Molekulární biologie a imunopatogeneze sepse

Souhrn

Sepse, systémová zánětlivá odpověď k infekci, je příčinou vysoké mortality pacientů na nekoronárních jednotkách intenzivní péče. Patofyziologie sepse zahrnuje komplex interakcí mezi mikro- a makroorganismem, které jsou spojeny s dysfunkcí systému vrozené a adaptivní imunity. Sepse představuje dynamický proces, který je charakterizován řadou často antagonistických jevů. Zánět charakterizující sepsi zde nenaplňuje svou primárně kompenzační fyziologickou roli a přestřeluje do fáze hyperzánětlivé odpovědi nebo na straně druhé do anergie – imunoparalýzy. Objasnění patogeneze sepse představuje pochopení imunopatologických procesů, které charakterizují interakci makro- a mikroorganismu.

Klíčová slova:
sepse, imunita, zánět, apoptóza, imunogenetika.

Úvod

Sepse představuje jeden z největších současných problémů medicíny. Česká jednodenní studie z roku 2003 prokázala prevalenci sepse 34,2 % a těžké sepse 16,8 % (1). Incidence těžké sepse v USA je 3,0/1000 obyvatel a 2,26/100 propuštění z nemocnice (2). Incidence se zvyšuje s věkem více než stonásobně (0,2/1000 dětí a 26,2/1000 u dospělých nad 85 let). Počet hospitalizací s těžkou sepsí se v letech 1993–2003 téměř zdvojnásobil (3). Problémem je vysoká mortalita sepse (28,6 %) i těžké sepse (37,8 %) (4). Ještě nepříznivější data ukazuje analýza pacientů se septickým šokem (5). Jeho incidence je 58% u pacientů s těžkou sepsí a jeho mortalita stále převyšuje 50%.

V patogenezi sepse se významným způsobem uplatňují dysregulace mechanismů vrozené i adaptivní imunity. Jednou z úloh imunitního systému je udržování homeostázy. Mechanismy vrozené a adaptivní imunity zabezpečují odpověď makroorganismu na infekční agens. V případě sepse je tato homeostáza podstatným způsobem narušena. Lokalizovaná zánětlivá odpověď přerůstá do odpovědi systémové, která je výrazem selhání imunologických kompenzačních mechanismů.

Definice sepse, SIRS a PIRO systému

Jedním z důležitých mezníků v chápání patogeneze sepse byla konsenzuální konference v roce 1991 s definováním pojmů: syndrom systémové zánětlivé odpovědi (SIRS), sepse, těžká sepse, septický šok, bakterémie (6). Konkrétním vyjádřením byla definice syndromu systémové zánětlivé odpovědi-SIRS. Představovala nové chápání interakcí pro- a protizánětlivých mechanismů a mediátorů uplatňujících se v rámci odpovědi makroorganismu na infekci, trauma, závažný operační zákrok. Definice SIRS nabídla koncept účasti a významu endogenních zánětlivých mediátorů u syndromu zánětlivé odpovědi infekční i neinfekční etiologie.

PIRO concept

Klinická praxe ukázala, že kritéria SIRS mají vysokou senzitivitu, ale příliš nízkou specificitu. Skupiny pacientů definované podle konsenzu z roku 1991 byly velice heterogenní a této heterogennosti se přičítal vliv na špatné klinické výsledky s použitím imunomodulační terapie. Proto vznikla snaha tuto heterogennost odstranit, přičemž východiskem se staly nové metodologie s detekcí nových biomarkerů, jako je např. prokalcitonin, studování genetických polymorfismů atd. Cílem je rozšíření diagnostických možností u pacientů se sepsí a jejich staging, jak je tomu například onkologických nemocných a používaného TNM systému. V roce 2001 byla přijata tzv. PIRO klasifikace (7). „PIRO“ systém znamená Predisposition „P“, Infection „I“, Response „R“ a Organ dysfunction „O”.

Vliv infekčních agens na imunitní a koagulační systém

Sepse představuje systémovou zánětlivou reakci organismu na infekci. Etiologicky se uplatňují bakteriální, virová, mykotická nebo parazitární agens. U gram-negativních bakterií je základní stavební složkou endotoxin, resp. lipid A, který je odpovědný za patogenetické účinky (8).Plazmatická koncentrace endotoxinu koreluje s rozvojem syndromu multiorgánové dysfunkce (MODS) a letalitou. Příčinou endotoxémie může být bakteriální translokace, při které dochází k prostupu mikrobů a jejich produktů přes slizniční bariéru (9, 10). Důležitým faktorem uplatňujícím se při navození translokace střevní flóry je dysfunkce retikuloendotelového systému – zejména jater (11). Bakteriální translokace a její spojení se vznikem SIRS a sepse se považuje za prokázané (12, 13). Závislost bakteriální translokace na imunosupresi byla prokázána v experimentálních i klinických studiích. Zvýšená bakteriální translokace byla prokázána u atymických myší (14), závislost na provedeném chirurgickém zákroku při střevní obstrukci zase na lidském modelu (15). Podobné účinky jako endotoxin mají struktury gram-pozitivních bakterií – teichoová a lipoteichoová kyselina, kapsulární lipopolysacharid a skupinově specifické karbohydráty. Většina patogenetických účinků u gram-pozitivních bakterií je výsledkem působení exotoxinů. Tyto exotoxiny mohou působit také jako superantigeny. Superantigeny se váží přímo na MHC antigeny II. třídy exprimované na antigen-prezentujících buňkách a reagují přímo s T-buněčnými receptory (TCR). Příkladem je toxický šok syndrom způsobený toxinem 1, který produkuje Staphylococcus aureus. Účinkem výše zmíněných bakteriálních struktur na leukocyty a buňky parenchymatózních orgánů dochází k produkci prozánětlivých cytokinů. Dva hlavní cytokiny jsou důležité v rozvinutí zánětlivé kaskády indukované endotoxinem – tumor nekrotizující faktor-α a interleukin-1β (16). Tyto cytokiny stimulují imunitní odpověď, která zahrnuje: uvolnění cytokinů, aktivaci metabolismu kyseliny arachidonové, expresi integrinů, aktivaci komplementu, produkci oxidu dusnatého. Pro navození imunitní odpovědi u gram-negativní infekce je nezbytná vazba lipopolysacharidu (LPS) k receptoru monocytárních fagocytů – molekule CD14, který je exprimovaný na povrchu myelomonocytárních buněk. Kromě této buněčné formy existují dvě solubilní formy CD14, které vazbou k LPS indukují rozvinutí zánětlivé kaskády. Proteinem odpovědným za vazbu LPS k molekule CD14, je LPS-vázající protein (LBP), který je přítomen v plasmě. V dalším průběhu odpovědi se specificky uplatňuje receptor z rodiny Toll-like receptorů (TLR), konkrétně TLR-4 (17). CD14 molekula se rovněž uplatňuje jako receptor pro peptidoglykan, který je komponentou buněčné stěny gram-pozitivních bakterií (18).

Gram-pozitivní i gram-negativní bakterie i další patogeny disponují molekulárními strukturami, které jsou hlavními „terči“ při rozpoznání systémem vrozené imunity. Tyto molekuly označujeme jako „s patogenem asociované molekulární vzory“ PAMPs (pathogen-associated molecular patterns) (19). Těmito strukturami je u gram-negativních bakterií lipid A, u gram-pozitivních bakterií peptidoglykan a teichoová kyselina. Dvouvláknová RNA je typická pro RNA viry, manany jsou charakteristické pro kvasinky. V systému vrozené imunity se při jejich rozpoznání uplatňují jako antigen-prezentující buňky (APC) makrofágy a dendritické buňky (DB), které je pak předkládají T-lymfocytům. Oba typy antigen prezentujících buněk disponují „receptory rozpoznávání“ (pattern recognition receptors – PRRs), které se na tyto struktury vážou. Mezi tyto receptory patří kolektiny, CD14, Toll-like receptory (TLRs), manózu vázající protein, sérový amyloid P, receptory pro komplement, C-reaktivní protein, Fc receptory, CD11b,c/CD18 a DEC 205. Důsledkem těchto vazeb je přenos signálu prostřednictvím proteinu myeloid differentiation factor 88 (MYD88) a nuclear factor κB (Nκ-FB) do nitra hostitelské buňky, což vede k transkripci genů pro produkci cytokinů – IL-1 a IL-12, TNF-α a B7 (20–23). Primární úlohou zánětlivé odpovědi je lokalizace poškození. Uvolnění zánětlivých mediátorů – leukotrienů, složek komplementu, cytokinů a tvorba antigen-protilátkových komplexů způsobuje akumulaci neutrofilů a monocytů v místě poškození. Monocyty a neutrofily lokálně uvolňují množství cytokinů – prozánětlivých – TNF-α, IL-1, IL-2, IL-6, interferon-γ a další. Vedle produkce prozánětlivých cytokinů se kompenzačně uplatňuje protizánětlivá odpověď, kterou představuje produkce IL-4, IL-10, IL-11, IL-13, solubilních TNF-α receptorů. Neutrofily, které fungují jako fagocyty, jsou ale také hlavní příčinou orgánového poškození. Vlivem zánětlivých cytokinů produkovaných neutrofily se na povrchu endotelií poškozených tkání exprimují adhezní molekuly. Proces zahrnuje primární adhezi leukocytů zprostředkovanou selektiny L, E a P, které jsou přítomny na leukocytech, endoteliích a destičkách. Prvotní adhezní interakce pohyb neutrofilů zpomalí, v další fázi dochází k vazbě leukocytárních integrinů na povrchový glykoprotein endoteliálních buněk ICAM 1 (intercellular adhesion molecule-1). Monocyty přilínají na cévní stěnu prostřednictvím β1-integrinů. Protějškem na endoteliích je molekula VCAM-1 (vascular adhesion molecule). Ligandem pro β1-integriny jsou složky mezibuněčné hmoty (kolageny, fibronektin). Výjimkou je VLA-4, jejímž ligandem je VCAM-1. Po pevném zachycení na povrchu endotelií neutrofily cévu opustí a přejdou do tkáně. Neutrofily v místě poškození odstraní mikroorganismy, eventuálně jiné cizorodé částice a během krátké doby hynou. Samy jsou odstraněny dalšími fagocytujícími buňkami, zejména makrofágy.

Přehled nejdůležitějších zánětlivých mediátorů uvádí tabulka 1.

Pokud nedojde k lokalizaci etiologického agens nebo poranění, dochází k progresi prozánětlivé odpovědi s masivní produkcí mediátorů, která je příčinou klinické manifestace syndromu systémové zánětlivé odpovědi. Cytokiny produkované u septických pacientů aktivují jejich koagulační systém (24, 25). Klíčovou roli hraje v koagulační kaskádě tkáňový faktor (TF), který je aktivován TNF-α, IL-2, IL-6. Působení cytokinů vede k redukci fibrinolýzy, poklesu proteinu C a antitrombinu III. Aktivovaný protein C inhibuje faktory Va, VIIa a inhibitor aktivátoru plasminogenu (PAI-1). Antitrombin III inhibuje koagulační faktory Xa, XIa, IIa a plasmin. Progredující prokoagulační stav akcentuje zánětlivou odpověď při sepsi. Významnou roli v další progresi má dysfunkce endotelu. Působením TNF-α, IL-1 a dalších prozánětlivých mediátorů dochází k významné dysfunkci endotelu společně se změnou jeho fenotypu na protrombotický. Důsledkem je tvorba mikrovaskulárních trombů a ischémie. Je významně narušena mikrocirkulace se zvýšenou permeabilitou, progredující vazodilatací, orgánovou dysfunkcí a šokem.

Zánět jako hlavní patogenetický mechanismus sepse

Hlavním patogenetickým mechanismem u pacientů se sepsí je zánět. Zánět představuje fyziologický kompenzační mechanismus, který spojuje systém vrozené a získané imunity. Jeho primární úlohou je zachování homeostázy, odstranění inzultů, které tuto homeostázy narušují. Patogeneze sepse je spojena s poruchou imunitních funkcí na úrovni humorální i buňkami zprostředkované imunity. Imunitní odpověď pacientů se sepsí je charakterizována buď hyperzánětlivou systémovou odpovědí, nebo naopak stavem „imunoparalýzy“ s nízkou expresí HLA-DR na monocytech a sníženou produkcí TNF-αex vivo po stimulaci lipopolysacharidem (26). Hyperzánětlivou fázi charakterizuje vysoká produkce cytokinů – TNF α, migraci inhibujícího faktoru (MIF) a high-mobility group box I (HMGB-I) proteinu (27, 28). Obě fáze se vyskytují nezávisle na sobě a v různých časových okamžicích při rozvoji sepse. Důležitou roli v procesu navození imunoparalýzy hraje IL-10. IL 10 suprimuje expresi znaků II. třídy MHC a touto cestou inhibuje antigen-specifickou proliferaci T-lymfocytů (29).

Apoptóza v procesu sepse

Apoptóza je fyziologický děj, programovaná smrt. Podobně jako u zánětu je to proces primárně fyziologický, který má za úkol zachování homeostázy, remodelaci tkání, aktivní proces imunitní odpovědi na exo- a endogenní podněty. U sepse je zvýšená apoptóza imunokompetentních buněk, která ve svém důsledku působí imunosupresivně (30, 31). Největší počet apoptotických buněk byl prokázán ve slezině a střevě (32). Takový pokles imunokompetentních buněk má pochopitelně odezvu ve snížené schopnosti organismu reagovat na infekci. Apoptotické buňky navíc aktivně potlačují zánětlivou odpověď. Otázkou zůstává význam apoptózy pro klinický výsledek sepse. Zatímco byla prokázána závislost klinického výsledku sepse na počtu lymfocytů, kauzalita mezi zvýšenou apoptózou lymfocytů a letalitou pacientů se sepsí prokázána nebyla. V současné době se diskutuje otázka možného terapeutického přístupu s využitím signálních molekul pro apoptózu jako cíle pro terapii sepse (33).

Dysregulace systému vrozené a adaptivní imunity v patogenezi sepse

Syndrom systémové zánětlivé odpovědi i sepse je charakterizován zánětem a poruchou homeostázy. V obou případech se jedná o komplex reakcí vzniklý jako odpověď na porušení integrity organismu. Mechanismy zánětlivé reakce jsou v případě syndromu systémové zánětlivé odpovědi neinfekční etiologie i sepse identické, rozdíl je v ne/přítomnosti infekce. Patogeneze uvedených stavů je významným způsobem spojena s poruchou imunitních funkcí na úrovni humorální i buňkami zprostředkované imunity. Zahrnuje systémovou odpověď k infekci nebo neinfekčním podnětům, při které monocyto-makrofágový systém produkuje velké množství pro a protizánětlivých cytokinů – TNF-α, IL-1, IL-6, IL-10 a další.Sepse i SIRS jsou na svém počátku charakterizovány zvýšením koncentrace zánětlivých mediátorů v krvi. Souběžně dochází ke kompenzační protizánětlivé imunosupresivní odpovědi. Mechanismy adaptivní imunity, které se zde uplatňují, jsou zprostředkovány především buňkami zprostředkovanou imunitou. Aktivované CD4⁺ T-lymfocyty se dělí na dvě podskupiny s antagonistickým profilem produkovaných cytokinů – typ T_H1 produkující zejména TNF-α, interferon-γ a interleukin-2 (prozánětlivé) a typ T_H2 s produkcí IL 4 a IL-10 (protizánětlivé). IFN-γ a TNF α produkované T_H1 buňkami zvyšují schopnost fagocytů zabíjet infekční agens, zatímco IL-4 a IL-10 produkované T_H2 buňkami podporují zejména humorální odpověď proti extracelulárním patogenům. Faktory, které rozhodují o diferenciaci T-buněk, nejsou zcela známy, ale v případě infekce je důležitý typ patogenu, množství infekčního inokula a lokalizace infekce. Důležitým faktorem je také poměr koncentrací IL-12 a IL-4. IL-12 je produkován makrofágy a dendritickými buňkami, IL-4 bazofily a mastocyty. Převažující typ mediátorové produkce je důležitý pro dominanci pro nebo protizánětlivé odpovědi. Její intenzita rozhoduje rovněž o tzv. kompartmentalizaci imunitní odpovědi, zda bude zánětlivá odpověď lokalizována nebo systémová. Také stresová odpověď se svými mechanismy hraje důležitou roli v navození imunosuprese nejen při infekci, ale také po traumatu nebo krevní ztrátě. Nedávné práce prokázaly vliv autonomního nervstva (sympatiku a parasympatiku) na imunitní odpověď (34, 35). Neuroendokrinní systém tak reguluje prozánětlivou roli monocytů a makrofágů (produkce TNF) a antigen-prezentující funkci přímo i nepřímo indukcí imunomodulačních cytokinů – např. IL-10. Účinkem jeho působení dochází k deaktivaci T_H1 buněk. Tyto interakce jsou důležité v zabránění excesivní zánětlivé reakce. Pokud se ale zvyšuje intenzita zánětlivé reakce – při masivní infekci, traumatu, dochází k výraznější aktivaci stresové osy, která vede k vyšší imunosupresi, a tím ke zvýšenému riziku systémové infekce. Vysoké koncentrace kortikosteroidů a katecholaminů vedou ke zvýšené apoptóze lymfocytů a snížení funkčnosti adaptivních mechanismů imunity. Heidecke et al. zjistili, že snížení T_H1 funkce bez zvýšení T_H2 cytokinové produkce odpovídá stavu anergie – neschopnost odpovědi na antigen. Tato snížená funkce T lymfocytů koreluje s mortalitou. Pacienti s traumatem, sepsí a popáleninami mají snížené počty cirkulujících T-lymfocytů a jsou anergní (36). Velké množství lymfocytů a epiteliálních buněk střeva hyne během sepse mechanismem apoptózy. Jedním z mechanismů je stresem indukované uvolnění glukokortikosteroidů. Apoptické buňky navozují anergii a protizánětlivou cytokinovou produkci, zatímco buňky nekrotické působí imunostimulačně a zvyšují obranyschopnost organismu (37, 38). A tak kombinace uvedených faktorů navozuje imunosupresi charakteristickou pro pacienty se sepsí (tab. 2).

Genetické predispozice sepse

Genetický polymorfismus faktorů vrozené imunity se uplatňuje v rámci interakcí makro- a mikroorganismu. Byla zkoumána závislost mezi polymorfismem CD14, LBP a BPI u pacientů v sepsi. Polymorfismy Toll like receptorů jsou spojeny se zvýšenou vnímavostí k infekčním agens (39). Polymorfismy cytokinů a jejich receptorů (TNF-α, TNFR, IL-1,IL-6), faktorů endoteliální dysfunkce (PAI-1 – inhibitor aktivátoru plasminogenu) se rovněž uplatňují významným způsobem (40). Zjišťování genetických predispozic u sepse se již stalo nedílnou součástí současného klinického výzkumu u kriticky nemocných. Nové technologické postupy (DNA arrays) a vyspělá výpočetní technika umožňují postoupit dále v tomto výzkumu. Dosavadní výsledky dávají důvod ke střízlivému optimismu při hodnocení jejich úlohy v diagnostice, patogenezi a potencionální terapii sepse.

Závěr

Přes významný pokrok v objasnění patogeneze sepse v posledních 20 letech zůstává její mortalita příliš vysoká. Dysregulace imunologických mechanismů vrozené a adaptivní imunity je významnou příčinou této vysoké mortality. Dokonalejší poznání těchto dysregulací, používání diagnostických parametrů, které dokáží dostatečně rychle a spolehlivě detekovat přítomnost infekce a zhodnotit funkční stav imunitního systému makroorganismu – tedy robustní diagnostika je cílem, který umožní včasnější a účinnější imunoterapii sepse.

Zkratky

APC – antigen-prezentující buňky

DB – dendritické buňky

HMGB-I – high-mobility group box I 

ICAM-1 – intercellular adhesion molecule-1

LBP – LPS-vázající protein

LPS – lipopolysacharid

MIF – migraci inhibujícího faktor

MODS – multiorgánová dysfunkce

MYD88 – myeloid differentiation factor 88

NF-κB – nuclear factor κB

PAI-1 – inhibitor aktivátoru plasminogenu

PAMPs – pathogen-associated molecular patterns

PIRO – Predisposition Infection Response Organ dysfunction

PRRs – receptory rozpoznávání (pattern recognition receptors)

TCR – T-buněčnými receptory

TF – tkáňový faktor

TNF – tumor nekrotizující faktor

TLR – Toll like receptor

VCAM-1 – vascular adhesion molecule

Adresa pro korespondenci:

MUDr. Miroslav Průcha, Ph.D.

Oddělení klinické biochemie, hematologie a imunologie Nemocnice Na Homolce

Roentgenova 2, 150 00 Praha 5

e-mail: miroslav.prucha@homolka.cz