychlému a nezřídka nedestruktivnímu stanovení obsahu příslušných látek (resp. analýz bez nutnosti větší úpravy vzorku). Většinou se jedná o látky barevné, v některých případech však byly zjištěny korelace barevných charakteristik vzorků s obsahem látek nebarevných, jako je např. glukosa⁹⁾, kyselina askorbová¹⁰⁾ či kyselina chlorogenová¹¹⁾. Záměrem našeho příspěvku je poukázat na tyto korelace u biologicky aktivních látek organického původu a jejich skupin se zaměřením na látky lidskému zdraví prospěšné, obsažené v přírodninách a v produktech přírodního původu. V příspěvku jsou příklady těsnějších korelací s korelačním koeficientem nejméně 0,9 a některých korelací s nižším korelačním koeficientem, pokud byl statisticky významný.

U některých dalších biologicky aktivních látek lze korelovat jejich koncentraci, resp. obsah s parametry z instrumentálního měření barevnosti po chromogenní reakci těchto látek s vhodně voleným činidlem. Tyto aplikace nejsou předmětem příspěvku.

Korelace výsledků měření barevnosti a obsahu některých biologicky aktivních látek a jejich možné analytické využití

Korelace výsledků instrumentálního měření barevnosti a obsahu biologicky aktivních látek v přírodninách a v produktech přírodního původu byly pravděpodobně nejčastěji popsány u karotenoidů, u kterých byl navíc v barevném prostoru CIELAB^2–4) podrobněji studován vztah mezi jejich chemickou strukturou a zbarvením¹²⁾. Některé z těsnějších korelací popsaných ve skupině karotenoidů jsou uvedeny v tabulce 1. Pro případné analytické využití jsou z nich výhodné zejména korelace lineární^{8, 23, 24)}.

Mimo tyto korelace byla popsána ve skupině karotenoidů řada méně těsných lineárních a nelineárních korelací. Z nich lze zmínit např. lineární korelaci hodnot souřadnice a* a celkového obsahu karotenoidů v pomerančové šťávě (korelační koeficient 0,88)²⁵⁾, lineární korelaci poměru souřadnic a*/b* a obsahu lykopenu v rajčatech (korelační koeficient 0,89)²⁶⁾,lineární korelaci souřadnice b* a obsahu luteinu v rajčatech (Pearsonův korelační koeficient 0,87)¹⁵⁾, korelaci souřadnice b* a β-karotenu anebo barevného tónu h_ab a lykopenu (Pearsonův korelační koeficient 0,867 a –0,895) v cherry rajčatech²⁷⁾. Dále korelace souřadnice b* a obsahu β-karotenu, β-kryptoxantinu nebo luteinu + zeaxantinu v pomerančové šťávě (korelační koeficienty 0,643, 0,691, –0,655)28) anebo nelineární korelaci souřadnice a* a obsahu β-kryptoxantinu v citronové kůře (korelační koeficient 0,799)²²⁾.

Častěji byly popsány také korelace parametrů barevnosti přírodnin anebo produktů přírodního původu a obsahu chlorofylu. Některé z těchto korelací jsou uvedeny v tabulce 2.

Mimoto byly popsány méně těsné korelace obsahu chlorofylu s parametry barevnosti přírodnin a produktů přírodního původu, jako korelace poměru C_ab*/L* a chlorofylu v panenském olivovém oleji (korelační koeficient 0,8421)¹³), lineární korelace hodnot chroma C_ab* a chlorofylu b v sušených listech petržele (korelační koeficient 0,811)²⁹⁾ a další.

U dalších biologicky aktivních organických látek a jejich skupin byly popsány korelace s parametry barevnosti mimo jiné ve skupinách flavonoidů, kurkuminoidů, betalainů a u řady látek mimo tyto skupiny. Některé těsnější z nich jsou uvedeny v tabulce 3.

Z korelací méně těsných byly popsány častěji korelace flavonoidů, a to buď celkových flavonoidů (ve včelím medu s využitím souřadnice a* byl korelační koeficient roven 0,8645), v propolisu s hodnotami chroma C_ab* byl Spearmanův korelační koeficient 0,630⁴⁶⁾), nebo i jednotlivých flavonoidů (např. luteolin v šafránu, souřadnice b*, korelační koeficient 0,835⁴⁷⁾). Statisticky významné korelace obsahu jednotlivých flavonoidů (luteolin, kvercetin, kaempferol) s hodnotami souřadnic barevného prostoru CIELAB L*, a*, b* byly popsány v práci⁴⁸⁾ v rámci studia rostliny nevadlec hřebenitý. Další statisticky významné korelace obsahu flavonoidů, jako jsou baikalin a wogonosid s hodnotami souřadnic L*, a*, b*, byly popsány u kořene šišáku bajkalského⁴⁹⁾. Při sledování stability kyanidin-3-glukosidu z malin byla zjištěna korelace mezi jeho obsahem a hodnotami b* nebo h_ab s korelačním koeficientem > 0,91⁵⁰). Ve studii⁵¹⁾ bylo korelováno jednotlivě několik různých kolorimetrických parametrů s obsahem celkových anthokyaninů a mimoto jedenácti jednotlivých anthokyaninů a jejich skupin v červeném víně. Vysokých hodnot Pearsonova korelačního koeficientu (u celkových anthokyaninů vždy a u jednotlivých anthokyaninů a jejich skupin většinou > 0,9) při přímé závislosti proměnných bylo dosaženo v korelacích s parametry a*, C_ab* a s_uv* z barevného prostoru CIELUV. Autoři⁵²⁾ sledovali korelace barevných biologicky aktivních látek v květech chryzantém pěstovaných v květináči. Mezi zajímavější z nich patří mimo korelace celkových karotenoidů nebo luteinu či violaxanthinu se souřadnicí b* (Pearsonův korelační koeficient 0,881, 0,804 a 0,674) a těsnější korelace celkových anthokyaninů, nebo kyanidin-3-O-(6´´-O-malonyl-glukosidu) či kyanidin- 3-O-(3´´,6´´-O-dimalonyl-β-glukopyranosidu) s hodnotou souřadnice a* (Pearsonův korelační koeficient 0,896, 0,884 a 0,864). V barevném prostoru HSV korelovala sytost barvy S světlice barvířské s obsahem polyfenolu hydroxysaffrol yellow A, Pearsonův korelační koeficient byl 0,779, při korelaci s hodnotou R v barevném prostoru RGB byl Pearsonův korelační koeficient 0,758⁵³⁾. Pozoruhodně těsné lineární korelace byly zjištěny při studiu sušení listů meduňky lékařské mezi hodnotami některých parametrů barevnosti v barevném prostoru CIELAB a obsahem hydroxyskořicových kyselin jako ekvivalentů kyseliny rozmarýnové (nejlépe souřadnice b*, kdy byl korelační koeficient 0,9945)⁵⁴⁾. Obsah kyseliny askorbové ve šťávě z čínského pomerančovníku koreloval podle10) s hodnotami chroma C_ab*, Pearsonův korelační koeficient byl 0,813. Statisticky významné korelace s parametry z instrumentálního měření barevnosti (nejlépe ze zkoušených korelovaly hodnoty ΔE*) byly dále popsány u alkaloidů obsažených v kořenu oměje Carmichaelova. Spearmanův korelační koeficient pro benzoylhypakonitin, benzoylakonitin, benzoylmesakonin a pro celkový obsah těchto alkaloidů byl 0,634, 0,577, 0,564 a 0,698⁵⁵⁾. Odkazy na některé další korelace obsahu biologicky aktivních látek v přírodninách a v produktech přírodního původu s výsledky instrumentálního měření barevnosti lze nalézt v přehledu⁵⁶⁾.

Řadu korelací uvedených v tabulkách 1, 2 a 3 nebo v textu lze využít (a některé z nich již byly využity) k vývoji postupů ke stanovení obsahu příslušných látek. Jako nejvýhodnější z nich se pro tento účel jeví korelace lineární s přímou závislostí proměnných. Při použití kalibrační křivky sice není nutné, aby byla závislost naměřené veličiny na koncentraci stanovované složky lineární, při srovnávání s jedním standardem se ale linearita předpokládá⁵⁷⁾. V obecné rovině jsou proto preferovány lineární závislosti vedoucí ke kalibrační přímce^{8, 23, 24)} a ověřování linearity je v kvantitativní instrumentální analytice součástí validačních schémat^{23, 24)}. Přesto lze nalézt v odborné literatuře i práce doporučující pro stanovení analytu využití kolorimetrického parametru, jehož závislost na koncentraci lineární obvykle není⁵⁸⁾. Tento kolorimetrický parametr (L*) ale někteří jiní autoři v dané souvislosti odmítají, protože charakterizuje pouze světlost vzorku. Např. v práci⁵⁹⁾ pro stanovení lykopenu preferují před souřadnicí L* hodnotu (a*/b*)² vycházející ze souřadnic barevnosti v barevném prostoru CIELAB. Použití této transformace současně převádí při málo rozdílném korelačním koeficientu nepřímou závislost proměnných, jejíž využití v instrumentální analytice není běžné, na závislost přímou a lineární. Obdobně tomu je v prácⁱ²⁷⁾ při korelaci obsahu lykopenu s h_ab (Pearsonův korelační koeficient –0,895) a se souřadnicí a* (Pearsonův korelační koeficient 0,877). V rámci citovaných prací mohou být dalšími příklady převodu nepřímé závislosti proměnných na závislost přímou volbou kolorimetrického parametru korelace obsahu betaninu v mikrotobolkách, kdy s hodnotou h_ab byl Pearsonův korelační koeficient –0,918, s hodnotou a* ale 0,993⁴³⁾, tedy kladný a vyšší. Při korelaci obsahu anthokyaninů v jahodách³⁷⁾ s hodnotou souřadnice B byl Pearsonův korelační koeficient –0,954, s hodnotou parametru S barevného prostoru HSL 0,947 a při využití hodnot souřadnice a* barevného prostoru CIELAB 0,942. U obsahu hypericinu v olejových macerátech z třezalky byl korelační koeficient při jeho korelaci s h_ab –0,9928 a 0,9981 při korelaci s hodnotou souřadnice a*⁴⁴⁾. Při korelaci obsahu kyselin hydroxyskořicových v listech meduňky lékařské byl korelační koeficient s hodnotou souřadnice a* –0,9928, se souřadnicí b* 0,9945⁵⁴⁾. V některých případech může linearitu závislosti proměnných zajistit místo změny kolorimetrického parametru korelace poměru souřadnic barevného prostoru CIELAB a*/b* po jeho transformaci na (a*/b*)², která vedla při korelaci s obsahem lykopenu v rajčatech k lepším výsledkům⁵⁹⁾. Autoři¹⁹⁾ v obdobné situaci popsali lineární korelaci obsahu lykopenu s poměrem souřadnic a*/b* bez jeho transformace (korelační koeficient byl 0,95–0,96), přičemž při korelaci s parametry h_ab nebo ΔE* byly závislosti proměnných nelineární a nepřímé. V barevném prostoru RGB se k linearizaci při korelaci obsahu karotenoidů a chlorofylu ve špenátu osvědčilo korelovat místo složek G a R jejich převrácené hodnoty 1/G a 1/R⁶⁰⁾. Při korelaci obsahu kurkuminoidů v kurkumě bylo dosaženo v barevném prostoru RGB přímé lineární korelace s korelačním koeficientem 0,9611 použitím poměru (R – G)/(R + G + B)³⁸⁾. Při korelaci obsahu chlorofylu v hlávkovém salátu v barevném prostoru RGB s barevnými složkami R a G byly sice korelace lineární, v prvním případě však byla závislost proměnných nepřímá s korelačním koeficientem –0,79, ve druhém přímá s korelačním koeficientem rovným 0,35. S použitím poměru G/R však byla korelace lineární, závislost proměnných přímá a hodnota korelačního koeficientu vzrostla na 0,92³⁵⁾. K obdobnému výsledku vedla korelace rozdílu G – R³⁵⁾. Korelace součtu hodnot G + R sice vedla k vysokému korelačnímu koeficientu (–0,931), závislost proměnných ale byla nepřímá³²⁾. Pokud jde o míru využití jednotlivých barevných prostorů, nejčastěji jde o prostory CIELAB a CIELCH a dále o barevný prostor RGB, jehož využívání se zvyšuje v souvislosti s nárůstem využívání obrazové analýzy. Jiné barevné prostory, jako jsou CIELUV, HSV či HSL, byly využívány jen málo.

Z uváděných příkladů a dalších prací je zřejmé, že průběh korelační funkce a hodnotu korelačního koeficientu může často ve značné míře ovlivnit volba a mimoto i případná transformace kolorimetrického parametru. I po těchto krocích ale v řadě případů zůstávají hodnoty korelačního koeficientu dosti vzdáleny těm, které jsou dosahovány při aplikaci běžných metod instrumentální analýzy založených na kalibraci. Přesto je řada publikovaných prací zaměřena analyticky přímo názvem nebo v závěrech či souhrnu zmiňuje možné využití korelací mezi obsahem biologicky aktivních látek v přírodninách a v produktech přírodního původu a parametry z instrumentálního měření barevnosti k hodnocení či přímo stanovení obsahu příslušných látek. Týká se to častěji obsahu karotenoidů a v jejich rámci zejména lykopenu^{15, 18–20, 27, 59, 60)}, dále chlorofylu^{32– 35, 60)}, kurkuminoidů a kurkuminu^{38, 40)}, ale i jiných látek, jako např. betalainů⁴²⁾.

Údaje o přesnosti a správnosti výsledků kolorimetrických měření vzorků přírodnin a produktů přírodního původu a na nich založených stanovení lze nalézt v publikovaných pracích jen ojediněle. Podle¹⁷⁾ byla reprodukovatelnost měření kolorimetrických parametrů charakterizována relativní směrodatnou odchylkou < 1 %, jde však pouze o jednu ze složek variability výsledků stanovení příslušných látek touto cestou. V práci³⁸⁾ byly porovnány výsledky kolorimetrického stanovení kurkuminoidů s využitím parametrů barevného prostoru RGB s výsledky stanovení spektrofotometrií v ultrafialové oblasti, přičemž nebyly zjištěny statisticky významné rozdíly. Z výsledků testování postupu stanovení kurkuminu lze jako charakteristiku přesnosti s využitím barevného prostoru RGB a obrazové analýzy vyčíslit relativní směrodatnou odchylku v průměru 0,71 %, což je hodnota příznivá; z výsledků testování stanovení kurkuminu HPLC byla průměrná relativní směrodatná odchylka 1,2 %⁴⁰⁾. Při analýze tří různých vzorků kurkumy (n = 5) byl nevážený průměr výsledků stanovení obsahu kurkuminu měřením barevnosti 4,97 %, HPLC 5,33 %⁴⁰⁾ při prakticky shodném odhadu přesnosti výsledků obou metod. V jiných případech může být přesnost a správnost výsledků stanovení obsahu s využitím výsledků měření barevnosti nižší. Většinou ale jde o stanovení rychlá, s nenáročnou přípravou vzorku či dokonce nedestruktivní, takže by neměl být problém zvýšit přesnost a správnost jejich výsledků větším počtem opakování vzhledem ke skutečnosti, že směrodatná odchylka aritmetického průměru několika paralelních stanovení klesá se zvyšováním jejich počtu⁵⁷⁾.

Jinou možnou cestou ke zlepšení přesnosti a správnosti výsledků stanovení obsahu založených na výsledcích měření barevnosti může být zvýšení těsnosti korelace proměnných. jako základního předpokladu použitím více než jednoho kolorimetrického parametru ve vícenásobné korelaci a vícenásobné regresi, včetně PLS. Příkladem může být studie28), ve které korelace souřadnice b* (anebo a*, L*, C*_ab či h_ab, b* byla nejlepší volbou) a obsahu β-karotenu, β-kryptoxantinu nebo luteinu + zeaxantinu v pomerančové šťávě vedly ke korelačním koeficientům < 0,70, zatímco vícenásobná korelace obsahu těchto látek s L*, a* a b* nebo s L*, C*_ab a h_ab vedla ke korelačním koeficientům > 0,98 (β-kryptoxanthin) až > 0,99 (β-karoten a lutein + zeaxanthin). Další zvyšování počtu kolorimetrických parametrů ve vícenásobné regresi ale nemusí přinést výrazné zvýšení korelačního koeficientu. Ukazují to výsledky autorů⁵³⁾, kteří korelovali s obsahem účinné látky hodnoty sedmi kolorimetrických parametrů z různých barevných prostorů. Výsledkem bylo zvýšení korelačního koeficientu z 0,794 (nejvyšší hodnota v rámci kolorimetrických parametrů korelovaných jednotlivě) na 0,897.

Seznam použitých zkratek a symbolů (viz také^2–4))

C_ab*             chroma (měrná čistota) barvy v barevném prostoru CIELCH (CIE L* C* h)

CIE              Mezinárodní komise pro osvětlování (Commission Internationale de l’Éclairage)

CIELAB,

CIELCH,

CIELUV        barevné prostory CIE bližší lidskému vidění (CIE L* a* b*, CIE L* u* v*)

h_ab                měrný úhel barevného tónu v barevném prostoru CIELCH

L*, a*, b*       souřadnice barevného prostoru CIELAB

PLS              metoda částečných nejmenších čtverců

R, G, B         složky barevného prostoru RGB

S                  sytost barvy v barevném prostoru HSL nebo HSV

s_uv*              sytost barvy v barevném prostoru CIELUV

X, Y, Z          trichromatické složky barevného prostoru CIE XYZ

ΔE*              barevný rozdíl v barevném prostoru CIELAB

Střet zájmů: žádný.

Došlo 12. dubna 2021

Přijato 8. června 2021

J. Šubert

Dušínova 1512/42, 664 34 Kuřim

doc. RNDr. Jozef Kolář, CSc.

Univerzita Karlova, Farmaceutická fakulta

Katedra sociální a klinické farmacie Heyrovského 1203, 500 05 Hradec Králové

e-mail: kolarjozef02@gmail.com

J. Čižmárik

Univerzita Komenského v Bratislave

Farmaceutická fakulta, Katedra farmaceutickej chémie, SR