Laureáti Nobelovy ceny

V roce 1968 získali Nobelovu cenu za fyziologii nebo medicínu tři američtí badatelé na poli genetiky – biochemici Robert William Holley, Har Gobind Khorana a Marshall Warren Nirenberg.

ROBERT WILLIAM HOLLEY

(1922–1993)

Narodil se 28. ledna 1922 ve městě Urbana v americkém státě Illinois jako jeden ze čtyř synů učitelky Violy Esther rozené Wolfeové a učitele Charlese Elmera Holleye. Z dětství prožitého na území států Illinois, Kalifornie a Idaho si odnesl lásku k přírodě a trvalý zájem o biologii. Středoškolské vzdělání dokončil v roce 1938 v Urbana High School ve svém rodišti, načež na Illinoiské univerzitě vystudoval chemii a po dosažení bakalaureátu v roce 1942 studoval na Cornellově univerzitě v Ithace ve státě New York organickou chemii u Alfreda T. Blomquista. Když však válka jeho studium v roce 1944 přerušila, vstoupil Robert jako civilista do služeb Úřadu Spojených států pro výzkum a rozvoj a v letech 1944–1946 se podílel na první chemické syntéze penicilinu jako člen výzkumné skupiny Vincenta du Vigneauda na Lékařské koleji Cornellovy univerzity. Tehdy se oženil s chemičkou a středoškolskou učitelkou matematiky Ann Lenore Dworkinovou a měl s ní pak syna Fredericka, třetího do party náruživých turistů.

Po návratu k Blomquistovi dokončil doktorské studium v roce 1947, načež díky stipendiu Americké chemické společnosti strávil rok výzkumem u Carla M. Stevense na Washingtonské státní koleji ve městě Pullman. V roce 1948 se vrátil na Cornellovu univerzitu, aby jako „assistant professor“ organické chemie v Zemědělské pokusné stanici státu New York, pobočce univerzity ve městě Geneva, zkoumal metabolické přeměny 2,4-dichlorofenoxyoctové kyseliny v bobovitých rostlinách a identifikoval auxiny v zelí. V těchto raných studiích si Holley, od roku 1950 „associate professor“ Cornellovy univerzity, osvojoval nové purifikační postupy, zvláště techniku Craigovy protiproudové distribuce (A Study of the Auxins in Cabbage Using Countercurrent Distribution. Arch Biochem Biophys 1951; 32: 192–199; spoluautoři Boyle, Durfee a A. D. Holley).                  

Dva roky poté, co Crick a Watson zveřejnili model dvojité šroubovice molekuly DNA, užil Holley v akademickém roce 1955/56 stipendia Guggenheimovy nadace ke studiu syntézy bílkovin a chemie nukleových kyselin u Jamese Fredericka Bonnera v Kalifornském technologickém institutu v Pasadeně. Tehdy bylo stále zřejmější, že poznání mechanismů syntézy bílkovin přijde s úplným popisem jejich úspěšné syntézy in vitro, dosahované zejména skupinou Paula C. Zamecnika v Massachusettské všeobecné nemocnici. Ukazovalo se, že před inkorporací do bílkovin jsou aminokyseliny enzymaticky aktivovány jako aminoacyladenyláty, a Zamecnik a Mahlon Hoagland objevili, že příštím krokem je připojení aminokyselin k ribonukleovým kyselinám, ne však těm v mikrozomech, hrajícím hlavní roli v syntéze bílkovin, ale k malým RNA, nově objeveným v jiné subcelulární frakci, užité při syntéze bílkovin in vitro. Neznámou však zůstávala přesná úloha těchto RNA, pro přítomnost v supernatantu ultracentrifugace zvaných rozpustnými RNA, v syntéze bílkovin. Postupem z opačného konce – studiem citlivosti vůči ribonukleáze – také Holley objevil, že rozpustné RNA jsou zapojeny do aktivace a inkorporace aminokyselin do bílkovin přinejmenším v případě alaninu (An Alanine-Dependent, Ribonuclease-Inhibited Conversion of AMP to ATP, and Its Possible Relationship to Protein Synthesis. J Am Chem Soc 1957; 79: 658–662). Postupně vysvítal vztah mezi rozpustnými RNA a hypotetickými „nukleovými kyselinami-adaptéry“, jež Francis Crick před třemi roky navrhl jako můstek od genetické informace v nukleových kyselinách k aminokyselinám skládajícím bílkoviny.

Z Pasadeny si Holley odnesl zaujetí stavbou transferové RNA (tRNA) a v Ithace se v roce 1958 rozhodl podrobit ji chemickému zkoumání. V laboratoři amerického ministerstva zemědělství při Cornellově univerzitě vyvinul techniky izolace tRNA z buněk. Pro purifikaci nepostradatelnou se ukázala technika protiproudové distribuce, kterou znal z Genevy (Fractionation of Yeast Amino Acid-Acceptor Ribonucleic Acids by Countercurrent Distribution. J Biol Chem 1961; 238: 1117–1120; s Doctorem a Apgarovou). Ze 140 kg pekařských kvasnic izoloval fenolovou extrakcí 200 g směsi různých tRNA a purifikací této směsi získal pouhý 1 g čisté alaninové tRNA. Souběžně purifikoval také valinovou, histidinovou a tyrozinovou tRNA (Purification of the Alanine-, Valine-, Histidine-, and Tyrosine-acceptor Ribonucleic Acids from Yeast. J Biol Chem 1962; 237: 796–802; s Apgarovou a Merrillovou).

Příprava čisté alaninové tRNA byla nezbytná pro druhou fázi práce – sekvenování tRNA. K určení sekvence molekuly o 77 nukleotidech užil Holley téže strategie (účinkem enzymů působících na odlišných místech rozštěpit molekulu na různé fragmenty a z těch pak sestavovat skládanku) jako nedlouho předtím Fred Sanger u inzulinu, proti jeho 20 aminokyselinám však měl se čtyřmi nukleotidy těžší hlavolam. Řetězec RNA rozštěpil nejprve při pyrimidinnukleotidech pankreatickou ribonukleázou, pak při zbytcích gvanylové kyseliny takadiastázaribonukleázou T1, k dalšímu štěpení musel přidat exonukleázu, fosfodiesterázu z hadího jedu i chlazení. Získaných 16 fragmentů separoval chromatograficky na DEAE-celulóze. Posléze rekonstruoval původní sekvenci nukleotidů určením pořadí fragmentů v molekule RNA. 19. března 1965, dva a půl roku od zahájení práce Holleyovy skupiny a mnoha studentů, vyšel článek (Structure of a Ribonucleic Acid. Science 1965; 147: 1462–1465; s Apgarovou, Everettem, Madisonem, Marquiseem, Merrillovou, Penswickem a Zamirovou) oznamující, že Holley se spolupracovníky určil vůbec první sekvenci nukleotidů ribonukleové kyseliny.

Technické stránce Holleyova výkonu patří trvalé uznání, náhled jeho významu se však měnil už v průběhu práce: tRNA byla zpočátku přirovnávána k rosettské stéle jako nástroj k rozluštění genetického kódu, ten však byl prolomen pomocí umělých polynukleotidů s přesně určenou skladbou a sekvencí bází známou od Nirenbergova objevu tripletového kódu bází pro fenylalanin v roce 1961. Jedním z významných výsledků bylo poznání první sekvence genu a Holleyův objev byl nahlížen jako první krok k poznání celého genomu, což se ukázalo iluzí: Metodika této studie neposkytuje přístup k regulačním sekvencím, kontrolujícím expresi genů. Navíc u velkých molekul jako messenger RNA lze Holleyovu strategii těžko uplatnit. Techniky sekvenování genů byly vynalezeny až uprostřed sedmdesátých let 20. století a jsou jiné povahy. Sekundární struktura tvaru lístku jetele navržená Elizabeth Kellerovou a Johnem Penswickem a rychle osvojená Holleyem byla později prokázána u všech tRNA, krystalografické difrakční studie skupiny Aarona Kluga však domnělou trojrozměrnou strukturu nepotvrdily.

V akademickém roce 1965/1966 byl Holley přednostou Ústavu biochemie Cornellovy univerzity, následující rok strávil jako stipendista Národní nadace pro vědu v Salkově ústavu pro biologická studia v San Diegu. V roce 1968, nedlouho poté, co dostal Laskerovu medaili za základní lékařský výzkum, byl „za svůj výklad genetického kódu a jeho funkce v syntéze bílkovin“ (konkrétně za izolaci a charakterizaci transferové RNA) vyznamenán třetinovým podílem na Nobelově ceně za fyziologii nebo medicínu. Dalšími podílníky pak byli biochemik z Bethesdy Marshall Warren Nirenberg, který rozluštil genetický kód pro fenylalanin, později pro lysin a prolin, a madisonský biochemik původem z Paňdžábu Har Gobind Khorana, který potvrdil Nirenbergův objev a zasloužil se o konečné prolomení celého kódu pro syntézu bílkovin. Na slavnostním shromáždění ve Stockholmu 10. prosince 1968 představil laureáty králi a Královské švédské akademii věd profesor Karolinského lékařsko-chirurgického institutu Peter Reichard. Úvodem připomněl zrození genetiky jako vědy v nadlouho zapomenutém poznání brněnského augustiniána Gregora Mendela z pokusů s křížením hrachu, že děděné znaky jsou určovány „elementy“ dědičnosti (1866), připomněl také izolaci „nukleinu“ z buněčných jader Švýcarem Friedrichem Miescherem (1868), aniž kdo souvislost mezi oběma objevy tušil, dále zmínil zásluhu Švéda Einara Hammarstena o probuzení vědeckého zájmu na počátku čtyřicátých let 20. století a průkaz Američana Oswalda Averyho, že nikoli bílkovina, nýbrž nukleová kyselina obsahuje genetickou informaci (1944), z čehož povstala molekulární biologie, jejíž výzkum je v roce 1968 Nobelovou cenou vyznamenáván už popáté od roku 1958. Reichard vystihl význam Nirenbergovy syntézy jednoduché nukleové kyseliny pro rozluštění prvního znaku genetického kódu (1961) i Nirenbergův a zejména Khoranův přinos pro konečné rozluštění celého genetického kódu v následujících letech, zatímco Holley objevil nukleovou kyselinu převádějící genetický kód do abecedy bílkovin, připravil ji v čisté formě a konečně v roce 1965 určil její přesnou chemickou stavbu – u biologicky aktivní nukleové kyseliny vůbec poprvé. 12. prosince 1968 měl Holley nobelovskou přednášku (Alanine Transfer RNA. Nobel Lectures, Physiology or Medicine 1963–1970. Amsterdam: Elsevier Publishing Co. 1972; 319–340).

Aniž ztratil příslušnost ke Cornellově univerzitě, stal se profesorem molekulární biologie Americké společnosti pro rakovinu s trvalým úvazkem v Salkově ústavu a mimořádným profesorem Kalifornské univerzity v San Diegu. V oblasti syntézy bílkovin čekaly tehdy na odpověď ještě mnohé otázky jako přesná trojrozměrná stavba tRNA a ribozomů nebo jednotlivé kroky syntézy bílkovin. Holley se jim také v několika následujících letech věnoval: zkoumal nepřímými chemickými technikami strukturu jiných tRNA a studoval enzymy působící změny bází tRNA. Zanedlouho však toto pole opustil, aby celý zbytek vědecké dráhy věnoval molekulárním faktorům řízení růstu a množení savčích buněk. Stranou jeho zájmu přitom zůstávaly nitrobuněčné mechanismy kontroly buněčného dělení: Holleyův pokus o sjednocující hypotézu povahy zhoubného bujení vyšel z přesvědčení, že pro maligní zvrhnutí je rozhodující změna v buněčné membráně, vedoucí ke zvýšené koncentraci živin uvnitř buňky (A Unifying Hypothesis Concerning the Nature of Malignant Growth. Proc Natl Acad Sci USA 1972; 69: 2840–2841). Vývoj poznání v dalších letech s objevy onkogenů a antionkogenů však vedl výzkum do nitra buňky a Holleyovi setrvávajícímu u buněčné membrány za pravdu nedal.

Po experimentech na myších embryonálních fibroblastech 3T3 (Control of the Initiation of DNA Synthesis in 3T3 Cells: Serum Factors. Proc Natl Acad Sci USA 1974; 71: 2908–2911; s Kiernanovou) začal Holley s ohledem na epitelový původ mnoha lidských nádorů pracovat s linií BSC-1 výstelkových buněk ledviny kočkodana zeleného (Cercopithecus aethiops). Nikdy nepřijal hypotézu kontaktní inhibice buněčného dělení signály pocházejícími z fyzického kontaktu sousedících buněk: pro Holleye je kontaktní inhibice pouze důsledkem snížení přísunu živin z omezení difuze přilehlými buňkami. Podobně se zpočátku zdráhal přiznat hlavní úlohu v kontrole buněčného dělení růstovým faktorům, zdůrazňoval naopak úlohu nízkomolekulárních živin (Density-Dependent Regulation of Growth of BSC-1 Cells in Cell Culture: Control of Growth by Low Molecular Weight Nutrients. Proc Natl Acad Sci USA 1978; 75: 339–341; s Armourovou a Baldwinovou).

Z kultury buněk BSC-1 izoloval a purifikoval dvě vysokomolekulární látky reverzibilně zastavující růst těchto buněk ve fázi G1 buněčného cyklu a neutralizované epidermálním růstovým faktorem nebo telecím sérem. Takto objevil růstové inhibitory buněk BSC-1 (Purification of Kidney Epihelial Cell Growth Inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 1980; 77: 5989–5992; s Böhlenem, Favou, Baldwinovou, Kleemanem a Armourovou). Zjistil úzkou příbuznost s transformujícím růstovým faktorem beta krevních destiček (Growth Inhibitor from BSC-1 Cells Closely Related to Platelet Type Beta Transforming Growth Factor. Science 1984; 226: 705–707; s Tuckerem, Shipleyem a Mosesem) a schopnost růst buněk tlumit i povzbuzovat (A Growth Regulatory Factor That Can both Inhibit and Stimulate Growth. CIBA Foundation Symp 1985; 116: 241–252; s Baldwinovou, Greenfieldovou a Armourovou).

V roce 1988 identifikoval celou nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci pro inhibitor růstu buněk BSC-1 a zjistil totožnost 80 ze 112 aminokyselin se sekvencí pro lidský transformující růstový faktor (TGF) beta-1 a totožnost s celou sekvencí aminokyselin pro lidský TGF beta-2. Pro faktory s inhibičními i stimulačními vlastnostmi navrhl název „polyfunkční regulátory růstu“ (Amino Acid Se­quence of the BSC-1 Cell Growth Inhibitor /Polyergin/ Deduced from the Nucleotide Sequence of the cDNA. Proc Natl Acad Sci USA 1988; 85: 79–82; s Hanksem, Armourovou et al.).

Jako profesor-výzkumník Americké společnosti pro rakovinu pracoval Robert William Holley v oddělení molekulární biologie Salkova ústavu pro biologická studia až do roku 1990. Zemřel 11. února 1993 na rakovinu plic v městečku Los Gatos při jihozápadním okraji kalifornského San José. 

MUDr. Pavel Čech

Kabinet dějin lékařství 3. LF UK

Ruská 87, 100 00 Praha 10

e-mail: pavel.cech@lf3.cuni.cz