Projekty oceněné za mimořádné výsledky

Vážení čtenáři,

redakce Časopisu lékařů českých uveřejňuje anotace nejlépe hodnocených výzkumných projektů, realizovaných v rámci Interní grantové agentury Ministerstva zdravotnictví ČR. Věříme, že vás informace o nejúspěšnějších projektech zaujmou.

prof. MUDr. Jiří Horák

vedoucí redaktor Časopisu lékařů českých

PROJEKTY OCENĚNÉ ZA MIMOŘÁDNÉ VÝSLEDKY CENOU MINISTRYNĚ ZDRAVOTNICTVÍ UDĚLENOU V ROCE 2009

Studium kandidátních genů a jejich role v patogenezi diabetes mellitus 2. typu a gestačního diabetu

Hlavní řešitelka: RNDr. Běla Bendlová, CSc.

Endokrinologický ústav Praha (2004–2008)

Cukrovka – diabetes mellitus dnes patří k nejrozšířenějším civilizačním chorobám. Největší skupinu diabetiků představují pacienti s diabetem 2. typu (DM2). Nezanedbatelnou skupinu nemocných s diabetem tvoří gestační diabetičky, které jsou následně vystaveny vysokému riziku DM2. DM2 je silně geneticky podmíněn. K rozvoji onemocnění dochází v důsledku interakcí řady vnějších faktorů s genetickými – diabetes je typickým komplexním, polygenním, multifaktoriálním onemocněním. Cílem genetických studií je odhalit genetické determinanty, které ovlivňují predispozici jedince ke glukózové intoleranci.

V rámci projektu IGA MZ ČR NR/7809-5:

1. Byly kompletovány a velmi podrobně charakterizovány rozsáhlé soubory diabetiků 2. typu, prvostupňových potomků diabetiků, žen s gestačním diabetem a kontrol. V letech 2004–2008 bylo celkem vyšetřeno 520 osob. Bylo provedeno více než 400 orálních glukózových tolerančních testů a přes 160 intravenózních inzulínových tolerančních testů. Bylo zjišťováno přibližně 180 klinicko-biochemických a antropometrických parametrů. Byla vytvořena a průběžně upravována databáze Access, do které jsou všechna data ukládána.
2. Pro potřeby genetického výzkumu byly v naší laboratoři zavedeny a validovány další molekulárně genetické metody, jako např. TaqMan či high resolution melting analýza, které umožnily zvýšit především kapacitu prováděných stanovení.
3. Bylo genotypováno více než 30 polymorfismů aktuálně vybraných kandidátních genů, což představuje řádově desetitisíce analýz, a studován jejich možný vliv na rozvoj diabetu 2. typu, gestačního diabetu a na rozvoj metabolického syndromu a obezity.
4. Byla získána prioritní data týkající se frekvencí těchto polymorfismů v české populaci. Byly nalezeny některé asociace polymorfismů s antropometrickými či klinicko-biochemickými parametry. Zdá se však, že vliv většiny studovaných polymorfismů je v patogenezi diabetu 2. typu, gestačního diabetu a metabolického syndromu u české populace spíše minoritní. Jejich vliv je však třeba v budoucnu opakovaně vyhodnocovat u rozšířených souborů a v interakcích s dalšími geny či vnějšími faktory.
5. Naše rozsáhlé a podrobně charakterizované kompletované soubory posloužily i k dalším zajímavým studiím. Byl například zhodnocen vliv hormonální antikoncepce na metabolické parametry, výskyt metabolického syndromu u nediabetických jedinců, vliv DHEA(S) na inzulínovou senzitivitu aj.

Za nejvýznamnější výstupy považujeme:

a) Studii námi vytipovaného kandidátního genu LRP5, který je koreceptorem účastným ve Wnt signalizační kaskádě. Zjistili jsme, že polymorfismus C/T (A1330V, rs3736228) asociuje s hladinami lačného i stimulovaného C‑peptidu a inzulínu. Gen pro LRP5 by tak mohl být dalším kandidátním genem ovlivňujícím funkci pankreatických beta buněk (publikace nominována na cenu 10^th Royan International Research Award).

b) Studii, která potvrzuje význam interakce genového polymorfismu Pro12Ala (rs1801282) genu PPARG2 s hladinami a složením mastných kyselin.

Výstupem projektu je 15 publikací (celkový IF = 16,103), 8 kapitol v monografiích, 23 prezentací na mezinárodních a 26 na tuzemských konferencích, 4 vyzvané přednášky, 4 diplomové a 3 dizertační práce.

Klasifikace dyslipidémií založená na koncentraci apolipoproteinu B a triglyceridů

Hlavní řešitel: prof. MUDr. Helena Vaverková, CSc.

Univerzita Palackého v Olomouci, Lékařská fakulta

Spoluřešitel: ing. Dalibor Novotný, PhD.

Fakultní nemocnice Olomouc

V nedávné době byla publikována řada prací, které poukazují na skutečnost, že apolipoprotein apoB je lepším ukazatelem rizika ischemické choroby srdeční (ICHS) i dalších kardiovaskulárních onemocnění než LDL-cholesterol (LDL-C), a to nejen před zahájením hypolipidemické léčby, ale i v jejím průběhu. V souvislosti s těmito fakty byla navržena též nová klasifikace dyslipidémií, založená na koncentraci apoB (marker počtu aterogenních částic) a triglyceridů (ukazatel přítomnosti inzulínové rezistence). Tato klasifikace dělí dyslipidémie do 4 dyslipidemických fenotypů (DLP) podle apoB < 1,2 nebo ≥ 1,2 g/l a TG < 1,5 nebo ≥ 1,5 mmol/l.

Ve výše uvedeném projektu jsme zhodnotili asociaci jednotlivých DLP s ukazateli inzulínové rezistence (IR), zánětu, hemostázy, subklinické aterosklerózy a s vybranými DNA markery. Na celém souboru jsme se pak snažili prokázat, u kterých subpopulací je apoB lepším ukazatelem rizika než LDL-C.

V rámci tohoto projektu jsme postupně vyšetřili 505 osob s různými typy dyslipidémií, které nebyly dosud léčeny hypolipidemiky nebo měly hypolipidemickou léčbu dlouhodoběji vysazenu.

Hypertriglyceridemické DLP vykazovaly známky zvýšené IR, zánětu, endoteliální dysfunkce/hemostázy a nižší adiponektin. Adiponektin koreloval negativně s parametry IR, zánětu a s aktivitou ALT a GGT. Asociace adiponektinu s ALT a GGT byla nezávislá na parametrech IR a viscerální obezitě, což svědčí pro jeho možnou roli při vzniku nealkoholické steatózy jaterní.

Adiponektin však překvapivě pozitivně koreloval s koncentracemi solubilních adhezivních molekul sVCAM-1, což nasvědčuje tomu, že může mít nejen vlastnosti protizánětlivé (negativní korelace s hsCRP) a z hlediska aterosklerózy protektivní, ale i prozánětlivé, které by se mohly negativně projevit u specifických populací, jako je například srdeční selhání nebo pokročilá ateroskleróza. Tento nález je ve světovém písemnictví ojedinělý a v současnosti byl podpořen výsledky experimentálních studií na několika pracovištích.

DLP4 je charakteristický pro familiární kombinovanou hyperlipidémii (FKH). Hyperlipidemičtí členové FKH rodin měli zvýšenou IR, endoteliální hemostatické markery, nižší koncentrace adiponektinu, nižší flow mediated dilatation (FMD) a vyšší intimomediální tloušťku (IMT). Normolipidemičtí jedinci FKH měli ještě normální IMT, ale sníženou FMD, která korelovala s markery IR. Je tedy možné, že u FKH předchází IR plnému vyjádření dyslipidémie.

Přítomnost subklinické aterosklerózy (IMT a pláty v karotickém řečišti) se zvyšovala od DLF1 po DLP4, podobně jako apoB/apo A-1. Přítomnost alely ε4 polymorfismu apoE a metabolického syndromu zvyšovaly prevalenci aterosklerotických plátů v karotickém řečišti.

V celém našem souboru měli jedinci s hladinami apoB vyššími, než predikováno regresní rovnicí apoB vs LDL-C, výraznější známky IR, častější metabolický syndrom a aterogennější rizikový profil. Zejména u diabetiků, metabolického syndromu, obezity a při přítomnosti KV onemocnění je tedy apoB lepším ukazatelem rizika než LDL-C. S narůstající epidemií obezity se navržená klasifikace dyslipidémií jeví jako racionální, neboť u této populace LDL-C může riziko aterosklerózy významně podhodnocovat.

Seznam nejdůležitějších prezentací výsledků s dedikací projektu NR/9068-3:

Publikace

1. Vaverková H. Adiponektin – nový spojující článek mezi zánětem, inzulinovou rezistencí a aterosklerotickým kardiovaskulárním onemocněním? Kardiofórum 2006; 4(3): 1–4.

2. Karásek D, Vaverková H, Halenka M, Budíková M, Novotný D. Brachial endothelial function in subjects with familial combined hyperlipidemia and its relationships to carotid artery intima-media thickness. Int Angiol 2006; 25(4): 418–426. IF 0,808

3. Vaverkova H, Karasek D, Novotny D, Jackuliakova D, Halenka M, Lukes J, Frohlich J. Positive association of adiponectin with soluble vascular cell adhesion molecule sVCAM-1 levels in patients with vascular disease or dyslipidemia. Atherosclerosis 2008; 197(2): 725–731. IF 4.287

4. Vaverková H. Hypertriglyceridemický pas: jednoduchý ukazatel kardiometabolického rizika. Souč klin praxe (Curr clin practice) 2007; 6(2): 35–42.

5. Karásek D, Vaverková H, Halenka M, et al. Endothelial haemostatic markers in members of families with familial combined hyperlipidemia“. Thrombosis Research 2009; 123: 466–475 (doi:10.1016/j.thromre 2008.02.011). IF 2,038

6. Jackuliaková D, Vaverková H, Karásek D. Relationship between familial combined hyperlipidemia and insulin resistance. Vnitř Lék 2008; 54(11): 1045–1053.

7. Novotný D, Vaverková H, Karásek D, Halenka M, Lukeš J, Slavík L, Bartková M, Schneiderka P. Vztah mezi jednonukleotidovým polymorfismem +276 G>T na genu pro adiponektin a markery inzulinové rezistence u dyslipidemických pacientů. Klin Biochem Metab 2008; 16(37): 178–182.

8. Novotný D, Vaverková H, Karásek D, Halenka M. Adiponektin – parametr s protizánětlivým a protiaterogenním potenciálem. Klin Biochem Metab 2008; 16(37): 171–177.

9. Vaverková H, Karásek D, Novotný D, Jackuliaková D, Lukeš J, Halenka M, Frohlich, J. Apolipoprotein B versus LDL-cholesterol: Association with other risk factors for atherosclerosi Clinical Biochemistry 2009; 42: 1246–1251. IF 1.926

Aplikace výsledků projektu do klinické praxe

Na základě výše uvedených prací byly pro osoby s kardiometabolickým rizikem zakomponovány cílové hodnoty apoB do Doporučení pro diagnostiku a léčbu dyslipidémií ČSAT (Vaverková H, Soška V, Rosolová H, Češka R, et al. Vnitř Lék 2007; 53(2): 181–197, další publikace těchto doporučení v Cor Vasa 2007; 49: 73–84, Čas Lék čes 2007; 146: 1–15 a DMEV 2007; 10: 106–118). Tytéž cílové hodnoty apoB byly přijaty o rok později ve společném prohlášení ADA/ACCF, publikovaném v časopise Diabetes Care (Diabetes Care 2008; 31: 811–822).

Získaná ocenění

1. Cena České internistické společnosti pro autory do 35 let za publikaci v odborném časopise v roce 2006: Karásek D, Vaverková H, Halenka M, Budíková M, Novotný D. Brachial endothelial function in subjects with familial combined hyperlipidemia and its relationships to carotid artery intima-media thickness. Int Angiol 2006; 25(4): 418–426. IF 0,808
2. Cena České společnosti pro aterosklerózu za nejlepší publikovanou původní práci (pro autory do 40 let) za rok 2007/2008: Karásek D, Vaverková H, Halenka M, Novotný D, Slavík L. Endothelial haemostatic markers in members of families with familial combined hyperlipidemia. Thromb Res 2009; 123(3): 466–475. Epub 2008 Apr 16. IF 2,038
3. Cena České internistické společnosti pro autory bez rozdílu věku za publikaci v odborném časopisu: Vaverkova H, Karasek D, Novotny D, Jackuliakova D, Halenka M, Lukes J, Frohlich J. Positive association of adiponectin with soluble vascular cell adhesion molecule sVCAM-1 levels in patients with vascular disease or dyslipidemia. Atherosclerosis 2008; 197(2): 725–731. IF 4.287

Výchova a příprava mladých lékařů pro vědecko-výzkumnou práci

Podpora tohoto projektu umožnila též výchovu nových pracovníků v oboru poruch lipidového metabolismu a aterosklerózy. Na projektu se účastnila 1 studentka postgraduálního doktorandského studia – MUDr. Dagmar Jackuliaková (kombinovaná forma studia). Dvě výše uvedená ocenění prací MUDr. Davida Karáska, PhD. byla v kategorii ve věku do 35–40 let.

Adaptorové molekuly u leukémií

Hlavní řešitel: MUDr. Jan Zuna

Univerzita Karlova v Praze, 2. lékařská fakulta

Spoluřešitel: MUDr. Karel Švojgr

Transmembránové adaptorové proteiny nemají enzymatickou nebo kinázovou funkci, ale jsou zapojeny do přenosu signálu z buněčného povrchu do buněčného jádra. Na zvířecím modelu vede změna exprese adaptorové molekuly PAG k obrazu leukémie. V naší studii byly vyšetřovány adaptorové molekuly PAG, LAT a NTAL ve fyziologických lymfocytárních prekurzorech a na souboru 75 diagnostických vzorků dětské akutní lymfoblastické leukémie (ALL). Byla analyzována exprese těchto molekul na mRNA úrovni (metodou kvantitativní reverzně-transkriptázové polymerázové řetězové reakce) a na úrovni proteinu (pomocí průtokové cytometrie). V průběhu fyziologické lymfocytární maturace se hladina některých adaptorů signifikantně mění mezi jednotlivými stadii. V různých podtypech ALL je možno sledovat odlišnou dynamiku exprese jednotlivých molekul, zejména TEL/AML1 pozitivní pacienti jsou charakterizováni unikátním profilem exprese. Hladina NTAL při diagnóze T-ALL je prognosticky významným faktorem predikujícím odpověď na iniciální léčbu kortikosteroidy. Tento jev se podařilo potvrdit i v in vitro experimentu – při inkubaci s kortikoidy je procento přežívajících buněk vyšší u nativní NTAL neexprimující linie T-buněčné leukémie než u stejné linie s transfekovaným genem NTAL.

Úloha Helicobacter pylori při vzniku a vývoji orofaryngeálních patologií

Hlavní řešitel: doc. MUDr. Jaromír Astl, CSc.¹

Spoluřešitelé: prof. MUDr. Jan Betka, DrSc.¹, prim. Pavol Jablonický¹, MUDr. Petr Laštůvka¹, MUDr. Petr Lukeš¹, MUDr. David Veselý, PhD. ¹, MUDr. Jaroslav Betka¹,

prof. MUDr. Ivan Šterzl, DrSc.², MUDr. Emil Pavlík, CSc.², MUDr. Pavlína Hrdá, CSc.², RNDr. Běla Potužníková²

¹Univerzita Karlova v Praze, 1. lékařská fakulta, Klinika otorinolaryngologie a chirurgie hlavy a krku FN Motol

²Univerzita Karlova v Praze, 1. lékařská fakulta, Ústav imunologie a mikrobiologie VFN

Cílem projektu bylo zjistit, jakou úlohu sehrává Helicobacter pylori v patogenezi onemocnění orofayngu. Metodika práce byla založena na průkazu infekce H. pylori real-time PCR a jejich genotypizaci u tří skupin nemocných. S rekurentní tonzilitidou, OSAS (obstrukčním spánkovým apnoickým syndromem) a karcinomem tonzily. Dále byla vyšetřena krevní séra na protilátky cag A. Tkáně orofaryngu byly analyzovány imunohistochemicky.

1. Byla zjištěna a jednoznačně potvrzena kolonizace tonzil H. pylori. Byla provedena genotypizace H. pylori z orofaryngu. Tato zjištění lze považovat za prioritní.
2. Bylo prokázáno, že je v oblasti orofaryngu častěji cag A negativní genotyp H. pylori při srovnání s nálezy v žaludku.
3. Byla prokázána infekce H. pylori nejen u rekurentních tonzilitid, ale i u nemocných s OSAS.
4. Zjištěné výsledky neprokazují příčinný vztah mezi infekcí H. pylori a karcinomem orofaryngu.

Na druhé straně nelze infekci H. pylori považovat za onemocnění bez vlivu na lokální imunitu. H. pylori může modifikovat lokálně stav imunosuprese, a tak nepřímo podporovat vývoj či vznik nádorových onemocnění. H. pylori může ovlivnit produkci některých cytokinů a typ odpovědi Th1 i Th2.

Výsledky práce, které byly publikovány v průběhu řešení grantového projektu, byly oceněny Společností pro epidemiologii a mikrobiologii ČLS JEP udělením Ceny profesora Karla Rašky za významné publikace v oborech epidemiologie a mikrobiologie za rok 2007.

Vývoj a aplikace nových elektroforetických technik k zajištění kvality a bezpečnosti léčiv

Hlavní řešitelka: doc. RNDr. Marie Pospíšilová, CSc.

Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové

Cílem projektu bylo vypracování elektroforetických (CE) technik jako validovaných kontrolně-analytických metod pro selektivní analýzu léčiv syntetického původu, jejich nečistot nebo degradačních produktů a aplikace těchto metod na kontrolu jakosti hromadně vyráběných farmaceutických přípravků za účelem zajištění jejich kvality a bezpečnosti. Konkrétně se jednalo o stanovení ibuprofenu a flurbiprofenu v 10 různých přípravcích CE metodou s UV detekcí (1), mannitolu a sorbitolu v infuzních roztocích CE metodou s UV detekcí (2) a stanovení ketoprofenu, methylparabenu a propylparabenu v polotuhých přípravcích micelární elektrokinetickou chromatografií (3). Vypracované elektroforetické metody mohou nahradit méně produktivní, neselektivní nebo málo citlivé lékopisné metody.

Dalším předmětem výzkumu byl vývoj nových analytických postupů pro separaci přírodních antioxidantů (flavonoidy, aromatické hydroxykyseliny, bioflavonoidy a jiné fenolické látky) s využitím on-line kombinace kapilární izotachoforézy a CE. Navržené metody jsou využitelné pro identifikaci a stanovení vybraných obsahových látek v extraktech z farmaceuticky významných rostlinných drog, které jsou často součástí fytofarmak, parafarmaceutik nebo různých nutraceutik (4–6). Byl vyřešen problému analýzy složitých směsí elektroneutrálních přírodních polyhydroxy sloučenin metodou CE s využitím wolframanového aniontu jako komplexotvorného selektoru, tvořícího s uvedenými analyty aniontové komplexy. Možnost praktického využití CZE metody s nově vyvinutým wolframanovým základním elektrolytem (BGE) byla demonstrována na stanovení obsahu hyperosidu a rutinu v extraktech z listů třezalky tečkované (Hypericum perforatum) (7). V rámci řešení projektu zaujímá významné místo studium problematiky analýzy glukosamin sulfátu, látky tělu vlastní, která je součástí doplňků stravy a léčivých přípravků indikovaných při artróze. Byla vyvinuta a validována nová originální a velmi rychlá CZE metoda pro přímé a dostatečně citlivé stanovení glukosaminu ve čtyřech komerčních přípravcích, doplňcích stravy s využitím bezdotykové vodivostní detekce (8).

Validované elektroforetické metody jsou určeny ke kontrole kvality chemických léčiv a fytofarmak, a tím mohou zásadně přispívat k moderní, efektivní a bezpečné terapii.

Publikace

1. Hamoudová R, Pospíšilová M. J. Pharm Biomed Anal 2006; 41: 1463–1467. IF 1,889

2. Pospíšilová M, Polášek M, Šafra J, Petriška I. J Chromatogr A 2007; 1143: 258–263. IF 3,554

3. Šafra J, Pospíšilová M. J Pharm Biomed Anal 2008; 48: 452–455. IF 2,032

4. Šafra J, Pospíšilová M, Spilková J. Chromatographia 2006; 64: 37–43. IF 1,171

5. Hamoudová, R, Pospíšilová, M, Spilková, J. Electrophoresis 27, 4820–4826. 2006, IF 3,850

6. Šafra J, Pospíšilová M, Honegr J, Spilková J. J Chromatogr A 2007; 1171: 124–132. IF 3,554

7. Jáč P, Polášek M, Batista AIV, Kaderová L. Electrophoresis 2008; 29: 843–851. IF 3,609

8. Jáč P, Los P, Spáčil Z, Pospíšilová M, Polášek M. Electrophoresis 2008; 29: 3511–3518. IF 3,609

PROJEKTY OCENĚNÉ ZA MIMOŘÁDNÉ VÝSLEDKY ČESTNÝM UZNÁNÍM MINISTRYNĚ ZDRAVOTNICTVÍ UDĚLENÝM V ROCE 2009

Srovnání morfologických a funkčních cévních změn u nemocných s různými formami arteriální hypertenze

Hlavní řešitel: doc. MUDr. Robert Holaj

Univerzita Karlova v Praze, Všeobecná fakultní nemocnice

Projekt přinesl v průřezové studii důkazy o pokročilejších morfologických cévních změnách a změnách mechanických vlastností cévní stěny u nemocných s primárním hyperaldosteronismem (PA) a oproti původnímu plánu i u nemocných s feochromocytomem oproti nemocným s esenciální hypertenzí (EH). Jeho výsledky pomohly tak vysvětlit možné příčiny vyššího rizika vzniku kardiovaskulárního onemocnění u nemocných s těmito dvěma různými formami sekundární endokrinně podmíněné hypertenze.

Největší význam tohoto projektu však tkví v intervenční studii. Naše nálezy nasvědčují tomu, že úspěšná adrenalektomie (tedy úplné odstranění příčiny choroby) u nemocných s PA vede nejen k významnějšímu snížení krevního tlaku, ale také k ústupu již vyvinutých cévních změn. Inhibiční léčba spironolaktonem má efekt na snížení krevního tlaku a normalizaci patologických cévních změn prokazatelně nižší. Ke snížení vysokého kardiovaskulárního rizika těchto nemocných by proto měla být u nemocných s unilaterální formou PA jednoznačně doporučována chirurgická léčba před léčbou farmakologickou. Tento poznatek by měl vést lékaře k většímu úsilí o vyhledávání i identifikaci nemocných s PA, a přispět tak ke snížení vysokých nákladů na léčbu pozdních kardiovaskulárních komplikací tohoto onemocnění.

Výstupem projektu je 13 publikací, z toho 8 v časopise s IF (celkový IF 22,4):

1. Biochemical markers of endothelial dysfunction in patients with endocrine and essential hypertension. Physiol Res 2006; 55: 597–602. IF 2,093

2. Increased arterial wall stiffness in primary aldosteronism in comparison with essential hypertension. Am J Hypertens 2006; 19: 909–914. IF 3,116

3. Holaj R, Zelinka T, Wichterle D, Petrák O, Štrauch B, Widimský J, Jr. Increased intima–media thickness of the common carotid artery in primary aldosteronism in comparison with essential hypertension. J Hyperten 2007; 25(7): 1451–1457. IF 4,364

4. Rosa J, Štrauch B, Petrák O, Pikus T, Holaj R, Zelinka T, Wichterle D, Widimský J, Jr.   Physiol Res 2008; 57(2): 303–306. IF 1,505

5. Holaj R, Widimský J, Jr. Increased intima-media thickness in hypertensive patients with a high aldosterone/plasma renin activity ratio and elevated aldosterone plasma concentration (reply). J Hypertens 2008; 26(7): 1500–1501. IF 4,364

6. Štrauch B, Petrák O, Zelinka T, Wichterle D, Holaj R, Kasalický M, Šafařík L, Rosa J, Widimský J, Jr.   Am J Hypertens 2008; 21(10): 1086–1092. IF 3,102

7. Holaj R, Zelinka T, Wichterle D, Petrák O, Strauch B, Vránková A, Majtan B, Spáčil J, Malik J, Widimský J, Jr.   J Hum Hypertens 2009; 23(5): 350–358. IF 2,244

8. Zelinka T, Holaj R, Petrák O, Štrauch B, Kasalický M, Hanuš T, Melenovský V, Vančura V, Bürgelová M, Widimský J, Jr.   Med Sci Monit 2009; 15(12): CS174–177. IF 1,607

Transplantace tenkého střeva v experimentu

Hlavní řešitel: prof. MUDr. Miloš Adamec, CSc.

Klinika transplantační chirurgie IKEM, Praha

Spoluřešitelé: MUDr. Martin Oliverius, MUDr. Petr Baláž, MUDr. Michal Kudla, MUDr. Eva Honsová, MUDr. Alena Loederová

Transplantcentrum IKEM, Praha

Úvod. Před zahájením klinického programu transplantace tenkého střeva byl proveden rozsáhlý experiment transplantace tenkého střeva na praseti. Cílem projektu bylo dokonalé zvládnutí náročné chirurgické techniky odběru, konzervace a vlastní transplantace tenkého střeva. Další část experimentu byla zaměřena na diagnostiku rejekce štěpu tenkého střeva při podávání odlišných imunosupresivních režimů. Hlavním cílem byla snaha o nalezení vhodných histochemických a sérových parametrů rejekce a stanovení optimálního imunosupresivního režimu po transplantaci.

Metodika. K experimentu byla použita prasata domácí Sus scrofus domestici. Práce s laboratorními zvířaty probíhala na základě schváleného projektu pokusu s povolením Ministerstva zdravotnictví ČR číslo 1/ 2006 podle § 23 odst. 1 písm. a) zákona č. 246/1992 Sb. ve znění vyhlášky č. 207/2004 Sb., o ochraně, chovu a využití pokusných zvířat. Celkem jsme provedli 43 transplantací. První – chirurgická část experimentu byla zaměřena na zvládnutí dvou základních způsobů cévní anastomózy – napojením štěpu na mezenteriální řečiště (skupina n1 = 18) a napojení štěpu na aortu a dolní dutou žílu (skupina n2 = 25). Druhá část experimentu byla zaměřena na hodnocení rejekčních změn při odlišných způsobech imunosuprese. K hodnocení byla použita pouze zvířata, která nezemřela z důvodu technického selhání nebo interních příčin (n = 24). Zvířata byla rozdělena do čtyř skupin (A (n = 3) – autotransplantace, bez imunosuprese; B (n = 7) a C (n = 8) – allotransplantace s imunosupresí tacrolimem, resp. v kombinaci se sirolimem; D (n = 6) – allotransplantace bez imunosuprese. Na základě našich předchozích experimentů jsme se zaměřili na posouzení rozsahu ischemicko-reperfuzního poškození hodnocením serotoninpozitivních buněk v biopsiích. Diagnostika rejekce byla prováděna histologickým vyšetřením z protokolární biopsie štěpu. Jako neinvazivní humorální ukazatel poškození štěpu jsme vyšetřovali hladinu plasmatického citrulinu. Ve snaze nalézt další neinvazivní markery humorální rejekce jsme dále vyšetřovali hladiny cytokinů (IFN-γ, TNF-α, IL-4, IL‑8, IL-10).

Výsledky. Při hodnocení techniky transplantace došlo v první skupině k technickým komplikacím u 12 (67 %) zvířat, ve druhé pouze u 3 (12 %). Při hodnocení rejekčních změn bylo nejdelší přežívání dosaženo u autotransplantací, nejmenší u allotransplantací bez imunosuprese. V obou léčených skupinách jsme významný rozdíl v délce přežívání nezaznamenali (p < 0,05). Ve skupině C byl nižší počet celulárních rejekcí oproti skupinám B a D. Oproti našim dosavadním experimentům jsme neprokázali význam vyšetření serotoninpozitivních buněk pro diagnostiku ischemicko-reperfuzního poškození. Vzhledem k složitosti a komplexnosti posttransplantační reakce jsme neprokázali korelaci mezi koncentrací cytokinů v plazmě a průběhem posttransplantační reakce u žádné vyšetřované skupiny zvířat. Hladina plazmatického citrulinu se ukázala jako přínosný marker pouze pro diagnostiku středně těžké a závažné akutní celulární rejekce (graf 1).

Závěry. Experiment umožnil zvládnutí techniky odběru a následné transplantace s menším množstvím chirurgických komplikací v případě drenáže do centrálního řečiště. V rámci imunosupresivních režimů jsme nezaznamenali významnější rozdíl při použití monoterapie tacrolimem oproti kombinaci se sirolimem. Histologické hodnocení je zlatým standardem diagnostiky celulární rejekce. Stanovení hladiny plazmatického citrulinu nemá pro bezprostřední hodnocení rejekce význam s výjimkou středně těžké a těžké formy.

Prognostické faktory premyelopatické spondylogenní komprese krční míchy: pětiletá prospektivní observační kohortová studie

Hlavní řešitel: prof. MUDr. Josef Bednařík

Masarykova univerzita v Brně, Lékařská fakulta

Teoretickým východiskem bylo zjištění existence asymptomatické (presymptomatické) spondylogenní komprese krční míchy (P-SCCC) detekované pomocí magnetické rezonance (MR) a absence poznatků o klinickém průběhu a prognóze této jednotky.

Cílem projektu bylo stanovit faktory predikujicí nepříznivý průběh (přechod do symptomatického stadia) nemocných s presymptomatickou mírnou míšní kompresí na podkladě spondylózy a poskytnout podklady k rozhodování o léčbě spondylogenní cervikální míšní komprese u nemocných v preklinickém stadiu nemoci.

Metodika. Do studie bylo zařazeno a prospektivně sledováno 110 nemocných s P-SCCC, definovanou radiologicky jako spondylogenní či diskogenní komprese krční míchy detekovaná pomocí zobrazení MR s nebo bez průkazu současné změny intenzity míšního signálu v T1/T2 vážených obrazech, a klinicky příznaky radikulopatie a/nebo bolestmi v oblasti zad v krční/hrudní oblasti, vždy bez klinických známek myelopatie. Dále byl sledován soubor 115 nemocných s P‑SCCC, diagnostikovaný a sledovaný před zahájením projektu. Celkem byly analyzovány potenciální prediktory rozvoje klinicky manifestní myelopatie (primární end-point) u souboru 225 nemocných (104 žen, 121 mužů, průměrný věk 51, rozmezí 28–82 let) sledovaného po dobu minimálně 2 let (medián 49, rozptyl 24–156 měsíců).

Výsledky. Klinické příznaky manifestní myelopatie v důsledku spondylogenní komprese, doprovázené poklesem mJOA skóre minimálně o 1 bod jsme ve sledovaném období zaznamenali u 52 nemocných (23,1 %), z toho u 18 pacientů (34,6 % klinicky manifestních pacientů) do 1 roku. 25. percentil času do vzniku manifestní SCM byl 48,4 měsíců (tj. u 25 % všech jedinců zařazených do studia a splňujících kritéria P-SCCC se za tuto dobu rozvinula klinicky manifestní SCM). Operační řešení vzhledem k tíži myelopatie, eventuálně její další progresi bylo indikováno ve sledovaném období pouze u čtyř nemocných, z toho u dvou z indikace radikulopatie s úpornými radikulárními bolestmi a pouze u dvou pro výrazné a progredující myelopatické symptomy. Model multivariační logistické regrese identifikoval prediktory časného rozvoje klinicky manifestní myelopatie (do 12 měsíců): radikulopatie, abnormita somatosenzorických (SEP) a motorických evokovaných potenciálů (MEP) a absence míšní hyperintenzity na MR. Tento prediktivní model byl schopen správně predikovat rozvoj myelopatie u 81,7 % případů a pouze 41 z 225 případů bylo podle tohoto modelu chybně klasifikováno. Progrese do stadia klinicky manifestní myelopatie do 12 měsíců od počátku sledování bylo možno správně predikovat u 13 z 18 nemocných, u kterých k tomuto rozvoji skutečně došlo.

Závěry.

1. Riziko progrese klinicky asymptomatické (presymptomatické) spondylogenní komprese krční míchy do stadia klinicky manifestní myelopatie je relativně nízké a nejvyšší 1. rok od zjištění komprese.
2. Mezi významné nezávislé prediktory progrese P-SCCC do klinicky manifestního stadia patří klinicky manifestní krční radikulopatie, elektrofyziologické abnormity svědčící pro míšní dysfunkci detekované pomocí SEP a MEP a přítomnost míšní hyperintenzity v MR obrazu. Prediktivní model kalkulovaný pomocí těchto prediktorů je schopen označit pacienty s vysokým rizikem rozvoje klinicky manifestní myelopatie obecně i časného rozvoje do 12 měsíců s přesností přibližně 80 %.

Závěry pro klinickou praxi.

1. Pacienty s presymptomatickou spondylogenní kompresí krční míchy s vyšším rizikem rozvoje klinicky manifestní myelopatie (krční radikulopatie, abnormalita SEP, MEP, míšní MR hyperintenzita) je vhodné informovat o riziku rozvoje myelopatie a jejich možných symptomech a sledovat je v kratších, 3–6 měsíčních intervalech po dobu minimálně 5 let.
2. Preventivní operační dekomprese není vzhledem k benignímu průběhu presymptomatické spondylogenní komprese obecně indikována. Benefit případné operace u pacientů s vysokým rizikem bude nutné prokázat kontrolovanou randomizovanou studií.
3. Elektrofyziologické vyšetření pomocí SEP a MEP je vhodné provést u nemocných s krční radikulopatií a u nemocných se známkami presymptomatické spondylogenní komprese krční míchy v MR obraze.
4. MR C míchy je vhodné provést u nemocných s klinicky manifestní krční radikulopatií, zejména v případě současně detekované elektrofyziologické abnormality pomocí SEP a MEP svědčící pro míšní dysfunkci.

Myasthenia gravis: potenciální přínos svalové biopsie v rámci thymektomie

Řešitel: doc. MUDr. Josef Zámečník, Ph.D.

Univerzita Karlova v Praze, 2. lékařská fakulta, FN Motol

Cílem projektu bylo zmapování morfologických změn ve svalové tkáni při autoimunitním onemocnění nervosvalové ploténky – myasthenia gravis (MG) – na světově raritní sestavě bioptovaných případů, nastínit patogenezi těchto změn a stanovit jejich prognostický a diferenciálně diagnostický význam. Ačkoli je svalová biopsie prováděná dosud během thymektomie výkonem, který pro pacienta nepředstavuje významnější zátěž, chtěli jsme se kriticky zamyslet i nad tím, zda biopsií získané informace skutečně přinášejí prospěch pro další léčbu konkrétního pacienta.

Naše analýza svalové tkáně pacientů s MG přispěla k pochopení geneze některých již dříve popisovaných změn (lymfocytární infiltráty, selektivní atrofie vláken II. typu) a dala vzniknout novým nástrojům pro bioptické diferenciálně diagnostické odlišení MG od některých jiných primárních myopatií, které mohou MG klinicky věrně napodobovat. Ukázali jsme, že většina popisovaných změn není přímým důsledkem myastenie, nýbrž odrazem jiné poruchy – paraneoplastická kolonizace endomyzia svalu lymfocyty vyplavovanými patologicky změněným tymem, resp. subklinický rozvoj steroidní myopatie s atrofizací vláken II. typu. Přes jednoznačně pozitivní přínos k pochopení geneze popisovaných změn ve svalové biopsii jsme však ukázali, že informace získané svalovou biopsií při thymektomii mají pro další léčbu a prognózu konkrétního pacienta jen okrajový význam. Zařazení svalové biopsie do rutinního protokolu provádění tymektomie u pacientů s MG je tedy spíše sporné.

Naše výsledky daly vzniku dvěma prioritním primárním publikacím v zahraničních vědeckých časopisech Journal of Cellular and Molecular Medicine (IF 5.114) a Neuromuscular Disorders (IF 2.615) a dvěma primárním publikacím v domácích recenzovaných časopisech. Prezentované výsledky získaly během řešení grantového projektu NR8924-3 dvě ocenění: Bednářovu cenu za nejlepší práci publikovanou v roce 2006 v časopisu Čes.-slov. patologie a cenu Pio Sodalizio dei Piceni Prize za nejlepší přednášku 22nd International Meeting, 2007 – Adriatic Society of Pathology v italském Grottamarre.

Variabilita genů ovlivňující biologickou dostupnost imunosupresiv a její vztah ke krátkodobým i dlouhodobým výsledkům transplantace ledviny

Hlavní řešitel: prof. MUDr. Ondřej Viklický, CSc.

Institut klinické a experimentální medicíny, Praha

Kalcineurinové inhibitory (cyklosporin A, takrolimus) a inhibitory proliferačního signálu (sirolimus a everolimus) jsou léčiva s úzkým terapeutickým oknem a s vysokou interindividuální variabilitou farmakokinetických parametrů. Léčba těmito preparáty je tedy spojena se značnou potenciální toxicitou a na druhé straně, při nedosažení cílové hladiny léčiva v časném potransplantačním období, také s rizikem vzniku akutní rejekce. V dlouhodobém horizontu je terapie zkoumanými léčivy spojena s rizikem vzniku klinicky významných vedlejších účinků. Určení variant genů ovlivňujících biologickou dostupnost těchto imunosupresiv by mohlo u nemocných po orgánových transplantacích pomoci při optimalizaci jejich dávkování v časném potransplantačním období, nebo při změně léčby. Cílem projektu bylo ověřit vztah variant genů (jednonukleotidových polymorfismů), respektive haplotypů příslušných genových oblastí k výsledkům transplantací ledvin. Jako kandidátní geny byly vybrány ty, které kódují proteiny podílející se na absorpci a biotransformaci imunosupresiv, tedy cytochrom P450 – izoenzymy 3A4 a 3A5 a P-glykoprotein.

V našich experimentech jsme jednoznačně prokázali, že genové varianty cytochromu P450 (CYP3A4 a CYP3A5) mají vztah k dosažení cílových terapeutických hladin cyklosporinu A, takrolimu, respektive sirolimu a everolimu. Podstatným zjištěním bylo nalezení určitého rizikového uspořádání genu kódujícího P‑glykoprotein (MDR1/ABCB1 gen), tedy haplotypu, který ovlivňuje vznik akutní rejekce. Na základě námi navržených statistických modelů lze říci, že příslušný MDR1/ABCB1 haplotyp významně modifikuje riziko vzniku akutní rejekce transplantované ledviny. Tyto závěry není možné získat asociační analýzou jednotlivých jednonukleotidových polymorfismů kandidátních genů. Riziko akutní rejekce je nezávislé na farmakokinetických parametrech a je tak možné soudit, že aktivita P-glykoproteinu v cytoplazmatické membráně imunokompetentních buněk má větší význam než biologická dostupnost léčiva daná jeho plazmatickými koncentracemi. Dále jsme zjistili, že samotné jednonukleotidové polymorfismy genů kódujících cytochrom P450 nemají vztah k vedlejším účinkům léčby inhibitory proliferačního signálu, proteinurii a hyperlipidémii. Byl zde však pozorován významný vliv na variabilitu biologické dostupnosti těchto léčiv. I v tomto případě haplotypové uspořádání CYP3A/CYP3A4 genů ovlivňuje výskyt hlavních vedlejších účinků léčby – proteinurii a hyperlipidémii.

Naše studie v porovnání s dostupnou odbornou literaturou svědčí pro význam vyšetření kandidátních genů systémů metabolizace a transportu imunosupresiv pomocí analýzy celých úseků genů – haplotypů. Pro vyvození správných závěrů, pokud jde míru signifikance i sílu predikce, je nezbytné provádět podobná zkoumání v podmínkách studií s dostatečnou statistickou silou, tedy především s dostatečným rozsahem pozorování.

Publikace

Bandur S, Petrasek J, Hribova P, Novotna E, Brabcova I, Viklicky O. Haplotypic structure of ABCB1/MDR1 gene modifies the risk of the acute allograft rejection in renal transplant recipients. Transplantation 2008; 86(9): 1206–1213.