Srovnání sérových hladin vybraných biologických působků u monoklonální gamapatie nejistého významu a mnohočetného myelomu

Souhrn

Východisko.
Cílem studie bylo vyhodnocení sérových hladin vybraných 12 biologických ukazatelů u monoklonální gamapatie nejistého významu (MGNV) a iniciální, asymptomatické fáze mnohočetného myelomu (MM), a to především z pohledu potenciální možnosti odlišení těchto stavů v podmínkách klinické praxe.

Metody a výsledky.
Analyzovaná sestava 268 jedinců sestávala ze souboru 89 jedinců s MGNV a 179 nemocných s MM vyšetřených při diagnóze před nasazením terapie. K vyšetření sérových hladin byla použita radioenzymatická metoda (thymidinkináza), metoda enzymoimunoeseje (β₂-M, IL-6R, ICAM-1, VCAM-1, ICTP, PINP a OPG) a technika kvantitativní sendvičové enzymatické imunoeseje (HGF, VEGF, syndecan-1/ CD₁₃₈ a Fas). Statistické šetření bylo prováděno s pomocí Pearsonova χ²-testu a testu dle Manna-Whitneye (p <0,05). Statisticky vysoce významné rozdíly v sérové hladině analyzovaných ukazatelů u MGNV vs. MM byly zjištěny v případě β₂-M, TK, ICTP, OPG, HGF a syndekanu-1 (p < 0,0001), méně významně v případě VCAM-1, PINP a VEGF (p = 0,003; 0,001 a 0,04) s chyběním rozdílnosti v případě Fas. S výjimkou thymidinkinázy (p = 0,014) a syndecanu-1 (p = 0,001) však nebyl zjištěn žádný statisticky významný rozdíl naměřených hodnot u jedinců s MGNV oproti nemocným s iniciální, asymptomatickou fází MM (stadium 1), praktickému využití těchto ukazatelů ale brání významné překrývání hodnot. Za neočekávaný nález nutno označit plynulou tendenci k poklesu sérových hodnot VEGF se stupněm pokročilosti MM (stadia 1–3 dle Durieho-Salmona).

Závěry.
Z předložené analýzy vyplývá, že přes přítomnost statisticky významné rozdílnosti sérových hladin 9 z 12 vyhodnocených biologických působků v souborech MGNV a MM, nepřináší žádný z těchto ukazatelů použitelný diskriminační potenciál pro rozlišení MGNV od iniciální, asymptomatické fáze MM v podmínkách klinické praxe.

Klíčová slova:
monoklonální gamapatie nejistého významu, mnohočetný myelom, thymidinkináza, angiogenní cytokiny, ukazatelé kostního metabolismu.

ÚVOD

Problematice etiopatogeneze a diferencovaného přístupu k jednotlivým typům monoklonálních gamapatií (MG) je věnována v posledních letech zvýšená pozornost. Dokladem je nejen koncepce „multistep“ etiopatogeneze mnohočetného myelomu (MM), zahrnující postupné změny od normálního plazmocytu přes monoklonální gamapatii nejistého významu (MGNV) k plně rozvinuté formě MM (1, 2), ale i recentní diagnostická IMWG (International Myeloma Working Group) kritéria MGNV a MM (3). Nelze pominout, že současná diagnostická kritéria MGNV a MM jsou v podstatě deskriptivní a založená na kvantitativním hodnocení běžně dostupných parametrů vyjadřujících vesměs jen velikost plazmocelulární masy a opomíjející ukazatele, vyjadřující vnitřní biologické vlastnosti plazmatických buněk i vlastnosti mikroprostředí kostní dřeně. Takto sestavený diagnostický systém proto nezabraňuje možnosti diagnostických nepřesností, a tím i terapeutických omylů. Je tedy přirozenou snahou odhalení takových ukazatelů, jež by prohloubily a zpřesnily současné možnosti odlišení MGNV od MM a jež by přispěly k časnému rozpoznání nástupu maligní transformace MGNV, neboť prognóza a léčebný postup jsou u těchto stavů diametrálně odlišné.

Náplní studie bylo srovnání rozdílů sérových hladin vybraných, tj. biologických působků uplatňujících se v patobiologii MM. Vedle klasických ukazatelů, tj.β₂-mikroglobulinu (β₂‑M) a thymidinkinázy (TK), se studie zaměřila na vyšetření solubilní formy receptoru IL-6 (sIL-6R), markerů angiogeneze hepatocytárního růstového faktoru (HGF) a vaskulárního endotelového růstového faktoru (VEGF), některých ukazatelů kostního obratu, karboxy-terminálního telopeptidu kolagenu typu-I (ICTP), N-terminálního propeptidu prokolagenu typu-I (PINP), osteoprotegerinu (OPG), ligandy aktivátoru receptoru nukleárního faktoru κB (RANKL), z cytoadhezivních molekul ICAM-1 (intercelulární adhezivní molekula typu-1) a VCAM-1 (vaskulární cytoadhezivní molekula typu‑1), ale i dalších ukazatelů s intimním vztahem k biologickým vlastnostem plazmatických buněk, tj. syndecanu-1 (CD₁₃₈) a Fas. Vzhledem k důrazu na možnost případného diagnostického využití v klinické praxi byly zhodnoceny rozdíly mezi sledovanými parametry u MGNV a jednotlivými stadii (1–3) a podstadii (A–B) MM, vyhodnocenými s pomocí klinického stážovacího systému dle Durieho-Salmona (D–S) (4) a s použitím třístupňové prognostické škály dle IPI (International Prognostic Index) (5).

Soubor pacientů a použité metody

Analyzovanou sestavu 268 nemocných tvořilo 89 jedinců s MGNV splňujících IMWG kritéria a 179 nemocných s MM splňujících SWOG (South West Oncology Group) i IMWG kritéria myelomu při diagnóze nemoci před zahájením cytostatické léčby (3, 4, 6).

Věkový medián souboru MGNV byl 62 (32–82) let, poměr muži/žena (M/Ž) byl 0,85, imunochemický typ IgG byl zastoupen v 70 % (n-62), IgA v 16 % (n-14), IgM v 7 % (n-7), biklonální ve 3,5 % (3), Bence-Jonesův typ ve 3,5 % (n-3); lehký řetězec ê se vyskytoval v 55 % (n-49) a ë ve 45 % (n-40). V souboru nemocných s MM byl věkový medián 64 (29–90) let, poměr M/Ž byl 0,79, imunochemický typ IgG byl zastoupen v 64,5 % (n-116), IgA ve 21 % (n-37), Bence-Jonesův ve 12 % (n-21), biklonální v 1 % (n-2), nesekreční v 1 % (n-2) a IgD v 0,5 % (n-1); výskyt lehkého řetězce ê a ë byl 63,5 % (n-113) a 36 % (n-65), nesekretorický typ 0,5 % (n-1). Při hodnocení stupně pokročilosti nemoci s pomocí klinického stážovacího systému dle D–S (4) bylo stadium 1 zastoupeno v 17 % (n-30), stadium 2 ve 28 % (n-50) a stadium 3 v 55 % (n-99); podstadium A v 75,5 % (n-135) a B ve 24,5 % (n-44). Při použití IPI (5) bylo stadium 1 zastoupeno v 17 % (n-31), stadium 2 ve 28 % (n-51) a stadium 3 v 55 % (n-97).

K vyšetření hladiny β₂-M byla použita metoda Immulite 1000 Siemens Medical Solutions Diagnostic (normální rozmezí β₂-M 0,1–2,5 mg/l), k vyšetření hladiny TK v séru byla použita radioenzymatická metoda (REA kit, Immunotech, Praha, 0–10 IU/l). Sérové hladiny IL-6R (10–90 ng/ml), VCAM-1 (395–714 ng/ml) a ICAM-1 (269–691 ng/ml) byly měřeny metodou enzymoimunoeseje (kity ELISA, Immunotech Praha), zatímco ICTP (0,3–6,0 μg/l) byl vyšetřen kitem ELISA, Orion Diagnostica Espoo, Finland, OPG (3,7–4,4 pmol/l) kitem ELISA Bio Vendor GmbH, PINP (normální hodnota < 50 let 16,3–73,9 μg/l) byla vyšetřena kitem Cobas 6000, Roche Diagnostic. Analýza sérové hladiny HGF (671–1992 pg/ml), VEGF (62–707 pg/ml), syndecanu-1/sCD₁₃₈ (37–123 ng/ml) a Fas (4792–17150 pg/ml) byla provedena technikou kvantitativní sendvičové enzymatické imunoeseje, a to kity Quantikine RD, Minneapolis). Veškerá měření byla prováděna podle doporučení výrobce, duplikátním způsobem a byla reprodukovatelná.

Ke statistickému hodnocení byl použití Pearsonův χ²-test a neparametrický U-test dle Manna-Whitneye na hranici významnosti p < 0,05. 

VÝSLEDKY

Z analýzy vyplynulo, že jedinci s MGNV se vyznačují ve srovnání s nemocnými s nově stanovenou diagnózou MM nižší sérovou hladinou některých z vyšetřených ukazatelů, zatímco u některých působků nebyly zjištěny podstatné rozdíly. Frekvence výskytu patologických hodnot sledovaných ukazatelů v souboru 89 jedinců s MGNV a v souboru 179 nemocných s MM vyplývá z grafu 1. Je zřejmé, že z hlediska procentuálního výskytu abnormálně zvýšených hodnot byla zaznamenána podstatná rozdílnost v případě β₂-M, TK, ICTP, OPG, HGF a syndecanu-1. Statistická analýza zaznamenala vysoce významné rozdíly mezi souborem MGNV a souborem s MM především v případě porovnání sérových hladin β₂-M, TK, ICTP, OPG, HGF a syndecanu-1, zatímco v případě IL-6R, ICAM-1 a Fas nebyl zjištěn žádný statisticky významný rozdíl (tab. 1). V případě β₂-M, TK, ICTP, OPG, HGF a syndecanu-1 byl zjištěn plynule narůstající rozdíl sérové koncentrace těchto působků vůči MGNV se stupněm pokročilosti nemoci (ve stadiu 2 a 3 dle D–S), zatímco v případě IL-6R a PINP byly statisticky významné rozdíly zaznamenány až při srovnání hodnot MGNV se stadiem 3, zato v případě ICAM-1 a Fas nebyla nalezena v hodnotách sérové koncentrace jakákoliv rozdílnost. Neočekávaným nálezem bylo zjištění nízkého zastoupení zvýšených hodnot VEGF u MGNV i MM (graf 1), především ale statisticky významný pokles sérové hladiny VEGF v rozvinuté fázi MM, tj. od stadia 1 ke stadiu 2 a 3 (tab. 2). Za nejvýznamnější zjištění je možno považovat nepřítomnost statisticky významné rozdílnosti výše hladin 11 z 12 analyzovaných biologických působků mezi souborem jedinců s MGNV a souborem nemocných s iniciální, asymptomatickou formou MM (stadium 1 dle D–S) s tím, že výjimkou byla pouze hladina TK. Z hlediska srovnání rozdílnosti výše procentuálního zastoupení abnormálních hodnot ve stadiu 1 (dle D–S) mnohočetného myelomu oproti MGNV byl patrný určitý rozdíl v případě sérových hladin ICAM-1 (21 vs. 7 %), OPG (15 vs. 32 %), HGF (6,5 vs. 17 %) a syndecanu-1 (15,5 vs. 26 %) (graf 1). Při porovnání nálezů u MGNV oproti podstadiím A a B, tj. s podsoubory MM s nepřítomností (podst. A) či s přítomností poruchy renální funkce (podst. B) byly patrny v podstadiu B zřetelně vyšší hodnoty β₂-M, ICTP, HGF a zejména syndecanu-1, v menší míře v případě TK a Fas. Statistická analýza však neshledala podstatnější rozdílnosti mezi souborem MGNV vs. podstadii A a B s výjimkou VCAM-1, VEGF, především ale v případě OPG a Fas.

Analýza vycházející z prognostické stratifikace MM podle IPI prokázala rovněž statisticky významnou závislost zjištěných rozdílů sérových hladin analyzovaných ukazatelů podle jednotlivých stadií stratifikační škály. Ve srovnání s MGNV byl patrný přirozený nárůst sérových hladin v případě β₂-M, TK, ICTP, OPG, HGF a syndecanu-1 s narůstajícím stupněm pokročilosti MM, tedy především v rozvinuté fázi MM ve stadiu 2 a 3, což se ale netýkalo molekul IL-6R, ICAM-1, VCAM‑1, PINP a Fas. V případě VEGF byl naproti tomu zaznamenán pokles sérových hladin se stupněm pokročilosti MM, tj. v rozvinuté fázi (od stadia 1 ke stadiu 2 a 3) (tab. 3, 4). Statistická analýza zaznamenala nejvyšší rozdílnost MM vůči MGNV ve stadiu 3 v případě β₂-M, TK, VCAM‑1, ICTP, PINP, OPG, HGF a syndecanu-1, v méně významné míře v případě IL-6R, ICAM-1, VEGF, a v mezní míře v případě Fas. Ve stadiu 2 byla přítomna rozdílnost pouze při srovnání sérové hladiny β₂-M, TK, ICTP, OPG, HGF a syndecanu-1. Srovnání souboru jedinců MGNV s nemocnými ve stadiu 1 MM prokázalo statisticky významné rozdíly pouze v případě β₂- M, syndecanu-1 a překvapivě i Fas. Snaha o vyšetření sérových hladin RANKL („receptor activator of nuclear factor – κB ligand“) se nesetkala s úspěchem, neboť u převážné většiny vyšetřených nemocných s MM byly sérové hodnoty RANKL < 0,08 pmol/l. 

DISKUZE

Z klinické praxe je známo, že rozlišení MGNV od iniciální, asymptomatické fáze mnohočetného myelomu je někdy značně obtížné, neboť i v současnosti není znám samostatný ukazatel, který by umožňoval spolehlivé odlišení obou prognosticky diametrálně odlišných stavů (7). Zatímco MGNV je benigní, případně premaligní diskretní klonální expanze plazmocelulární populace stabilizující se ještě před vývinem klinických projevů a nevyžadující proto cytostatickou léčbu, je MM i v současnosti progresivně se vyvíjející, v podstatě stále nevyléčitelné onemocnění s fatálním vyústěním. Vzhledem k tomu, že v klinicky orientovaných studiích byla věnována analýze rozdílnosti MGNV a iniciální fáze MM prozatím jen nedostatečná pozornost, soustředila se předložená studie na analýzu 12 biologických faktorů majících vztah k patogenezi a k progresi MM. Samotná progrese MM se vyznačuje monoklonální proliferací, disseminací a případně i cirkulací plazmocytů s poklesem apoptózy, vedoucí k akumulaci nádorových buněk (8). Za klíčový moment je považována úloha mikroprostředí kostní dřeně, ovlivňující cytokinetické vlastnosti myelomových buněk (9). Samotná adheze myelomových buněk k elementům stromatu vede k nadprodukci cytokinů podporujících buněčný růst a omezujících apoptózu. K nejvýznamnějším růstovým faktorům plazmocytů patří IL-6 a jeho solubilní receptor (sIL-6R) (10). VEGF zasahuje do patogeneze MM modulací účinku nukleárního faktoru κB  (NF-κB ), akcentujícího resorbční aktivitu osteoklastů, zatímco proliferace, migrace a přežití myelomových elementů jsou ovlivněny vzrůstající denzitou kapilární sítě v KD (11). Myelomové elementy jsou zdrojem HGF, pleiotropního cytokinu podporujícího proliferaci samotných myelomových buněk, jejich disseminaci v KD, zatímco inhibicí osteoblastů přispívá i k rozvoji myelomové kostní nemoci a angiogeneze KD (12). Migrace a invazivita myelomových buněk je podporována metaloproteinázami 2 a 9, modulovanými do jisté míry syndecanem-1 (CD₁₃₈), exprimovaným myelomovými buňkami a uvolňovaným z povrchu těchto buněk v solubilní formě do cirkulace (13). Vývin a aktivita osteoklastů závisí na vzestupu ligandy RANK (RANKL) zatímco OPG má efekt protichůdný. Zvýšená exprese Fas-L myelomovými buňkami odráží stupeň jejich zhoubnosti v důsledku intimního vztahu k apoptóze, je proto spojena s progresí MM (14). Mezi v současnosti uznávané, běžně dostupné, avšak nepříliš spolehlivé předpovědní faktory neoplastické transformace MGNV patří vysoké hodnoty MIg v séru a/nebo v moči, pokles hladiny normálních imunoglobulinů, přítomnost anémie, zvýšený výskyt atypických plazmocytů v KD, známky zvýšené kostní remodelace dokumentované elevací hodnot ukazatelů kostního obratu, vysoký počet cirkulujících plazmocytů v obvodové krvi, zvýšený proliferační index plazmocytů, patologická hodnota indexu monoklonality ê/ë vzešlá z vyšetření sérových hladin volných lehkých řetězců v séru, a zejména pozitivní nález při vyšetření skeletu a kostní dřeně s pomocí FDG-PET/CT, celotělové MRI a případně i ⁹⁹TcMIBI (6, 15, 16). Recentní studie naznačují, že k rozlišení MGNV od MM přispívá i srovnání výskytu normálních/polyklonálních plazmocytů v KD, buněčná exprese N-CAM/CD₅₆ (cytoadhezivní molekuly nervových buněk) či exprese IGF-1 („insulin like“ růstového faktoru) . Molekulární mechanizmy, uplatňující se v přechodu MGNV v MM zůstávají přes dílčí pokroky stále do značné míry neobjasněny (2). Proto i nadále zůstává v současnosti reálným, ovšem retrospektivním kritériem odlišení MGNV od MM dlouhodobá, klinicko-laboratorní stabilita stavu (17).

Předložená studie potvrdila, že mnohé z analyzovaných solubilních biologických působků uplatňujících se v patobiologii MM mají vztah nejen ke stadiu pokročilosti MM, ale liší se i z hlediska jejich sérových koncentrací od MGNV. Nynější analýza ověřila, že β₂-M, tento stále významný prognostický faktor MM, mající vztah ke stupni pokročilosti a k aktivitě MM, ke stavu renální funkce a k vnitřním biologickým pochodům v myelomové tkáni i k aktivitě T- a B-buněčného systému je v odlišení MGNV od iniciální fáze MM (stadií dle D–S) pro značné překrývání sérových hodnot nevhodný. V poněkud příznivějším světle se jevilo vyhodnocení hladiny TK, lišící se statisticky významně mezi jedinci s MGNV a stadiem 1 (D–S, nikoliv dle IPI) MM. Reálnému praktickému přínosu však brání nejen obdobný výskyt zvýšených hodnot u jedinců s MGNV ve stadiu 1, ale i nízká specificita s ovlivněním hladin různými imunopatologickými a zánětlivými stavy. K hodnocení IL-6R bylo přistoupeno vzhledem ke klíčovému postavení komplexu IL-6/IL-6R v interakci se signální molekulou gp130, úloze při aktivaci MAPK („mitogen-activated protein kinase“), mající úzký vztah k proliferaci a apoptóze myelomových buněk, důvodem byl i dříve prokázaný vztah k aktivitě, stadiu a k prognóze MM (18). Provedená analýza však ukázala, že zvýšené hodnoty IL-6R v séru byly přítomny u jedinců s MGNV a nemocnými v iniciální fázi MM v obdobné míře (58 a 65 %), nejde tedy o použitelný diskriminační ukazatel obou stavů. Důvodem k analýze sérových hladin ICAM-1 a VCAM-1 byla role, kterou obě cytoadhezivní molekuly mají v patogenezi MM, zejména v procesu osidlování kostní dřeně myelomovými buňkami a v jejich vlivu na proliferaci a přežívání myelomových elementů v mikroprostředí KD i v procesu extramedulárního šíření (19). Z provedené studie vyplynulo, že frekvence výskytu zvýšených hodnot i statistické srovnání hodnot ICAM-1 a VCAM-1 mezi jedinci s MGNV a nemocnými v 1. stadiu MM (dle D–S i IPI) vyznělo nevýznamně. K příčinám patří nepochybně rozmanitost vlivů ovlivňujících uvolňování obou CAM z povrchu buněk mikroprostředí KD a zřejmě i odlišné chování solubilních forem obou CAM v porovnání s formami exprimovanými na membránách buněk. Pouze statisticky významné zvýšení hodnot VCAM-1, nikoliv ICAM-1 ve 2. a 3. stadiu MM (dle D–S) oproti MGNV zapadá do předchozích pozorování uvádějících, že zvýšené hodnoty CAM jsou výrazem odezvy organizmu na přítomnost rozsáhlého nádorového procesu (19). Již z definice MGNV i MM vyplývá, že naprosto stěžejním kritériem v odlišení obou stavů jsou projevy myelomové kostní nemoci jako důsledek poruchy funkční homeostázy osteoklastů a osteoblastů jako vyústění dysbalance osy RANKL/OPG (20, 21). Samotné myelomové elementy indukují zvýšenou expresi RANKL s poklesem dostupnosti OPG v mikroprostředí KD, což vede k vystupňované osteoklastogenezi. Je tedy nasnadě, že již v iniciální fázi MM lze očekávat změnu sérových hladin osteogenních působků, a to ještě před průkazem postižení skeletu s pomocí MRI, ⁹⁹TcMIBI a FDG-PET/CT. Z předchozích studií vyplývá, že citlivým indikátorem rozdílnosti kostní resorpce u MGNV a iniciální fáze MM (stadium 1) je ICTP, tedy klíčový a vysoce citlivý ukazatel osteoklastické resorpce (21–23). I tato studie potvrdila zvýšení sérové hladiny ICTP u 3/4 nemocných s MM, naneštěstí ale i u 1/3 nemocných s MGNV. Přestože byl opakovaně prokázán úzký vztah hladin ICTP ke stupni pokročilosti MM (15, 22), námi provedená analýza odhalila chybění statisticky významného vztahu mezi MGNV a iniciální, asymptomatickou fází MM (stadium 1), a to s obdobným výskytem abnormních hodnot i s obdobnou hladinou ICTP u obou srovnávaných stavů, což činí použití tohoto ukazatele v odlišení MGNV od iniciální fáze MM prakticky nemožným. V souladu s ojedinělými předchozími studiemi vyznělo velmi rozpačitě i hodnocení sérové hladiny PINP, tedy ukazatele, vyjadřujícího stupeň osteoblastické aktivity a kostní novotvorby (15, 22). Jeho sérové hladiny byly v normálním rozmezí a v obdobné koncentraci u většiny jedinců s MGNV i s MM (88 a 69 %), což je v souladu s předchozím zjištěním (22). PINP tedy není rovněž vhodným parametrem, který by rozšiřoval možnosti odlišení obou stavů. Z hlediska dosavadních zkušeností je zatím dosti nepřehledná situace v hodnocení přínosu vyšetření sérových hladin OPG. Z některých analýz vyplývá, že u MM jsou sérové hodnoty OPG sníženy (24, 25), což je v souladu s imunohistochemickým průkazem snížení exprese OPG v osteoblastech kostní trámčiny (20). Závěry jiných studií ale vyzněly odlišně, neboť ve srovnání s kontrolní skupinou byly hodnoty nalezené u MGNV a u MM zvýšené (26), přičemž mezi MGNV a MM nebyl zjištěn významný rozdíl (26). I když v naší studii byla frekvence výskytu zvýšených hodnot OPG mezi MGNV a MM výrazně odlišná (15 vs. 73 %), rozdíly v sérových koncentracích byly vázány pouze na stadium 2 a zejména 3 (dle D–S i IPI), přičemž u nemocných s projevy poruchy renální funkce (podstadium B) byly zjištěné rozdíly zřetelně významnější. Velmi blízká koncentrace této molekuly u jedinců s MGNV a iniciálním stadiem MM (stadium-1 dle D–S i IPI) učinila i tuto molekulu v diferenciaci obou stavů nepřínosnou. Příčinou je pravděpodobně i skutečnost, že stanovení cirkulující solubilní formy OPG neodráží spolehlivě aktivitu OPG v mikroprostředí KD, neboť sérový OPG má i jiné zdroje včetně kapilární sítě, v níž OPG je antiapoptotickým faktorem endotelových buněk. K zamýšlenému hodnocení indexu RANKL/OPG jsme nepřistoupili vzhledem k naměření uniformně velmi nízkých hodnot sérových hladin RANKL. Je všeobecně známo, že mezi významné nálezy, odlišující MGNV od MM patří i hustota kapilární sítě v KD, neboť MGNV je považována za stav „preangiogenní“, zatímco MM za stav „vaskulární“ (11, 27). Zvýšená neoangiogeneze KD u MM je vyvolána zejména nadměrnou produkcí potentních proangiogenních cytokinů typu VEGF, HGF, bFGF klonálními plasmocyty (11, 27, 28), stimulujícími vaskulogenní diferenciaci CD34+ buněk a migraci i proliferaci endotelových buněk (1, 29). Ze závěrů předchozích studií vyplývá, že vztah sérových hladin HGF a VEGF ke stupni pokročilosti a k prognóze MM nevyznívá souhlasně, neboť existují sdělení popisující pozitivní (11, 27, 30) i chybějící vztah (29), přičemž zcela neujasněna je situace v případě porovnání poměrů u MGNV a MM. Z naší analýzy vyplynulo, že sérové hladiny HGF byly zvýšeny u 38 % nemocných s MM, tedy obdobně jako ve studii nacházející zvýšení HGF v séru u 43 % nemocných s MM (31), zatímco zvýšená koncentrace HGF v séru byla u MGNV v naší analýze pouze u 6,5 % jedinců. Statisticky významné rozdíly byly ale vázány pouze na srovnání s rozvinutou formou MM, tedy stadium 2 a 3. Přes uvedená zjištění nelze považovat sérovou hladinu HGF za použitelný diferenciační ukazatel přispívající k odlišení MGNV od iniciální-asymptomatické fáze myelomu (stadium 1), neboť u těchto stavů se sérové koncentrace HGF prakticky neliší. Z dosavadních studií vyplývá, že VEGF, tento vysoce potentní proangiogenní peptid se uplatňuje nejen v akceleraci angiogeneze, ale i v progresi MM, v rozvoji myelomové kostní nemoci a v rezistenci k léčbě, přičemž jeho hladina po úspěšné chemoterapii klesá (16, 29). Naše analýza ale prokázala oproti očekávání překvapivou tendenci ke snižování sérových hladin VEGF se stupněm pokročilosti MM (stadia 1–3 dle D–S i IPI) a s inverzní statistickou významnou odlišností hladin u MGNV a MM ve stadiu 3. K obdobnému závěru ale dospěla i jedna z předchozích studií, jež rovněž nalezla nižší hodnoty VEGF v séru u nemocných stadií 2 a 3 nežli ve stadiu 1 (29), nikoliv ale další studie, která zaznamenala opačný trend (16). I u VEGF nebyl shledán rozdíl mezi MGNV a iniciální fází MM (stadium 1) z hlediska výskytu odchylných hodnot i souhrnných rozdílů v sérové hladině tohoto angiogenního působku, což je v plném souladu s předchozí obdobně strukturovanou analýzou (29). Za příčiny toho úkazu lze vedle přirozeně chybějící rozdílnosti u obou srovnávaných stavů vzít v potaz i použitý typ analytické metody i možnost dalších zdrojů této molekuly, například uvolnění VEGF z krevních destiček v průběhu srážení krve, ovlivňující konečnou výši sérové koncentrace VEGF (32). Syndekan-1 (CD₁₃₈), transmembránový glykoprotein uvolňovaný z povrchu neoplastických plazmocytů je jedním z ústředních regulačních působků uplatňujících se v patobiologii MM, neboť se podílí na vazbě komponent extracelulární matrix, v modulaci řady působků cytokinové sítě i na zpětném ovlivnění chování myelomových buněk a na stimulaci aktivity osteoblastů a útlumu činnosti osteoklastů (33–35). Jde především o znak viabilních myelomových plazmocytů (CD38+ CD45-, CD56+), jehož exprese se rychle vytrácí v průběhu apoptózy. Předchozí studie prokázaly vztah zvýšené hodnoty syndekanu-1 v séru k hodnotě β₂-M, k hladině MIg v séru i k výši odpadu B-J bílkoviny močí, k prognóze MM, a k rozsahu nádorové masy ale i k masivitě infiltrace KD myelomovými plasmocyty a k aktivitě nemoci (13, 33, 35, 36). Výskyt zvýšených hodnot syndekanu-1 v séru nemocných s MM uváděný v literatuře kolísá v rozmezí 35–79 % (13, 33, 35), v našem souboru byly zvýšené hodnoty u 60,5 % nemocných. Námi zjištěný úzký vztah hladin syndekanu-1 ke stupni pokročilosti nemoci (ke stadiu 2 a 3), deklarovaný obdobně i v řadě předchozích studií (33, 35–37) se neshoduje se závěry některých dalších autorů (34, 38). Námi pozorovaný, statisticky významný rozdíl mezi hladinami syndekanu-1 mezi MGNV a MM je ale vázán na rozvinutou formu MM ve stadiu 2 a 3, zatímco rozdíly mezi MGNV a stadiem 1 byly statisticky nevýznamné při hodnocení dle D–S, ale významné při použití stratifikace dle IPI. Uvedené zjištění je v souladu se závěry studií, které sice považují syndekan-1 za excelentní marker plazmocytů, nepřispívající ale k odlišení MGNV od MM (38, 39). I když hodnocení koncentrace solubilní formy syndekanu-1 u MM je přínosné, není ani tento parametr prospěšný z hlediska praktického odlišení MGNV od iniciální, asymptomatické fáze MM. Fas (Apo-1/CD₉₅) je transmembránový receptor, uplatňující se v případě zkřížené vazby s Fas ligand v indukci buněčné apoptózy (40). Většina myelomových buněk exprimuje na svém povrchu proapoptotický Fas antigen, takže porucha jeho funkce se může uplatňovat v progresi MM (40). Je známo, že solubilní forma Fas antigenu se uplatňuje při ochraně myelomových buněk před apoptózou, čímž přispívá k progresi MM. Přes tato východiska naše studie neodhalila žádný praktický přínos měření sérové koncentrace Fas u MGNV a MM, neboť téměř u všech jedinců s MGNV a u všech nemocných v iniciálním stadiu MM (stadium 1), byly sérové hladiny v pásmu normálních hodnot. 

ZÁVĚR

Ze studie vyplývá, že nalezení nových a snadno technicky dostupných diskriminačních ukazatelů, které by vhodným způsobem obohatily naše současné možnosti odlišení MGNV od iniciální, asymptomatické fáze (stadium 1) MM je velmi svízelný úkol. Z analýzy 12 parametrů majících vesměs velmi úzký vztah k biologickým vlastnostem myelomové tkáně a/nebo mikroprostředí KD byl zjištěn výrazný, statisticky významný rozdíl sérových hladin u MGNV vs MM v případě β₂-M, TK, ICTP, OPG, HGF a syndecanu-1, v menší míře u VCAM-1, PINP a VEGF. Hlubší analýza, porovnávající MGNV s iniciální, asymptomatickou fází MM (stadium 1) ale ukázala, že určitým příspěvkem by mohla být pouze hladina TK a syndecanu-1, jejich skutečný praktický přínos ale omezuje malá specificita a výrazné vzájemné překrývání naměřených hodnot. Je tedy nasnadě, že splnění vytyčeného úkolu vyžaduje budoucí zaměření na více sofistikované metody, například molekulárně-biologické techniky, genovou expresní analýzu, proteomiku či imunofenotypickou analýzu plazmatických buněk, jež by se mohly podstatně přínosněji podílet na včasném odlišení MGNV od iniciální fáze MM a identifikaci iniciální fáze maligní transformace MGNV nežli dosavadní, a to i v předložené studii analyzované postupy. 

Zkratky

β₂-M             – β₂-mikroglobulin

B-J bílkovina  – Bence-Jonesova bílkovina

CAM              – cytoadhezivní molekula

CD₁₃₈             – syndecan-1

D–S                – stážovací systém dle Durieho-Salmona

ELISA            – analýza charakteru enzymoimunoeseje

FDG-PET/CT – fluoro-deoxy-glukóza – pozitronová emisní tomografie/počítačová tomografie

HGF               – hepatocytární růstový faktor (hepatocyte growth factor)

ICAM-1         – intercelulární cytoadhezivní molekula typu-1 (intercellular adhesive molecule-1)

ICTP              – C-terminální telopeptid kolagenu typu-I (intercellular C-terminal telopeptide collagen-I)

IL-6               – interleukin-6

IL-6R             – receptor interleukinu-6

IMWG            – International Myeloma Working Group

IPI                 – Mezinárodní prognostický index (International Prognostic Index)

IU                  – mezinárodní jednotka (International Unit)

KD                 – kostní dřeň

M                   – muž

MAPK           – „mitogen-activated protein kinase“

MG                 – monoklonální gamapatie

MGNV            – monoklonální gamapatie nejistého významu

MIg                – monoklonální imunoglobulin

MM                – mnohočetný myelom

MRI               – nukleární magnetická rezonance (magnetic resonance imagine)

NF-κB             – nukleární faktor κB

NS                  – nesignifikantní vztah

OPG               – osteoprotegerin

PINP              – intaktní N-terminální peptid prokolagenu (N-terminal peptide procolagen-I)

RANKL          – liganda aktivátoru receptoru nukleárního faktoru- κB (receptor activator of nuclear factor-κB ligand)

REA               – radioenzymatická analýza

RIA                – radioimunoanalýza

SWOG            – South West Oncology Group

TK                 – thymidinkináza

VCAM-1        – vaskulární cytoadhezivní molekula typu-1 (vascular cell adhession molecule-1)

VEGF             – vaskulární endotelový růstový faktor (vascular endothelial growth factor)

Ž                    – žena 

Práce byla podpořena grantem IGA MZ ČR NR 9500-3.

Adresa pro korespondenci:

prof. MUDr.Vlastimil Ščudla, CSc.

3. interní klinika LF UP a FN Olomouc

I. P.Pavlova 6, 775 20 Olomouc