Sérologické nálezy chlamydiových protilátek v České republice – kontrolní soubor pacientů vyšetřených v rámci studie: Chlamydia pneumoniae v etiologii keratokonjunktivitis sicca

Súhrn

Východisko:
Jedním z cílů projektu IGA NS-10016 „Chlamydia pneumoniae v etiologii keratokonjunktivitis sicca“ bylo zhodnocení sérologických nálezů týkajících se chlamydiových infekcí u pacientů s keratokonjunktivitis sicca a porovnání těchto nálezů se sérologicky vyšetřeným kontrolním souborem. Sérologické vyšetření zahrnovalo detekci anti-LPS protilátek (rodově specifických), dále druhově specifických anti-Chlamydia pneumoniae, anti-Chlamydia trachomatis a protilátky proti chlamydiovému heat-shock proteinu – cHSP60 IgG.

Metody a výsledky:
Do kontrolního souboru byli zařazováni pacienti Oční kliniky FNKV podstupující předoperační vyšetření. U těchto osob nebylo v době odběru prokázáno laboratorně či klinicky akutní oční nebo celkové onemocnění. V anamnéze neudávali léčbu antibiotiky v posledních 6 měsících, léčbu chronického zánětu dýchacího traktu a astmatu či terapii kloubního nebo kardiovaskulárního onemocnění. Do kontrolní skupiny bylo celkem zařazeno 103 osob. V naší studii jsme anamnestické protilátky proti CP detekovali u 69 % osob kontrolní skupiny, u 31 % z nich i IgA a/nebo IgM, u 45 % i pozitivitu anti-cHSP60 IgG – a to u osob bez projevů akutní infekce či zánětlivých laboratorních parametrů.

Závěry:
Je zřejmé, že tato skutečnost může být při sérologickém vyšetření a jeho interpretaci velmi zavádějící, vždy je nutné hodnotit výsledky zejména v klinickém kontextu.

Klíčová slova:
Chlamydia pneumoniae, protilátky, sérologické vyšetření, chlamydiový heat-shock protein, konjunktivitida, keratokonjunktivitis sicca.

Úvod

Chlamydie patří k nejrozšířenějším mikroorganismům v lidské, ale i zvířecí říši. Tyto patogeny se zařazují mezi gram-negativní obligátní intracelulární bakterie. Jsou označovány jako energetičtí parazité eukaryotických (jaderných) buněk, k metabolickým procesům využívají ATP hostitelské buňky, protože vlastním systémem pro tvorbu ATP nejsou vybaveny. Jejich výskyt je kosmopolitní (1).

Dnes používaná taxonomie rozeznává jednu čeleď Chlamydiaceae, jeden rod Chlamydia a čtyři druhy: Ch. trachomatis, Ch. pneumoniae, Ch. psittaci, Ch. pecorum. V roce 1999 autoři Everett, Bush a Andersen publikovali nový návrh na taxonomické třídění založené na fylogenetických analýzách 16S a 23S rRNA genů (2). Dle tohoto návrhu bychom měli rozeznávat dva rody Chlamydia a Chlamydophila a devět druhů. I když se záhy tato nová taxonomie objevila v publikacích a je hojně používána, návrh na změnu taxonomie nebyl všeobecně akceptován a v odborných kruzích probíhá doposud debata ohledně potřebnosti a správnosti návrhu (3).

Ze všech dnes rozeznávaných druhů chlamydií se u člověka nejčastěji vyskytuje Chlamydia pneumoniae (CP) a Chlamydia trachomatis (CT) (4, 5). Mezilidský způsob přenosu těchto dvou druhů je velmi odlišný, liší se i přístup k diagnostice, terapii a odlišný je i klinický obraz.

Ch. pneumoniae je respirační agens a klinické projevy infekcí jsou vázány především na horní a dolní dýchací cesty, přesto jeden z prvních izolátů tohoto agens pochází ze stěru z oční spojivky. Tento kmen byl izolován na Tchaj-wanu v roce 1965 z oční spojivky dítěte v rámci vakcinační studie trachomu (6). Definitivní identifikace Chlamydia pneumoniae jako samostatného druhu se datuje až na konec devadesátých let 20. století (7) a od té doby se znalosti o tomto chlamydiovém druhu neustále rozšiřují. Vztahu Ch. pneumoniae k infekcím dolního dýchacího traktu (bronchitidy, pneumonie) je věnováno mnoho studií (8), ale jejich výsledky jsou mnohdy značně rozdílné. Úloha tohoto agens u onemocnění horních cest dýchacích není prozatím přesně definována, asymptomatické nosičství bez sérologického průkazu infekce je možné (9, 10). Nejasný je doposud i podíl Ch. pneumoniae na vzniku, příp. progresi některých chorob mimo respirační trakt, jako jsou např. kardiovaskulární choroby, onemocnění CNS (11, 12).

Ch. trachomatis (sérotypy D-K) infikuje u dospělých nejčastěji urogenitální trakt, u novorozenců oční spojivku a dýchací trakt (při průchodu infikovanými porodními cestami se mohou nakazit až dvě třetiny novorozenců). Většina urogenitálních infekcí proběhne asymptomaticky nebo s minimálními klinickými příznaky, pokud příznaky jsou, mohou připomínat až kapavku. Primárně bývá postižen epitel uretry, děložního čípku, příp. rekta, při orálním styku může dojít i k infekci faryngu. Infikována může být také oční spojivka (u dospělých obvykle autoinfekce z urogenitálního traktu) (1, 13, 14).

Výsledky výzkumného projektu IGA Ministerstva zdravotnictví České republiky NI-66811 z let 1999–2001 „Význam Chlamydia pneumoniae v patogenezi chronických lidských onemocnění“ ukázaly na možnou souvislost mezi chronickou folikulární konjunktivitidou chlamydiové etiologie a vznikem keratokonjunktivitis sicca (KCS). Další projekt IGA NS-10016 „Chlamydia pneumoniae v etiologii keratokonjunktivitis sicca“ zahájený v roce 2008 se již zaměřil přímo na tuto problematiku v souvislostech možné promořenosti dospělé populace touto infekcí.

Vyšetřovaný soubor a použité metody 

Jedním z cílů tohoto projektu bylo zhodnocení sérologických nálezů týkajících se chlamydiových infekcí u pacientů s chronickou folikulární konjunktivitidou provázenou příznaky KCS a porovnání těchto nálezů se sérologicky vyšetřeným kontrolním souborem pacientů. Cílem bylo také zhodnotit u pacientů s KCS přínos různých diagnostických metod (sérologie, detekce chlamydiových antigenů a detekce chlamydiové DNA) pro případný průkaz této infekce.

Sérologické vyšetření zahrnovalo detekci anti-LPS protilátek (rodově specifických) IgG, IgA, IgM (medac, Germany), dále druhově specifických anti-Chlamydia pneumoniae IgG, IgA, IgM (Savyon Diagnostics, Israel ), anti-Chlamydia trachomatis IgG, IgA (medac, Germany) a protilátky proti chlamydiovému heat-shock proteinu – cHSP60 IgG (medac, Germany).

Do kontrolního souboru byli zařazováni pacienti Oční kliniky FNKV podstupující předoperační vyšetření z důvodu nitroočních operací v období od května 2009 do května 2010. U těchto osob nebylo v době odběru prokázáno laboratorně či klinicky akutní oční nebo celkové onemocnění. V anamnéze neudávali léčbu antibiotiky v posledních 6 měsících, léčbu chronického zánětu dýchacího traktu a astmatu či terapii kloubního nebo kardiovaskulárního onemocnění. Do kontrolní skupiny bylo celkem zařazeno 103 osob (49 mužů a 54 žen ve věku od 21 do 90 let, medián 52 let).

V tomto období bylo také vyšetřeno 37 nemocných s folikulární konjunktivitidou a doprovázejícími příznaky KCS.

VÝSLEDKY

Kontrolní soubor 

Při hodnocení sérologických nálezů byla kontrolní skupina 103 osob rozdělena na tři části podle pozitivity anti-cHSP60 IgG – tyto protilátky byly vybrány jako hlavní marker pro srovnání případné aktivity procesu ve vzájemném vztahu k druhovým (anti-Ch. pneumoniae) a rodovým (anti-chlamydia) protilátkám. Mikrobiální heat-shock proteiny (HSP) jsou silné imunogeny a v průběhu jakékoliv bakteriální infekce jejich syntéza silně narůstá, infekční agens se tak snaží bránit se před imunitními mechanismy hostitele. Současně se exprimují i lidské HSP, aby ochránily humánní buňky. Vzhledem k vysoké homologii mezi proteiny může docházet ke zkříženým reakcím, což v konečném důsledku může vyústit v autoimunitní reakce.

Tři séra vykazovala pozitivitu anti-cHSP60 IgG při negativitě chlamydiových rodových i druhových protilátek ve všech imunoglobulinových třídách. Nelze tedy vyloučit, že pozitivita anti-cHSP60 IgG je v těchto případech odrazem buněčného stresu, který má jinou příčinu než chlamydiovou infekci. Tato tři séra proto nebyla do vlastního zhodnocení zařazena. Sérologické nálezy kontrolního souboru uvádí tabulka 1.

Negativní anti-cHSP60 IgG byly u 55 sér (55 %)

V této skupině mělo 20 sér negativní nález protilátek proti Ch. pneumoniae – 18 sér nevykazovalo žádnou pozitivitu druhových protilátek, (anti-Ch. pneumoniae, anti-Ch. trachomatis), ale u 13 z nich byla pozitivita v rodových protilátkách (anti-chlamydia IgA a/nebo IgM) a dvě séra vykazovala pozitivitu druhových protilátek pouze proti Ch. trachomatis (IgG).

Dalších 25 sér vykazovalo pouze anamnestické hladiny protilátek (tj. IgG) proti CP, u šesti z nich byla ještě současná pozitivita rodových anti-chlamydia protilátek (anti-chlamydia IgA a/nebo IgM), u tří sér byla pozitivita protilátek i proti Ch. trachomatis.

Zbývajících deset sér vykazovalo pozitivitu protilátek proti Ch. pneumoniae jak v IgG, tak ve třídách IgA a/nebo IgM (v šesti případech i se současnou pozitivitou anti-chlamydia IgA a/nebo IgM). V hodnocení byla tato pozitivita u této skupiny osob bez klinických známek akutní infekce považována spíše za nálezy charakteru anamnestického významu proběhlé recentní infekce ( i vzhledem k současně negativnímu nálezu anti-cHSP60 IgG ). 

Pozitivitu proti cHSP60 IgG vykazovalo 45 sér (45 %)

• a) Hraniční až slabě pozitivní nález (index pozitivity do 1,8) anti-cHSP60 IgG byl u 22 sér. V této skupině byla tři séra, která nevykazovala žádnou pozitivitu druhových protilátek (anti-Ch. pneumoniae), u dvou z nich byla zachycena pouze pozitivita rodových protilátek (anti-chlamydia IgG) a jedno sérum vykazovalo pozitivitu druhových protilátek jen proti Ch. trachomatis (IgG).

Dalších jedenáct sér vykazovalo pouze anamnestické hladiny protilátek (tj. IgG) proti CP, u tří z nich byla ještě současná pozitivita rodových anti-chlamydia IgM a u jednoho séra pozitivita protilátek i proti Ch. trachomatis.

Celkem osm sér vykazovalo pozitivitu IgA nebo IgM v rodových (anti-chlamydia) nebo druhových (anti-Ch. pneumoniae, příp. i anti-Ch. trachomatis) protilátkách. Tyto nálezy jsme hodnotili jako suspektní aktivní infekci bez klinického významu, neboť u pacientů se neprojevovala žádná symptomatologie zánětlivého procesu spojeného se sledovaným agens. Tento fakt podporoval současně nízký index pozitivity cHSP60. U dvou pacientů v této skupině byla současná pozitivita IgG a IgM či IgA druhových anti-Ch. pneumoniae i rodových anti-chlamydia protilátek. Tento nález jsme hodnotili jako susp. aktivní infekci, a proto jsme u těchto osob provedli po 6 měsících kontrolní sérologické vyšetření.

• b) Středně až silně pozitivní (index pozitivity nad 1,8) anti-cHSP60 IgG byly detekovány u 23 sér. V této skupině mělo osm sér negativní nález protilátek proti Ch. pneumoniae – tři séra nevykazovala žádnou pozitivitu druhových protilátek (anti-Ch. pneumoniae, anti-Ch. trachomatis), zachycena byla pouze pozitivita rodových protilátek (anti-chlamydia IgG a/nebo IgA, IgM), u pěti sér byla pozitivita druhových protilátek pouze proti Ch. trachomatis (IgG příp. i IgA)).

Dvě séra vykazovala pouze anamnestické hladiny protilátek (tj. IgG) proti CP (jedno sérum i proti CT) a anti-chlamydia IgG.

Celkem 13 sér vykazovalo pozitivitu IgA a/nebo IgM v druhových (anti-Ch. pneumoniae) a/nebo rodových (anti-chlamydia), u devíti z nich i anti-Ch. trachomatis) protilátkách. Nález jsme hodnotili jako suspektní aktivní infekci i vzhledem k silné či střední pozitivitě anti-cHSP60 IgG. Přesto krevní obraz i sedimentace jako součást klasického předoperační vyšetření byly v mezích fyziologických hodnot.

Těchto 13 osob a dvě osoby z předchozí skupiny s nejvýraznějším sérologickým nálezem jsme pozvali na kontrolní vyšetření po 6 měsících, dva pacienti se nedostavili, ale u ostatních byly hladiny protilátek i po půl roce v podstatě beze změn.

Pacienti s KCS

Celkem bylo doposud vyšetřeno 37 dospělých pacientů s folikulární konjunktivitidou a příznaky KCS, u jedenácti z nich (šest žen a pět mužů ve věku 28–81 let, medián 50 let) laboratorní nález (sérologie, detekce antigenu a DNA) podpořil nasazení ATB terapie. U deseti pacientů byla zaznamenána pozitivita anti-Ch. pneumoniae IgA a/nebo IgM, současně byla prokázána pozitivita anti-cHSP60 IgG, u osmi nemocných i pozitivita anti-chlamydia IgA a/nebo IgM. Pozitivní stěry byly zaznamenány u šesti pacientů. U dvou léčených pacientů byl sérologický nález nevýrazný, ale na infekci Ch. pneumoniae poukazovala pozitivita DNA Ch. pneumoniae v periferních leukocytech, obtíže těchto dvou pacientů byly půlroční (tj. vzhledem k ostatním pacientům relativně krátké). Podrobný rozbor klinických a laboratorních nálezů u těchto pacientů je předmětem jiného sdělení (15).

DISKUZE A ZÁVĚR 

Hodnocení sérologických nálezů u chlamydiových infekcí ve vztahu ke klinickým onemocněním vyžaduje určitou opatrnost. Sérologické nálezy u osob kontrolní skupiny, tj. osob, u kterých v době odběru nebylo prokázáno laboratorně i klinicky akutní onemocnění (a anamnesticky neudávaly léčbu chronického zánětlivého onemocnění), ukazují na obtížnost této problematiky. Dvě třetiny osob (69 %) v našem souboru měly anamnestické (tj. IgG) protilátky proti Ch. pneumoniae. Tento nález koresponduje s výsledky sérologických přehledů publikovaných v roce 1998 (3). Ale 31 % (téměř polovina) vykazovalo i sérologické známky aktivity infekce Ch. pneumoniae (tj. pozitivitu IgA a/nebo IgM v druhových a/nebo rodových protilátkách).

Při rozdělení nálezů podle pozitivity IgG proti cHSP60 bylo pouze 55 % osob negativních, 22 % mělo hraniční až slabou pozitivitu (index pozitivity do 1,8) a 25 % střední až silnou pozitivitu (index pozitivity nad 1,8). Je celkem logické, že ve skupině se silnou pozitivitou anti-cHSP60 IgG bylo i nejvíce nálezů protilátek proti Ch. trachomatis (u 15 sér). Ze 45 sér s pozitivitou protilátek proti chlamydiovému heat-shock proteinu opět téměř polovina (21 sér) vykazovala sérologické známky aktivity infekce Ch. pneumoniae (tj. pozitivitu IgA a/nebo IgM v druhových a/nebo rodových protilátkách).

Domníváme se, že skutečnost, že u třetiny relativně zdravé dospělé populace detekujeme pozitivitu IgA či IgM (druhových či rodových) a u téměř poloviny pozitivitu protilátek proti chlamydiovému HSP, značně ztěžuje interpretaci sérologických nálezů. Diagnostika infekcí Ch. pneumoniae je v současné době založena především na průkazu protilátek. U chlamydiových infekcí je tvorba protilátek opožděná a nastupuje zhruba až 10. den od začátku onemocnění (druhové protilátky dokonce ještě později – až za cca 2–3 týdny, možná ještě déle). K tvorbě IgM protilátek dochází zpravidla u primoinfekcí, při reinfekci či reaktivaci dochází obvykle ke vzestupu už jen IgG a IgA protilátek. Nález samotných IgG bývá známkou prodělaného onemocnění nebo kontaktu s infekcí. Pro optimální interpretaci sérologického nálezu je ovšem nutné sledování dynamiky tvorby protilátek. Jednoznačným průkazem akutní infekce je zachycení sérokonverze nebo čtyřnásobného vzestupu protilátek v párových sérech (1. sérum na začátku onemocnění, 2. sérum za 2–3 týdny) (16). V současné době činí asi největší obtíže diagnostika „chronických“ infekcí Ch. pneumoniae. I když se v literatuře i v praxi mnohdy považuje dlouhodobá pozitivita IgA a IgM za průkaz chronické infekce, tak doposud nemáme k dispozici žádný ověřený sérologický marker pro průkaz chronické či perzistentní chlamydiové infekce (17). Při hodnocení sérologických nálezů je třeba vzít v úvahu i možnou polyklonální aktivaci protilátek (např. při infekci EBV nebo Mycoplasma pneumoniae).

Heat-shock proteiny (HSP – proteiny tepelného šoku) jsou vysoce konzervované buněčné stresové proteiny, které se v buňkách exprimují při buněčném stresu – tímto stresem může být např. zvýšená teplota, ale i zánět, infekce, toxiny, ionizující záření, nedostatek živin. Tyto proteiny se vyskytují ve všech buňkách, prokaryotických i eukaryotických, a mají pozoruhodně vysokou homologii. Homologie HSP mezi člověkem a myší je 99,9 %, mezi člověkem a bakteriemi cca 60 % (18). Vzhledem k vysoké homologii mezi proteiny může docházet ke zkříženým reakcím, což v konečném důsledku může vyústit v autoimunitní reakce. Test cHSP60 IgG Elisa (medac) používá jako antigen rekombinantní protein tepelného šoku 60 (cHSP60) z CT. I když tento test zachytává převážně protilátky proti HSP60 CT, tak vzhledem k velmi vysoké homologii mezi druhy chlamydií na úrovni proteinů (95 %) je možný záchyt protilátek i proti CP (19). Nelze vyloučit, že pozitivita těchto protilátek je také odrazem buněčného stresu, který má jinou příčinu, než je chlamydiová infekce. Tato možnost je pravděpodobná u tří anti-cHSP60 IgG pozitivních sér, která jsme pro negativitu chlamydiových protilátek ze souboru vyloučili.

Detekce protilátek je nepřímá diagnostika a při interpretaci je třeba toto mít na paměti. Co se týká infekce Ch. pneumoniae je promořenost dospělé populace vysoká, a tudíž anamnestické protilátky proti tomuto agens detekujeme velmi často. V našem kontrolním souboru jsme u třetiny až poloviny osob detekovali i „markery pro aktivní infekci“ (pozitivitu IgA a/nebo IgM a pozitivitu anti-cHSP60 IgG). U 13 osob s nejvýraznějším nálezem bylo kontrolní sérologické vyšetření po 6 měsících v podstatě beze změn. Vzhledem k tomu, že se jednalo o osoby bez klinických obtíží, nebyl důvod k nasazení antibiotické terapie.

Sérologické nálezy je tedy nutné vždy posuzovat v klinickém kontextu a společně s dalšími laboratorními výsledky. Pro průkaz akutní infekce je nutné vyšetření párového odběru. Pokud je to možné, je vhodné doplnit sérologické vyšetření přímou diagnostikou (záchyt DNA). Samotná pozitivita IgA, IgM nebo pozitivita anti-cHSP60 IgG není důvodem k nasazení antibiotické terapie.

Zkratky

CP                    – Chlamydia pneumoniae

CT                   – Chlamydia trachomatis

HSP                  – proteiny tepelného šoku (heat-shock proteiny)

IgA, IgG, IgM   – imunoglobuliny A, G a M

KCS                  – keratokonjunktivitis sicca 

Podpořeno grantem IGA NS-10064.

ADRESA PRO KORESPONDENCI:

MUDr. Dana Hrubá

Vidia-Diagnostika s.r.o.

Gen. Janouška 902, 198 00 Praha 9

e-mail: d.hruba@seznam.cz