16. celostátní konference DNA diagnostiky (Brno, 28.–30. listopadu 2012)

SEKCE FORENZNÍ GENETIKY

Y-STR analýza – PowerPlex^® Y23 System: Jeden kit pro srovnávací a forenzní vzorky (okamžitá amplifikace)

Lachmanová S.¹, Thompson J. M.², Ewing M. M.², Fulmer P. M.², Rabbach D. R.², Sprecher C. J.², Storts D. R.²

¹EAST PORT Praha s.r.o.

²PROMEGA

e-mail: sonja.lachmanova@eastport.cz

Testování Y-STR je osvědčenou metodou pro forenzní genetiku, určování paternity a genealogické studie. PowerPlex^® Y23 System obsahuje 17 lokusů Y-STR, které jsou součástí nynějších Y-STR kitů (DYS19, DYS385a/b, DYS389I/II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS437, DYS438, DYS439, DYS448, DYS456, DYS458, DYS635, Y-GATA-H4), a dalších šest Y-STR lokusů (DYS481, DYS533, DYS549, DYS570, DYS576 a DYS643), které mají vysokou rozlišovací schopnost („genediversity factor“). Toto uspořádání zvyšuje schopnost odlišit danou osobu od různých rodičovských linií a určuje další návazné smysluplné analýzy. PowerPlex^® Y23 System je robustní multiplex, který toleruje přítomnost mnoha inhibitorů PCR, např. hematinu, taninu nebo huminových kyselin. Systém vykazuje výraznou citlivost v přítomnosti i minimálních množství mužské DNA v přítomnosti nadměrného množství ženské DNA. Byly získány kompletní profily u vzorku obsahujícího 62 pg mužské DNA v přítomnosti 400 ng ženské DNA (6450krát většího množství).

Tento kit umožňuje okamžitou amplifikaci z různých substrátů, např. z krve a bukálních stěrů na FTA^® kartách (GE Healthcare/Whatman), a z dalších běžně používaných papírových nosičů. Systém PowerPlex^® Y23 podává spolehlivě plné profily Y-STR ze stěrů, pokud je používán společně s kitem SwabSolution™ Kit od Promegy. Y-STR amplifikace se systémem PowerPlex^® Y23 probíhá pouze 90 minut, což představuje výrazné zkrácení oproti amplifikaci s dostupnými kity. Společně se svou tolerancí k inhibitorům PCR, vylepšenou citlivostí a protokoly pro stopy a srovnávací vzorky je PowerPlex^® Y23 System novým standardem pro Y-STR analýzy.

Rychlá forenzní DNA identifikace osob – nový trend v kriminalistické praxi

Minárik M.

Genomac výzkumný a znalecký ústav Praha

e-mail: mminarik@email.com

DNA jako identifikační prvek je v kriminalistice používána od druhé poloviny osmdesátých let 20. století, kdy Sir Alex Jeffreys působící na Univerzitě v Leicesteru objevil přítomnost specifických nekódujících sekvencí v lidském genomu (tzv. minisatelitů) a předvedl využití jejich analýzy pro identifikaci osob (1). Metodika vyšetřování lidských minisatelitů (častěji též VNTR – variable number of tandem repeats) byla označena jako „DNA fingerprinting“ a začala být komerčně dostupná od roku 1987. S příchodem technologie PCR ve stejném období (2, 3) a její následnému rychlému pronikání do rozličných částí aplikované genetiky, byly původní metody DNA fingerprintingu, založené na restrikčním štěpení (RFLP) následovaném Southernovým blotem, nahrazeny metodikou PCR amplifikace specifické podskupiny VNTR markerů – krátkých opakujících se sekvencí (STR – short tandem repeat). Po uvedení optimalizovaných STR detekčních kitů v singleplex formátu (Promega) a následně i v mutliplex formátu (Promega, Applied Biosystems) se tyto staly neodmyslitelnou součástí forenzní praxe, a to jak v oblasti analýzy referenčních vzorků a databázování, tak i v moblasti DNA typování rozličného typu biologických stop získaných při ohledání místa činu.

Klasický protokol současné forenzní DNA identifikace se sestává ze tří oddělený kroků: 1. izolace DNA z předmětného vzorku, 2. PCR amplifikace STR systémů obsahujícího minimální sadu doporučených STR markerů (tzv. core STRmarkery, CODIS markery) a 3. fragmentační analýzy amplifikovaných produktů s pomocí kapilární elektroforézy (CE). Jakkoliv je tato metodika všeobecně akceptována a řadu let využívána, její hlavní nevýhodou je relativně dlouhý čas nutný k provedení všech postupných kroků, stejně jako nároky na vybavení vyžadující provádění testu ve specializované forenzní DNA laboratoři.

Z tohoto důvodu jsou již řadu let vyvíjeny nové DNA analyzátory, kde je celková doba nutná pro provedení testu významně zkrácena s využitím mikrofluidních reaktorů na provádění DNA izolace a PCR reakce a mikročipové CE na superrrychlou DNA separaci. V nedávné době bylo představeno několik systémů označovaných jako „Rapid DNA“ a první z nich je již od léta 2012 komerčně dostupný (4). Ve všech případech se jedná o obdobný princip, kdy výše zmíněné jednotlivé kroky jsou plně integrovány a automatizovány ve formátu jediného kompaktního přístroje. Od vstupu vzorku (vložení tyčinky bukálního stěru) až po výsledný DNA profil, vše probíhá bez jakékoliv nutnosti zásahu obsluhy, tedy i bez nutnosti provádění ve specializované laboratoři. Celková doba tohoto tzv. „swab-in/profile-out“ procesu je v současnosti zhruba do 90 minut, což predstavuje 5–10násobné urychlení oproti standardnímu protokolu. Rapid DNA technologie představuje zásadní nový trend ve forenzní genetické analýze, a lze proto očekávat její brzké uplatnění v rutinní kriminalistické praxi.

Literatura

1. Jeffreys AJ, Wilson V, Thein SW. Hypervariable ‚minisatellite‘ regions in human DNA. Nature 1984; 314: 67–73.
2. Saiki R, Scharf S, Faloona F, Mullis K, Horn G, Erlich H. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sidole cell anemia. Science 1985; 230: 1350–1354.
3. Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposium in Quantitative Biology 1986; 51: 263–273.
4. Integen X RapidHIT 200 Human DNA Identification System, http://integenx.com/wp-content/uploads/2012/05/The-Case-for-Rapid-DNA.pdf

SEKCE NEXT GENERATION SEQUENCING

High-throughput metody real-time kvantitativní PCR, vysokorozlišující analýzy křivek tání a NGS

Blatný R.

KRD s.r.o

e-mail: lab@krd.cz

Představíme v současnosti nabízené služby a produkty vyvinuté v rámci výzkumných projektů a servisních zakázek s důrazem na pokročilé metody analýzy dat z high-throughput projektů založených na qPCR a HRM. Špičkové technické vybavení doplňujeme použitím nejnovějších metod analýzy dat ve statistickém jazyce R, například balíčcích „HTqPCR“, „qpcR“, „qpcrNorm“ a „ddCt“. Kromě zpracování dat z interních projektů na Idaho LightScanneru 96 a Roche LightCycleru 480 poskytujeme možnost spolupráce při plánování designu experimentů, výběru a vývoji vhodných reagencií a analýze finálních externích zákaznických dat z moderních high-throughput technologií, například ABI TaqMan Low Density Arrays a OpenArrays, CFX destiček společnosti Bio-Rad, konvenčních 96- a 384-jamkových destiček a inovativních mikrofluidních zařízení, například Dynamic Arrays od společnosti Fluidigm Corporation. Tyto metody slibují možnost budoucího vývoje produktů pro amplikonový target enrichment pro sekvenování druhé a třetí generace. Důležitou tradiční součástí našeho portfolia je možnost doplnění a propojení se službami hybridizace a analýzy mikroerejí. Nově nabízíme také zpracování mikroerejí od společnosti Agilent (další informace viz www.krdlab.cz).

Prezentované výsledky vznikly za podpory grantu Ministerstva průmyslu a obchodu TIP FR-TI3-588.

Ion Torrent/Ion Proton – od unikátní technologie sekvenování DNA k diagnostickému využití

Holeňa O.

Life Technologies Czech Republic

e-mail: Ondrej.Holena@lifetech.com

Technologie Ion Torrent je průkopníkem zcela nového přístupu k sekvenování DNA. Namísto použití světla pro průkaz sekvence DNA, Ion Torrent používá polovodičové technologie ve spojení se standardní polymerázovou reakcí. Ion Torrent překládá chemické signály vznikající při syntéze DNA řetězce – uvolněné vodíkové ionty – do digitální informace, podobně jako čip CMOS v digitálním fotoaparátu překládá fotony do pixelů. Tak jako rozvoj mikroprocesorů zpřístupnil počítačovou a digitální technologii široké veřejnosti, polovodičová technologie Ion Torrentu přináší možnost sekvenování DNA nové generace na dosah prakticky jakékoliv laboratoře. V prezentaci bude nastíněn princip polovodičového sekvenování na přístrojích Ion Proton a Ion Torrent, ale stejnou pozornost budeme věnovat možnostem, které uživatelům těchto přístrojů nabízí metoda AmpliSeq pro cílené resekvenování určitých genů nebo oblastí genomu, které mají vztah k diagnostickému využití. Na opačném konci celého metodického postupu je potom zpracování sekvenačních dat a možnost, kterou uživatelům nabízí Ion Reporter – „on cloud“ řešení umožňující rychlou a efektivní interpretaci získaných sekvencí.

Více informací lze získat k prezentované problematice lze získat na webových stránkách Life Technologies nebo na portálu uživatelů a zájemců o technologii polovodičového sekvenování DNA – http://ioncommunity.lifetechnologies.com

Využití sekvenování nové generace při studiu vzácných onemocnění

Nosková L.

Ústav dědičných metabolických poruch 1. LF UK a VFN, Praha

e-mail: noskova.lenka@gmail.com

Vzácná onemocnění jsou heterogenní skupinou nemocí, jejichž molekulární podstata je často neznámá. Vzhledem k tomu, že postihují někdy jen stovky či desítky pacientů na celém světě, není možné k jejich studiu přistupovat klasickými genetickými metodami. Díky novým možnostem analýzy genomu, především díky sekvenování nové generace a díky stále se zvyšující znalosti genetické variability člověka (1000 genomů, ESV, dbSNP, DGV) je možné efektivně odhalit kauzální mutace i u těchto onemocnění.

V Ústavu dědičných metabolických poruch 1. LF UK a VFN se poslední 2 roky věnujeme studiu vzácných onemocnění a syndromů pomocí sekvenování nové generace, podle charakteru jednotlivých projektů provádíme buď analýzu celého exomu, nebo vybraných kandidátních oblastí a genů. Dosud bylo v rámci 23 projektů sekvenováno přes 80 exomů, další čtyři projekty se zaměřují na sekvenování vybraného souboru genů. Nedílnou součástí analýz je kromě samotné technologie sekvenování také využití adekvátních bioinformatických nástrojů a následná expertíza v molekulárně biologické, buněčně patologické a cílené klinické charakterizaci nalézaných variant.

Zkušenosti s Next-generation sequencing analýzou

Štekrová J.¹, Janošíková B.²

¹ÚBLG VFN, Praha

²1. lékařská fakulta Univerzity Karlovy, Praha

e-mail: jstek@lf1.cuni.cz

Na našem pracovišti využíváme metodu Next generation sequencing (NGS) při diagnostice HNPCC a FAP na analýzu genů MLH1, MSH2, MSH6, EPCAM, APC, MUTYH. K amplifikaci používáme MASTR^® kity od Multiplikomu. Celkem se při vyšetření HNPCC analyzuje 64 amplikonů (celkem 15033 bp) a při vyšetření FAP 53 amplikonů (celkem 14646 bp). V jednom NGS runu lze analyzovat sedm jedinců se susp. HNPCC nebo jedenáct jedinců se susp. FAP (případně jejich kombinaci).

Validace metodiky probíhala analýzou již dříve vyšetřených pacientů (3krát pro HNPCC a 2krát pro FAP). Všechny nalezené varianty (příp. jejich nepřítomnost u WT) byly potvrzeny také s využitím NGS. Jednalo se o čtyři varianty v genu MLH1, WT v případě genu MSH2, dvě varianty v genu APC a jednu variantu v genu MUTYH.

Dále bylo analyzováno 15 pacientů se susp. FAP, kteří byli vyšetřeni zároveň používanou DGGE/HRM metodou a zároveň NGS metodou. U části takto vyšetřených pacientů byly získány identické výsledky – bylo detekováno pět mutací v genu APC a tři varianty v genu MUTYH. Navíc byly pouze metodou NGS nalezeny dvě mutace v části genu, která se vyšetřovala i původní metodou a pět missence mutací na 3´ konci genu APC, který se dosud používanou metodou nevyšetřuje. Pouze NGS metodou bylo dosud vyšetřeno 17 jedinců se susp. HNPCC a osm jedinců se susp. FAP. Pro potvrzení jsou všechny varianty nalezené v kódující sekvenci ověřeny amplifikací daného úseku a klasickou sekvenací. Metodou NGS jsou detekovány i „falešně pozitivní“ varianty, jejichž výskyt se liší podle jednotlivých genů a provedení analýzy. Přes relativní pracnost provedení a falešnou pozitivitu je však NGS citlivá a relativně rychlá metoda.

Práce je podporována výzkumným programem PRVOUK-P27/LF1/1.

Sekvenování nové generace v diagnostice mitochondriálních onemocnění – první zkušenosti

Tesařová M.¹, Vondráčková A.¹, Stránecký V.², Stejskal D.³, Hansíková H.¹, Zeman J.¹

¹Klinika dětského a dorostového lékařství 1. LF UK a VFN, Praha

²Ústav dědičných metabolických poruch 1. LF UK a VFN, Praha

³Gennet, s.r.o.

e-mail: marketa.tesarova@lf1.cuni.cz

Sekvenování nové generace (NGS) představuje významný mezník v objasňování příčiny dědičných onemocnění. Velkým přínosem je zejména pro ty skupiny chorob, které jsou geneticky velmi heterogenní. Takovou skupinu představují mitochondriální onemocnění (MO), která jsou způsobená poruchou systému oxidativní fosforylace, a jejich incidence je odhadovaná na 1 : 5000. Mitochondriální onemocnění se mohou manifestovat v kterémkoliv věku, klinické projevy mohou být mírné, ale i fatální a obvykle postihují více než jednu tkáň. Mitochondriální onemocnění mohou být způsobena mutacemi v mitochondriální DNA, kdy je dědičnost maternální, nebo mutacemi v jaderných genech, kdy je dědičnost autozomálně recesivní, autozomálně dominantní nebo X-vázaná. Doposud bylo popsáno více než 180 různých jaderných genů, jejichž mutace vedou k rozvoji MO, a v posledních 3 letech jsou tyto geny identifikovány právě pomocí NGS (více než 20 genů). Na základě klinických příznaků nebo jednoduchých laboratorních vyšetření je možné přesně zacílit genetické vyšetření pouze u několika málo typů MO (syndrom MNGIE, mitochondriální encefalo-kardiomyopatie – TMEM70, Leigh syndrom způsobený mutacemi v SURF1), u ostatních je to zcela nemožné a ani náročné biochemické vyšetření neumožní jednoznačně vytipovat omezenou skupinu kandidátních genů. Na příkladě čtyř pacientů chceme prezentovat naše zkušenosti s aplikací NGS v diagnostice mitochondriálních onemocnění.

Podpořeno grantem IGA NT13114 a IGA NT11186.

Next generation sequencing v podání Roche 454

Vohánka J.

Roche s.r.o.

e-mail: jaroslav.vohanka@roche.com

Stolní sekvenátor GS Junior je dnes už v mnoha laboratořích v České republice ideálním nástrojem, jak se ve velmi krátkém čase a při akceptovatelných ekonomických nákladech dostat k cenným sekvenačním datům. Rozšířenost tohoto systému v České republice ukazuje, že nejen „ready-to use“ soupravy, ale i aplikační a technický servis usnadňují cestu této platformy do rutinního diagnostického provozu.

Otevřenost GS Junior systému dává příležitost k vytváření vlastního experimentálního designu i samotné laboratoři, nebo je možné využít komerčně dostupné diagnostické soupravy. Rozšíření sekvenování nové generace do jednotlivých laboratoří ale také znamená radikální změnu pohledu na analyzovaná data, kdy objemy sekvencí často atakují desítky tisíc sekvencí pro jeden vzorek.

Je tedy nesmírně důležité správně uchopit bioinformatické nástroje, které jsou pro tuto platformu vyvinuty a nebát se naučit správně interpretovat získaná data.

POSTEROVÁ SEKCE

Profilování genové exprese HGPS pacientů pomocí platformy Agilent

Blatný R.¹, Filimonenko V.², Jarolímová L.², Halbhuber Z.¹, Hozák P.²,Krivjanská M.¹

¹KRD s.r.o Praha

²ÚMG, Praha

e-mail:lab@krd.cz

Hutchinsonův-Gilfordův syndrom (zkr. HGPS, tzv. pravá progerie) je vzácné genetické onemocnění, při kterém se v relativně raném věku začínají objevovat známky předčasného stárnutí. Pacienti s vrozenou progerií se obvykle dožívají maximálně dorosteneckého až časně dospělého věku a nejčastějšími příčinami úmrtí jsou infarkt myokardu a mozková mrtvice. HGPS je obvykle způsoben dominantní mutací v genu laminu A (LMNA). Doposud je známo a publikačně doloženo 22 mutací v genu LMNA asociovaných s rozvojem HGPS. Tyto mutace lze detekovat klasickými metodami sekvenování nebo sekvenováním nové generace, vysokorozlišovací analýzou křivek tání (HRMA) a denaturující vysokorozlišovací kapalinovou chromatografií (DHPLC). Na subcelulární, mikroskopické úrovni se onemocnění projevuje morfologickými abnormalitami ve struktuře jaderné blány. V rámci našeho úsilí o integraci technologií (a jejich výsledků) užívaných k získání informací o genomových mutacích (klasické či next-gen sekvenování, skenovací HRMA nebo specifická bodová HRMA za použití neznačené sondy), genové expresi (qPCR, mikroerejová analýza, next-gen sekvenování) a její regulaci (ChIP-chip, ChIP-qPCR, ChIP-seq) u pacientů s HGPS, využitelných k dalšímu zlepšování metod diagnózy, prognózy, léčby a celkové kvality života pacientů s HGPS, jsme provedli pilotní experiment analyzující genovou expresi ve fibroblastových liniích šesti pacientů s HGPS v porovnání s šesti kontrolními fibroblastovými imortalizovanými liniemi. Cílem prezentovaného experimentu bylo získání počáteční přehledné informace o změnách v expresi genů u pacientů s HGPS. Analýza byla provedena s použitím platformy Agilent a její výsledky jsou prezentovány formou plakátového sdělení. Náš projekt, podporovaný Ministerstvem obchodu ČR (grant FR-TI3-588) a Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy ČR (grant reg. no. COST 4131/10), je zaměřen na detekci mutací ve strukturních proteinech a s nimi souvisejících změn exprese. Jeho cílem je vývoj komplexních diagnostických metod.

Studium metylačního statusu vybraných genů a lokusů u kolorektálního karcinomu

Bóday Á.^1,5, Tavandzis S.¹, Horká K.¹, Vaníčková P.¹, Dvořáková H.¹,Čáň J.¹, Sýkora M.¹, Hodslavská V.¹, Kasperčík I.², Škrovina M.³,Gruna J.⁴

¹Laboratoř molekulární biologie, P&R LAB a.s., Nový Jičín

²Laboratoř bioptická a cytologická, P&R LAB a.s., Nový Jičín

³Chirurgické oddělení, Nemocnice Nový Jičín a.s., Komplexní onkologické centrum, Nový Jičín

⁴Onkologické oddělení, Nemocnice Nový Jičín a.s., Komplexní onkologické centrum, Nový Jičín

⁵Katedra biomedicínských oborů, LF OU, Ostrava

e-mail: arpad.boday@pr-lab.cz

Úvod: Kolorektální karcinom (CRC) je celosvětově považován za civilizační chorobu. Navzdory tomu, že incidence CRC v posledních 5 letech v České republice stagnuje, a mortalita mírně klesá, stále jsme na 1. místě na světě ve výskytu tohoto onemocnění u mužů a na 9. místě u žen.

Vznik CRC je výsledkem kumulace rozdílných genetických a epigenetických změn postihující epiteliální buňku. Proces je charakterizován inaktivací tumorsupresorů, aktivací protoonkogenů, deficiencí „mismatch repair“ genů a zásahem do dalších genů prostřednictvím mutací, ztrát alel, hypometylací, hypermetylací, ztrátou imprintingu, microRNA atd. Výsledkem je nekontrolovatelné dělení buněk s vysokou invazivitou a schopností zakládání metastáz.

Cíl: Cílem této práce je studium metylačního statusu promotorů genů MLH1, APC, p16, TP53, MGMT a lokusů MINT1 a MINT2 a stanovení frekvence tohoto typu epigenetické změny v souboru vyšetřených nádorů.

Metoda: Tato pilotní studie zahrnuje 100 pacientů s CRC. DNA byla izolována ze mražené nádorové tkáně (Fuji). Po bisulfitové konverzi (Epigentek) byla provedena amplifikace klasicky a/nebo v reálném čase za použití specifických primerů a hydrolyzačních sond. Separace klasicky amplifikovaných PCR produktů proběhla v agarózovém gelu a na DNA čipech (Agilent).

Výsledky a závěr: V analyzovaném souboru byla detekována hypermetylace v genu APC – 33/100 (33 %), MLH1 – 15/100 (15 %), p53 – 11/100 (11 %), p16 – 22/100 (22 %), MGMT – 36/100 (36 %), MINT1 – 21/100 (21 %), MINT2 – 28/100 (28 %).

Výsledky metylačních analýz jsou dále hodnoceny spolu s mikrosatelitovou instabilitou, ztrátou heterozygozity a přítomností mutací v genech K-ras, BRAF, EGFR a PIK3CA a jsou korelovány s histologickými nálezy.

Získané údaje umožňují molekulární subtypizaci CRC, výběr odpovídajícího konkrétního molekulárního markeru ke sledování progrese a predikce onemocnění a také odpovědi na terapii.

Optimalizace a validace RhD a KELL genotypování pro neinvazivní prenatální diagnostiku

Böhmová J.¹, Vodička R.¹, Lubušký M.², Kratochvílová R.¹,Krejčiříková E.¹, Vrtěl R.¹

¹Ústav lékařské genetiky a fetální medicíny FN, Olomouc

²Porodnicko-gynekologická klinika FN, Olomouc

e-mail: bohmovajana@seznam.cz

Úvod: Důvody zavedení metodiky neinvazivního stanovení RHD a KELL statutu plodu na začátku těhotenství jsou dva:

1. U aloimunizovaných těhotných žen určit plody, které jsou ohrožené hemolytickou nemocí plodu i novorozenců.
2. U žen, které aloimunizované nejsou, provést na základě genotypizace prevenci aloimunizace během těhotenství efektivněji a levněji.

Do současnosti však nebyla v České republice provedena studie, která by posoudila citlivost metodiky se zavedením a využitím vnitřní kontroly amplifikace pro účely neinvazivního stanovení RHD a KELL genotypu plodu pomocí kalibrační řady arteficiálních genotypických směsí.

Cíle práce:

1.  posoudit dva typy separačních postupů založených na adsorpci na silikagelový povrch a na separaci na magnetických částicích.
2. Optimalizovat a vyhodnotit genotypování RHD a KELL pomocí real time PCR a minisekvenace (SNaPshot).

Metoda: Izolační postupy byly testovány celkem u 86 vzorků cffDNA metodami real time PCR a/nebo kapilární elektroforézou. Celkem bylo použito pro stanovení genotypů 200 kontrolních vzorků. Optimalizace a kalibrace RHD a KELL genotypizace (KEL1/KEL2 – pozitivní/negativní) byly provedeny pomocí real time PCR a kapilární elektroforézou (minisekvenováním).

Výsledky: Mezi testovanými metodami izolace byly zjištěny prokazatelné rozdíly ve výnosu cffDNA mezi různými typy kolonek a mezi silikagelovou kolonkovou metodou a metodou separece pomocí magnetických partikulí.

TaqMan real time PCR systém byl schopen detekovat 0,22 % RHD ± a KEL1 arteficiální genotypové příměsi. Minisekvenací (SNaPshot) na základě kvantifikace bylo možné detekovat 0,22 % RHD ± a 1,7 % KEL1 arteficiální genotypové příměsi. Minisekvenace je vhodná pro rozlišení homozygotů a heterozygotů. Obě metody jsou schopné rozpoznat fetální genotyp.

Projekt je podporován IGA MZ ČR NT12225.

Triploidies identified at prenatal diagnosis

Čejnová V.¹, Wilimská M.¹, Harmaš V.¹, Marečková J.², Klímová A.¹, Laštůvková J.¹

¹Oddělení lékařské genetiky, Masarykova nemocnice v Ústí nad Labem, o.z.

²Patologické oddělení, Masarykova nemocnice v Ústí nad Labem, o.z.

e-mail: vlasta.cejnova@mnul.cz

Triploidy, the presence of an extra haploid set of chromosomes, is one of the most frequent chromosomal abnormalities affecting human gestation. Its prevalence among all pregnancies has been estimated to be approximately 1% to 3%. Triploidy may be the result of either digyny (extra haploid set from mother) or diandry (extra haploid set from father).

Two distinct phenotypes observed in triploid fetuses have been shown to be associated with parental origin of the triploidy (McFadden and Kalousek 1991). The diandric phenotype is characterised by a normally sized or mildly symmetrically growth retarded fetus with normal adrenal glands, and is associated with an abnormally large, cystic placenta with histological features known as partial hydatidiform mole (Type I). The digynic phenotype is characterised by marked asymmetric intrauterine growth restriction (IUGR), marked adrenal hypoplasia, and a very small, non-molar placenta (Type II).

We present chromosomal, fetal ultrasound and pathological findings in two cases of triploidy diagnosed prenatally. The parental origin of the additional haploid chromosome set was determined based on a range of highly polymorphic microsatellite markers. In the first case, the fetal karyotype was 69,XXY and the histological investigation showed bilateral cystic renal dysplasia.

There were external and internal fetal anomalies, and marked IUGR in the second case of triploidy (69,XXX). The parental origin of the triploidies was found to be maternal and both triploidies were screen positive for trisomy 18.

It has been published that digynic triploidy predominates in fetuses, and diandry accounts for about 50–60 % of early triploid spontaneous abortions.

Detection of DNA Variations in the HMBS Gene in patients with AIP: an Update

Douděrová D., Puchmajerová A., Martásek P.

Laboratory for Study of Mitochondrial Disorders, 1st Faculty of Medicine, Charles University, Prague

e-mail: dana.u@email.cz

Background: Acute intermittent porphyria (AIP) is the major autosomal dominant acute hepatic porphyria. AIP is caused by decreased activity of hydroxymethylbilane synthase (HMBS), the third enzyme of the heme biosynthetic pathway. Clinical features include autonomous, central, motor or sensory symptoms, but the most common clinical presentation is abdominal pain caused by neurovisceral crises.

Methods: In order to improve molecular testing of the HMBS gene we use a fast, cost-effective pre-screening method of high-resolution melting using the LightScanner instrument. DNA variations detected by this technique are confirmed by sequencing.

Results: Previously in this study, twenty-eight DNA variations were identified in patients with AIP. Out of them, thirteen were novel mutations, ten were previously reported mutations, two were previously reported polymorphisms, and three were novel rare DNA variations, which require further investigation. Moreover, out of the novel mutations identified, two were de novo mutations, which are rare events in this disorder.

Recently, another novel mutation c.710T>G (p.Val237Gly) and one mutation c.500G>A (p.Arg167Gln) novel for Czech population, were identified. To the fifteen mutations known to exist in the Slavic population to date, another two mutations were identified, broadening the molecular heterogeneity of the HMBS gene in our population.

Conclusion: The probability of a life-threatening porphyric attack in AIP is a significant personal burden and creates a challenge for counseling and medical management. Introducing molecular biology techniques to the diagnosis increase our chances for early treatment of AIP. Based on the identification of the causal mutation in the HMBS gene of the index patient, appropriate genetic counselling based on the DNA diagnostics was applied within the AIP affected families.

Supported by Grants UNCE 204011/12, PRVOUK P24/LF1/3, IGA NT 13120-4/2012.

Array-CGH ukázala, že zdánlivá parciální monozomie X je ve skutečnosti rozsáhlá monozomie Xp spojená s částečnou trizomií 15q jako důsledek t(X,15)

Durcová L.¹, Popelínská E.¹, Freiberger T.², Šíblová I.¹, Vlašín P.², Grochová D.¹

¹Cytogenetická laboratoř, Brno

²Centrum prenatální diagnostiky Veveří, Brno

e-mail: luc.ol@seznam.cz

V prenatální diagnostice je více než 30 let využíváno stanovení karyotypu plodu z plodové vody nebo choriových klků konvenčním cytogenetickým vyšetřením, avšak tato metoda je schopna detekovat jen chromozomální abnormality větší než 5 Mb. Metoda array-CGH dokáže odhalit mikrodelece a mikroduplikace s větším rozlišením a je schopna upřesnit nález konvenčního cytogenetického vyšetření. V naší laboratoři využíváme čip na bázi array-CGH od firmy BlueGnome (Cytochip Focus Constitutional), který má rozlišovací schopnost 100 kb ve 143 klinicky významných lokusech a 0,5–1 Mb v dalších oblastech genomu.

Prezentujeme případ 30leté těhotné ženy, u které ultrazvukové vyšetření plodu odhalilo výpotek v levé polovině hrudníku, NT 3,0 mm, srdeční hrot směřující více ke sternu a suspektní koarktaci aorty. Při biochemickém screeningu bylo stanoveno riziko trizomie 21 1 : 2 a trizomie 13 a 18 1 : 180. Klasické G-pruhování chromozomů amniocytů odhalilo strukturní změnu chromozomu X, která se jevila jako parciální monozomie Xp. Pro upřesnění rozsahu této delece bylo provedeno vyšetření metodou array-CGH, které detekovalo rozsáhlou deleci chromozomu X (Xp11.22p22.33) a zároveň duplikaci části chromozomu 15 (15q25.2q26.3). Tento výsledek byl dále ověřen metodou FISH, která prokázala, že duplikace je důsledkem t(X,15). Podle dostupné literatury bývá duplikace této oblasti chromozomu 15 spojována s „15q overgrowth“ syndromem. Navíc je tato duplikace často asociována s parciální delecí jiného chromozomu (např. 13q34-qter). Dosud však nebyl popsán případ tohoto syndromu spojený s delecí chromozomu X.

Kazuistika podtrhuje důležitost array-CGH v diagnostice chromozomálních abnormalit, která dokáže přesněji objasnit výsledky získané konvenční cytogenetickou analýzou a poukazuje na nutnost propojení klasické a molekulární cytogenetiky.

Molekulárně genetická diagnostika Niemann-Pickovy choroby typu C

Dvořáková L., Vlášková H., Štorkánová G., Boučková-Hnízdová M.,Trešlová H., Stolnaya L., Jahnová H., Pešková K., Elleder M.,Hřebíček M.

Ústav dědičných metabolických poruch 1. LF UK a VFN, Praha

e-mail: lenka.dvorakova@lf1.cuni.cz

Niemann-Pickova choroba typ C (NPC, MIM 257220, 607625) je vzácné, ale velice závažné autozomálně recesivní neuroviscerální onemocnění charakterizované hepatosplenomegalií a rozvojem neurologických příznaků. Základním rysem onemocnění je lysozomální střádání volného neesterifikovaného cholesterolu a glykolipidů v důsledku poruchy intracelulárního transportu lipidů. Na úrovni DNA je onemocnění způsobeno mutacemi v jednom ze dvou genů – NPC1 (25 exonů) nebo NPC2 (5 exonů), které kódují funkčně kooperující proteiny neenzymové povahy. Naprostá většina pacientů (95 %) náleží do skupiny NPC1, zbylých 5 % pak do skupiny NPC2 (1). Molekulárně genetické vyšetření zavedené na našem pracovišti má zásadní význam pro včasné a přesné určení diagnózy umožňující efektivní genetické poradenství v postižených rodinách. Znalost genotypu pacienta je důležitá i vzhledem k novým experimentálním terapeutickým přístupům založených např. na využití chaperonů (2). Diagnóza na molekulárně genetické úrovni byla potvrzena u 41 pacientů z 38 rodin náležejících do komplementační skupiny NPC1. Mutace v genu NPC2 byly potvrzeny pouze v jedné rodině. Klinické příznaky pacientů byly velmi variabilní – od infantilních neurologických po adultní ryze viscerální formy. Sekvenováním Sangerovou metodou jsme v genu NPC1 identifikovali 73 mutantních alel; ze 32 různých mutací bylo 14 nových, dříve nepopsaných. Vzorky tří pacientů, u nichž byla nalezena pouze jedna mutace, byly analyzovány metodou MLPA, druhá mutace však nebyla zjištěna. Nalezené mutace jsou rozloženy po celém genu, z hlediska genetického poradenství je však důležité, že 60 % všech identifikovaných mutací se nachází ve 4 exonech (18, 19, 20, 23). Nejčastějšími mutacemi byly p.R1186H v exonu 23 (16 alel), p.S954L v exonu 19 (11 alel) a p.P1007A v exonu 20 (8 allel). Celkem bylo nalezeno 21 různých mutací vedoucích k záměně aminokyselinového zbytku. Lze předpokládat, že tyto mutace způsobují snížení, nikoliv absenci, biologické aktivity proteinu, a jsou proto vhodnými kandidáty pro další výzkum vedoucí k novým farmakologickým přístupům v léčbě NPC.

Literatura

1. Vanier MT. Orphanet Journal of Rare Diseases 2010; 5: 16.
2. Gelsthorpe ME, et al. J Biol Chem 2008; 283: 8229.

Práce je podporována granty IGA MZ CR NT12239-5/2011,RVO-VFN64165/2012, PRVOUK-P24/ LF1/3.

Molekulární detekce patogenů – možnosti současné laboratorní diagnostiky

Dvořáková L., Čmejla R., Mazal O., Haugvicová R., Lukavská M., Kavanová M., Šnajdr P., Peková S.

Laboratoř molekulární diagnostiky, Chambon s.r.o., Praha

e-mail: lucidvor@gmail.com

Molekulární detekce patogenních mikroorganismů (virů, bakterií, hub, parazitů) je atraktivní metodou volby v celé řadě klinických situací, kdy techniky klasické mikrobiologie, imunohistochemie nebo sérologie neumožňují díky svým praktickým limitacím infekční agens identifikovat. Jedná se především o klinické stavy způsobené obtížně kultivovatelnými patogeny (Chlamydia spp., Mycoplasma spp., Ureaplasma spp., Ehrlichia spp., Mycobacterium spp.), reaktivaci herpetických virů u pacientů s leukopenií a nedostatečnou tvorbou protilátek (hematoonkologičtí, imunosuprimovaní a transplantovaní pacienti), perakutně probíhající infekce (sepse, těžké nozokomiální nebo komunitní pneumonie, meningitidy, epidemie), infekce anaerobními mikroorganismy (mozkové abscesy, kloubní infekty), infekce u novorozenců, malých dětí a infekce v obtížně bioptovatelných lokalitách (limitní množství odebraného materiálu).

Techniky molekulární biologie umožňují přesně identifikovat mikroorganismy na základě jim unikátních sekvencí, bez ohledu na jejich fitness po náběru/v průběhu transportu nebo kultivační nároky. Molekulární detekce patogenů založená na technikách kvantitativní Real-Time PCR umožňuje v několika hodinách identifikovat potenciálně kauzální mikroorganismus a rovněž kvantifikovat jeho nálož v odebraném biologickém materiálu. Tento přístup umožňuje klinickým lékařům u akutních lůžek rychlé posouzení klinického stavu pacienta, okamžité nasazení cílené léčby (s dodatečnou úpravou po určení ATB profilu technikami klasické mikrobiologie) a celkově razantní a specifický přístup ke zvládnutí akutní události. V naší laboratoři jsme od roku 2009 vyvinuli rozsáhlý repertoár kvantitativních Real-Time PCR esejí, pro rychlou a kvantitativní detekci přes 250 různých patogenních mikroorganismů (RNA viry, DNA viry, bakterie, houby, paraziti). Pro potřebnou rychlost a úsporu biologického materiálu byly eseje maximálně multiplexovány, s využitím pětibarevné fluorescenční Real-Time PCR technologie a patogen-specifických hybridizačních sond. Diagnosticky nejdůležitější systémy vyvinuté naší laboratoří získaly CE-IVD certifikát. Od ledna 2010 bylo naší laboratoří těmito technikami vyšetřeno 12 389 klinických vzorků nejrůznějšího původu (BAL, punktáty, aspiráty z dolních dýchacích cest, stěry z lézí, mozkomíšní mok, periferní krev, moč, stolice, bioptické materiály). Nepřekonatelnou výhodou těchto vyšetření je jejich rychlost, nezávislost na biologických charakteristikách a kultivačních nárocích mikroorganismů a především kvantitativní nález. Na základě kvantitativního nálezu lze i ve směsných, primárně nesterilních vzorcích (sputum, stěry z lézí) identifikovat potenciálně kauzální agens.

Erythropoietic protoporphyria: Novel mutation in the ferrochlatase gene in a Czech family

Farrag S.¹, Kučerová J.¹, Šlachtová L.¹, Puchmajerová A.¹, Šperl J.², Martásek P.¹

¹1. LF UK, Praha

²IKEM, Praha

e-mail: sameh.farrag@yahoo.com

Erythropoietic protoporphyria (EPP) is characterized by excess accumulation of protoporphyrin in erythrocytes,liver and plasma due to deficiency of ferrochelatase (FECH), the last enzyme in the heme biosynthesis. EPP, an autosomal dominant disorder, is almost always associated with two molecular defects. In most of EPP patients, clinical expression requires co-inheritance of a private FECH mutation trans to a hypomorphic FECH*IVS3-48C allele that leads to marked decrease in the enzyme activity. EPP is characterized by cutaneous photosensitivity such as redness, itching, blistering after sun exposure. Hepatic failure occurs in some patients (about 3-10% of EPP patients) which may indicate liver transplantation (1). We investigated mother and son of Czech origin with manifest EPP and 7 members of their family in 4 generations. A novel mutation in the FECH gene in 4 individuals including probands (G→A transition at position 84 in exon 2; W28X, located in a mitochondrial targeting sequence) was found. In both clinically manifest probands (in son, recently, a liver transplantation was performed) (2) we found a hypomorphic allele as well, contrary to two clinically latent individuals with FECH mutation only. In addition, we screened the frequency of the IVS-48C allele in Slavic Czech population in 312 control individuals(149 males, 163 females). We found the IVS-48C allele in 35 cases(15 males and 20 females). The prevalence of the IVS-48C allele was found to be 11% in the Czech population, 10% among males and 12% among females. These results were found to be similar as in other European populations like in white French (11%) and in British (13%).

Literatura

1. Puy H, Gouya L, Deybach JC. Porphyrias. Lancet 2010; 375(9718): 924–937.
2. Sperl J, Procházková J, Martásek P, Subhanová I, Franková S, Trunecka P, Jirsa M. N-acetyl cysteine averted liver transplantation in a patient with liver failure caused by erythropoietic protoporphyria, Liver Transpl. 2009; 15(3): 352–354.

The project was supported by grants from Charles University in Prague, UNCE 204011/2012 and PRVOUK P24/LF1/3/2012.

Tuberózní skleróza – variabilita fenotypových projevů

Filipová H.¹, Hůrková V.¹, Hořínová V.², Godava M.¹, Vodička R.¹, Vrtěl R.¹

¹Ústav lékařské genetiky a fetální medicíny LF UP a FN, Olomouc

²Ambulance lékařské genetiky, Jihlava

e-mail: vrtel@fnol.cz

Tuberózní skleróza je onemocnění autozomálně dominantní. Jeho incidence je odhadována na asi 1 : 5800 živě narozených dětí. Onemocnění způsobuje mutace v tumor – supresorovém genu TSC1 nebo TSC2. Gen TSC1 kóduje hamartin. Gen TSC2 kóduje tuberin. Ve dvou třetinách případů jde o mutaci de novo. V asi jedné třetině případů se jedná o familiární výskyt. Pro tuberózní sklerózu je typická velká variabilita symptomů. Rozdílná exprese je pozorována nejen u pacientů z různých rodin, ale i mezi postiženými příbuznými v rámci jedné rodiny. V první kazuistice jde o případ de novo vzniklé mutace v genu TSC2. U probanda došlo k typickým projevům tuberózní sklerózy.

Přestože byla mutace u rodičů probanda vyloučena, není riziko narození dalšího dítěte s tuberózní sklerózou na úrovni populačního rizika. Zůstává riziko gonadálního mozaicismu, které se udává 2–10 %. Ve druhé kazuistice jde o familiární výskyt tuberózní sklerózy s velice variabilními projevy od velmi těžkého postižení po prakticky nulové příznaky. Přestože u některých členů rodiny s prokázanou mutací v genu TSC1 zatím nedošlo k rozvoji projevů tuberózní sklerózy, je nutné jejich další sledování a prekoncepční péče v genetické ambulanci. Riziko narození dalšího dítěte s tuberózní sklerózou je 50% a závažnost projevů je dopředu těžko odhadnutelná.

An universal solution for studying epigenetic regulation of SPI1 gene in different types of tumors

Halbhuber Z., Blatný R., Krivjansky V., Vasak J., Krivjanska M.

KRD – obchodní společnost s.r.o.

e-mail: krdlab@krd.cz

The Chromatin immunoprecipitation (ChIP) plays a central role in epigenetic studies but ChIP is also a very technically challenging method and numerous factors can cause it to fail, so researchers who are not experts in the techniques are best served using well-validated and reliable kits to perform these assays. A product line called SureChIP was developed. SureChIP kits make ChIP more consistent, reproducible and faster by offering researchers all components they need in a single product.

The SureChIP protocol was establish upon a several optimization and validation steps. All optimization steps were related to URE PU.1 loci using qPCR.

Each individual steps (such as crosslinking, isolation of nuclei, chromatin isolation, chromatin shearing, beads blocking and preclearing, DNA isolation, PCR detection) was optimized separately. As an optional accessory is available a validated set of control primers designed to constantly expressed, negative and tissue-specific loci.

SureChIP is rapid and sensitive protocol for ChIP and with related products makes a SureChIP product line. Products range from complete kits for ChIP, through the various reagents to the control sheared chromatin from different cell lines.

This work was supported by grant FR-TI2/509 from Ministry of Industry and Trade of the Czech Republic.

Výsledky testování rodin s podezřením na Lynchův syndrom v MOÚ – analýza MLH₁, MSH₂, MSH₆ a EPCAM

Házová J., Macháčková E., Vašíčková P., Sťahlová Hrabincová E., Navrátilová M., Foretová L.

Oddělení epidemiologie a genetiky nádorů, Masarykův onkologický ústav, Brno

e-mail: hazova@mou.cz

Lynchův syndrom (hereditární nepolypózní kolorektální karcinom, HNPCC) je dominantně dědičná nádorová predispozice spojená s vysokým celoživotním rizikem rozvoje karcinomu tlustého střeva, u žen také karcinomu endometria a vaječníků. HNPCC je způsoben zárodečnými mutacemi v DNA mismatch repair (MMR) genech, které jsou zapojeny do oprav chybného párování bází vznikajících během replikace DNA. Poruchy tohoto systému vedou k akumulaci mutací a rozvoji nádorového onemocnění.

Nejčastější geny spojené s HNPCC jsou MLH1, MSH2, MSH6 a PMS2. Téměř 90 % mutací se nachází v genech MLH1 a MSH2, vzácnější jsou mutace v genech MSH6 a PMS2. Většina mutací je bodových. Byly nalezeny i velké intragenové delece, které se nejčastěji vyskytují v genu MSH2. Sekvenční změny a přestavby jsou evidovány v HGMD (The Human Gene Mutation Database) a InSiGHT (The International Society for Gastrointestinal Hereditary Tumours) databázi.

Jako nový mutační mechanismus způsobující Lynchův syndrom je popisována zárodečná delece genu EPCAM = TACSTD1 (epithelial cell adhesion molecule, tumor associated kalcium signal transducer 1). Gen EPCAM je lokalizován asi 15 kb před genem MSH2, obsahuje 9 exonů. Delece v 3´oblasti, které postihují exony 8 a 9 a úsek pro polyadenylační signál, vedou k narušení terminace translace a vzniku fúzního transkriptu EPCAM/MSH2. Dochází k metylaci promotoru a epigenetické inaktivaci genu MSH2, která je také spojena s predispozicí k Lynchovu syndromu.

V laboratoři Oddělení epidemiologie a genetiky nádorů MOÚ provádíme molekulárně genetické vyšetření Lynchova syndromu od roku 2008. Testujeme kompletní kódující sekvence a místa sestřihu tří vysoce rizikových genů – MLH1, MSH2 a MSH6. K vyhledávání sekvenčních změn používáme vysokorozlišovací analýzu křivek tání s použitím přístroje Light Scanner (Idaho technology) a nově i denaturační vysokorozlišovací kapalinovou chromatografii s využitím přístroje Wave system 4500 (Transgenomic). U všech těchto genů provádíme také analýzu intragenových přestaveb pomocí metody MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification). Touto metodou lze také analyzovat delece koncových oblastí genu EPCAM.

Doposud jsme vyšetřili 312 nepříbuzných jedinců s podezřením na Lynchův syndrom. Patogenní mutaci jsme nalezli u 36 probandů, což představuje 11,5 %. Nejčastěji se jednalo o sestřihové a frameshift mutace – 16 záchytů v genu MLH1, 12 v genu MSH2 a v genu MSH6 nebyla nalezena žádná bodová mutace. V osmi případech byla potvrzena rozsáhlá delece zahrnující jeden či více exonů – jeden záchyt v genu MLH1, pět v genu MSH2 a jeden v genu MSH6. U jednoho probanda byla nalezena vzácná delece exonů 8 a 9 a 3´nepřekládané oblasti genu EPCAM. V této rodině se vyskytovaly pouze nádory rekta ve věku 41, 43 a 70 let.

Genetické testování má velký význam pro rodinné příslušníky. Příbuzným z rizikové rodiny, kde byla detekována patogenní mutace, nabízíme po předchozí genetické konzultaci prediktivní vyšetření familiární mutace. Nosičům zárodečné mutace v MMR genech je vytvořen preventivní program na základě mezinárodních doporučení InSIGHT. Prevence je velmi důležitá pro časný záchyt nádorových onemocnění. Více informací o genetickém testování Lynchova syndromu naleznete na adrese www.mou.cz.

Syndrom CHARGE – první pacienti diagnostikovaní na našem pracovišti

Hedvičáková P.¹, Apltová L.¹, Simandlová M.¹, Šantavá A.², Puchmajerová A.¹

¹Ústav biologie a lékařské genetiky 2. LF UK a FN Motol, Praha

²Ústav lékařské genetiky a fetální medicíny FN, Olomouc

e-mail: petra.hedvicakova@fnmotol.cz

CHARGE syndrom je velmi variabilní autozomálně dominantní syndrom spojený s četnými malformacemi, které postihují několik orgánových systémů. Klinicky se částečně překrývá s Kallmannovým syndromem. První pacienti spadající do této kategorie byli popsáni v roce 1979, již v roce 1961 však byly publikovány případy, které odpovídaly později vymezenému syndromu.

Asi 2/3 pacientů s CHARGE syndromem mají mutaci v genu CHD7 (chromodomain helicase DNA-binding protein) na dlouhém raménku 8. chromozomu. Jedná se převážně o heterozygotní mutace typu nonsense nebo frameshift, většinou jsou unikátní. Žádná korelace genotyp-fenotyp nebyla dosud pozorována.

Název syndromu je akronym, v němž se skrývá výčet nejčastějších znaků: C – coloboma (oční kolobom), H – heart (defekty srdce), A – atresia (atrézie choan), R – retardace (růstu a vývoje), G – genital (anomálie genitálu), E – ear (anomálie uší spojené s hluchotou).

Diagnostická kritéria jsou jasně stanovena, ačkoliv se u pacientů nevyskytují vždy všechny typické malformace – a naopak někteří z pacientů s typickým fenotypem nemají mutaci v genu CHD7. Podstatná je zejména přítomnost triády kolobom – atrézie choan – abnormální semicirkulární kanálky. Protein kódovaný genem CHD7, vyskytující se v nukleoplazmě a v jadérku, se účastní regulace transkripce, protože ovlivňuje organizaci chromatinu.

Gen tvoří 38 exonů, první exon a část exonů 2 a 38 se nepřekládá.

Syndrom CHARGE se vyskytuje s prevalencí přibližně 1/10 000–15 000 novorozených dětí. Dědičnost je autozomálně dominantní, s různou penetrancí. Naprostá většina mutací je de novo, nicméně byl popsán i přenos z rodiče s mírnými příznaky na potomka; riziko rekurence se blíží 1 %. Literatura potvrzuje riziko germinálního mozaicismu.

V roce 2012 jsme zavedli diagnostiku přímou sekvenací kódující oblasti genu CHD7. Vyšetřili jsme devět pacientů s indikací suspektní syndrom CHARGE, prezentujeme šest pacientů s nálezem různých typů mutací, z nichž některé dosud nebyly popsány.

Podpořeno projektem (Ministerstva zdravotnictví ČR) koncepčního rozvoje výzkumné organizace 00064203 (FN Motol).

Varianta v oblasti genů pro nikotinové receptory ovlivňuje počty vykouřených cigaret

Hubáček J., Kramná R., Lánská V., Adámková V.

Institut klinické a experimentální medicíny

e-mail: jahb@ikem.cz

Úvod: Kouření tabáku je jedním z nejrozšířenějších preventabilních rizikových faktorů rozvoje kardiovaskulárních a nádorových onemocnění. Odhaduje, se, že genetické predispozice ovlivňují kuřácký status a počet vybouřených cigaret až z 60 %. Celogenomové screeningy detekovaly potenciál rs578776 varianty v oblasti nikotinových receptorů (konkrétně CHRNA3) ovlivnit závislost na nikotinu. Analyzovali jsme vztah této varianty a rizika vzniku nikotinismu v české populaci.

Metoda: Rs578776 (C → T) varianta byla analyzována pomocí PCR-RFLP u 2559 reprezentativně vybraných mužů a žen (věk 25–65 let) ze studie post-MONICA. Kuřácký status a počet vykouřených cigaret byl zjišťován pomocí dotazníků. ANOVA a chí-kvadrát byly použity pro statistickou analýzu.

Výsledky: Frekvence jednotlivých genotypů (CC – 54,3 %; CT – 39,2 %; T/T – 6,5 %) je podobná frekvencím nalezeným u západoevropských populací. Varianta neovlivňuje kuřácký status (P = 0,65) ale TT homozygoti vykouřili signifikantně více (P < 0,01) cigaret v porovnání s nositeli alespoň jedné C alely (17,1 ± 10,5 vs. 13,7 ± 8,1).

Závěr: Studie ukazuje, že rs578776 varianta v oblasti genu pro CHRNA3 je faktorem ovlivňujícím počet vykouřených cigaret v české populaci.

Podpořeno projektem č. NT 12170-5 (IGA MZ ČR).

Inherited peroxisomal disorders

Konkoľová J., Petrovič R., Fischerová M., Chandoga J., Böhmer D.

Institut of Medical Biology, Genetics and Clinical Genetics, Comenius University Faculty of Medicine, University Hospital Bratislava, Slovakia

e-mail: konkolovajanka@gmail.com

Single-membrane surrounded organelles, the peroxisomes, are present in all eukaryotic cells. In humans, they are abundantly present in the cells of the liver, kidneys, adrenal cortex and myelin. Main function of peroxisomes is the breakdown of very long chain fatty acids through β-oxidation, synthesis of plasmalogens, which is the most abundant phospholipid in myelin, metabolisms of bile acids and also detoxification of peroxide – therefore these organelles were named peroxisomes.

Peroxisomes arise by division of pre-existing peroxisomes and also by de novo biogenesis from endoplasmatic reticulum. A set of approximately thirty proteins, known as peroxins or PEX proteins, have been identified as factors critical for correct peroxisomal biogenesis and maintenance of functional peroxisome. Because peroxisomes do not contain endogenous DNA, all peroxins involved in peroxisomal biogenesis must be encoded by nuclear PEX genes. Subsequently, all these proteins, that are required for assembly and function of peroxisomes, are synthesized on free polyribosomes in the cytosol before post-translational import into the peroxisome. Transportation of peroxisomal proteins into the peroxisomes is highly selective process and requires the presence of specific import sequences known as peroxisomal targeting sequences (PTS1 and PTS2). PTS1 is the C-terminal peroxisomal targeting sequence with consensus tripeptide sequence SKL and PTS2 is the N-terminal peroxisomal sequence with nonapeptide motif R-(L/V/I/ Q)-XXXXX-(H/Q)-(L/A). These PTSs sequences are recognized by different receptors, which direct peroxisomal proteins to the peroxisomal membrane. At present, it was described about twenty genetically determined peroxisome diseases. Depending on the extent of damaged metabolic functions, they are divided into diseases of generalized loss of peroxisomal functions (for example Zellweger syndrome) and deficiencies of individual peroxisome enzymes (most common X-Adrenoleukodystrophy). Most of disorders are autosomal recessive; however the commonest peroxisomal disorder X-linked adrenoleukodystrophy has an X-linked mode of inheritance. In first step, human patients are correctly classified in the group of disease by detection of their metabolites and subsequently by detection of biochemical abnormalities using molecular genetic techniques to identify the exact cause of the disease.

This work was supported by Ministry of Health of the Slovak Republic under the project Inherited peroxisomal disorders – development and translation of laboratory, clinical, diagnostic and therapeutic algorithms to practice.

Genodermatózy

Kopečková L.¹, Borská R.¹, Bučková H.², Nosková N.³, Němečková J.⁴, Gaillyová R.⁴, Veselý K.⁵, Fajkusová L.¹

¹Centrum molekulární biologie a genové terapie FN, Brno

²Kožní oddělení 1. pediatrické kliniky FN, Brno

³Masarykova univerzita, CEITEC, Brno

⁴Oddělení lékařské genetiky FN, Brno

⁵I. patologicko-anatomický ústav, Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně

e-mail: lenka.kopeckova@fnbrno.cz

Genodermatózy, geneticky podmíněná kožní onemocnění, jsou charakteristické velkou variabilitou a genetickou heterogenitou. Výzkum patologických mechanismů genodermatóz výrazně pokročil a vedl k identifikaci několika kauzálních genů. Naše pracoviště ve spolupráci s dětskou klinikou FN Brno a patologicko-anatomickým ústavem Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně zavedlo DNA diagnostiku onemocnění epidermolysis bullosa, incontinentia pigmenti a tří typů ichtyóz – ichtyózy vulgaris, lamelární ichtyózy a X-vázané recesivní ichtyózy.

Epidermolysis bullosa je skupina puchýřnatých dermatóz, které lze na základě histologických rovin štěpení, kde dochází k tvorbě puchýřů, rozdělit na několik skupin, které se liší kožními projevy a prognózou. U simplex formy analyzujeme mutace přítomné v genech pro keratin 5, keratin 14 a plektin. Dystrofická forma je způsobena mutacemi v genu pro kolagen VII.

Incontinentia pigmenti je neuroektodermální multisystémové onemocnění způsobené mutací NEMO genu. Onemocnění má dominantní dědičnost s vazbou na pohlaví.

Hlavním klinickým znakem ichtyóz je suchá a hrubá kůže, která se odlupuje v šupinách jako důsledek geneticky podmíněné poruchy keratinizace. Nejčastějším typem je ichtyóza vulgaris s autozomálně semidominantním typem dědičnosti a je podmíněna mutacemi v genu pro filaggrin (FLG). V současné době provádíme vyšetření dvou prevalentních mutací FLG genu popisovaných v evropské populaci (p. R501X a c.2282del4). X-vázaná recesivní ichtyóza je způsobena parciální nebo úplnou delecí genu pro steroidní sulfatázu (STS). U lamelární ichtyózy, jejíž dědičnost je autozomálně recesivní, sledujeme mutace genu pro transglutaminázu 1 (TGM1).

Výsledky molekulárně-genetického vyšetření genodermatóz prohlubují naše znalosti v dermatologii, umožňují prenatální diagnostiku, přispívají k efektivní terapii a poskytují informace pro genetické poradenství postižených rodin.

Frequency of Selected SNPs Influencing the Warfarin Pharmacogenetics in Control Group of 112 Individuals

Krajčíová Ľ.^1,2, Petrovič R.¹, Déžiová Ľ.¹, Chandoga J.¹, Turčáni P.²

¹Institute of Medical Biology, Genetics and Clinical Genetics, Comenius University Faculty of Medicine, University Hospital Bratislava, Slovakia

²Ist Department of Neurology, University Hospital Bratislava, Slovakia

e-mail:lubica1.krajciova@gmail.com

Warfarin represents the most commonly prescribed oral anticoagulant. Warfarin is an antagonist of Vitamin K, an essential factor of blood coagulation cascade. Warfarin has a narrow dose therapeutical scale. Insufficient dose can cause failure of antithrombotic effect. On the contrary, overdose increases a risk of bleeding. It is known, that variability in two genes has a significant effect on individual response to warfarin dose. The first gene – cytochrome P450 2C9 (CYP2C9) determines the activity of hepatic isoenzyme cytochrome P450 2C9, which has a crucial role in S-warfarin metabolism. The second gene – Vitamin K epoxide reductase complex subunit 1 (VKORC1), determines the activity of Vitamin K epoxide reductase, which produces an active form of Vitamin K. These polymorfisms (CYP2C9 and VKORC1) influence more than one third of warfarin dose effect. Pharmacogenetics of warfarin is affected less importantly by other polymorphisms CYP4F2 and CYP2C19 too. In a control group (112 randomly selected Individuals), the frequency of selected single nucleotide polymorphisms CYP2C9*2 (430C>T), CYP2C9*3 (1075A>C), VKORC1*2 (-1639G>A/1173C>T), VKORC1*3 (3730G>A) were tested by allele-specific Real-Time PCR. In the same control group, frequency of another selected polymorphisms, specifically CYP2C19*2 (G>A intron4/exon5), CYP4F2*3 (V433M), CYP2C19 IVS3 (-65G>A), were determined using PCR-RFLP.

In the current study, it was found out, that 25% of Slovak population need a standard dose of warfarin (5 mg of warfarin per day). Taking in account the combination of the most severe polymorphisms CYP2C9*2, CYP2C9*3, VKORC1*2, 44% individuals need 4 mg dose warfarin per day, 23% ~ 3 mg and 8% ~ 2 mg according generally therapeutic scheme.

The knowledge of patients genotype before therapy beginning may help to set up the treatment and thus to minimize possible side effect. Moreover, pharmacogenetic testing is recommended also by FDA (Food and Drug Association).

The research was supported by Grant UK, Nr. UK/279/2012.

Fumaráza jako tumor supresor: analýza souboru 44 pacientek s děložním leiomyomem

Kučerová Vidrová V.¹, Tesařová M.¹, Hansíková H.¹, Kubínová K.², Mára M.², Veselá K.³

¹Klinika dětského a dorostového lékařství 1. LF a VFN, Praha

²Gynekologicko-porodnická klinika 1. LF UK a VFN, Praha

³Ústav biologie a lékařské genetiky 1. LF UK a VFN, Praha

e-mail: vidrova@seznam.cz

Fumaráthydratáza (fumaráza) je klíčový enzym citrátového cyklu. Fumaráza je lokalizovaná jak v mitochondriální matrix, tak i v cytosolu a katalyzuje reverzibilní přeměnu fumarátu na malát. Enzym, který je funkční jako homotetramer, je kódovaný genem FH na chromozomu 1q42.3-43. Mutace v genu FH vedou k rozvoji závažné autozomálně-recesivní fumarové acidurie, která je charakteristická vysokými hladinami fumarátu vylučovanými v moči pacientů. V roce 2002 studie na rozsáhlém souboru pacientů s familiárním výskytem autozomálně-dominantní hereditární leiomyomatózy a karcinomu ledvin (HLRCC) ukázala, že FH má i roli tumor-supresorového genu.

Role fumarázy jako tumor-supresoru byla prokázána i u dalších syndromů (např. MCUL1-multiple cutaneous and uterine leiomyomatosis).

Cílem práce bylo v souboru 44 pacientek, u kterých došlo k rozvoji děložních leimyomů do 30 let, stanovit aktivitu fumarázy v lymfocytech a provést mutační analýzu genu FH ve vzorcích DNA izolovaných z krve. Aktivita fumarázy i její poměr na aktivitu kontrolního enzymu citrátsyntázy byla porovnána s kontrolním souborem (42 žen do 30 let bez výskytu děložních leiomyomů).

U 14 pacientek byla nalezena snížená aktivita fumarázy na 2–50 % kontrolních hodnot, u jedenácti z nich byl snížen i poměr aktivit fumarázy a citrátsyntázy (1–44 % kontrol). Pomocí sekvenování všech exonů a jejich přilehlých intronových oblastí genu FH byly nalezeny heterozygotní patogenní mutace u dvou ze 44 pacientek. Pacientka 14 byla nosičkou nové mutace c.892G>C, která vede k záměně p.Ala298Pro. U pacientky 16 byla nalezena mutace c.584T>C (p.Met195Thr). V dostupném zbytku fixovaného vzorku leiomyomu byla mutace c.584T>C přítomná v homozygotním stavu. Obě pacientky zdědily mutace v genu FH od svých matek, u kterých také došlo k rozvoji děložních leiomyomů okolo 30. roku života. U devíti pacientek se sníženou aktivitou fumarázy byly pomocí MLPA analýzy vyloučeny heterozygotní delece jednoho nebo více exonů genu FH. Dále bude provedena mutační analýza promotoru genu FH a analýza cDNA na přítomnost možných sestřihových mutací lokalizovaných v intronech genu.

Výsledky naší studie ukázaly, že analýza aktivity fumarázy v lymfocytech je vhodnou metodou pro zachycení přenašečů heterozygotních mutací v genu FH a měla by být zvážena i u pacientů s dalšími typy nádorových onemocnění, kde fumaráza funguje jako tumor-supresor.

Práce byla podpořena grantem IGA MZ ČR NT11186-5.

Hledání nových mutací v kandidátních genech potenciálně zodpovědných za teratospermii

Liška F.¹, Chylíková B.¹, Hrdlička I.¹, Veselá K.¹, Řežábek K.²,Křenová D.¹

¹Ústav biologie a lékařské genetiky 1. LF UK a VFN, Praha

²Centrum asistované reprodukce, Gynekologicko-porodnická klinika 1. LF UK a VFN, Praha

e-mail: frantisek.liska@lf1.cuni.cz

Rutinní molekulárně genetické vyšetření pacientů s jinak neobjasněnou nesyndromologickou neplodností dnes zahrnuje zejména stanovení mikrodelecí chromozomu Y (delece v oblasti AZF) a molekulární diagnostiku mutací v CFTR genu (způsobující obstruktivní azoospermii díky absenci vas deferens). Velký podíl mužské neplodnosti však zůstává etiopatogeneticky neobjasněn. Naproti tomu u modelových zvířat, zejména použitím cílené mutageneze (knock-outy) u myši, byla identifikována velká skupina genů, které jsou nezbytné pro plodnost samců, a jejichž mutace vyvolávají nesyndromologickou neplodnost i neplodnost kombinovanou s postižením dalších orgánů.

Vybrali jsme kandidátní geny, jejichž mutace u modelových organizmů interferují se spermiogenezí a vyvolávají teratospermii. Jde o geny CNTROB, HOOK1, HRB, RIMBP3, GOPC, CSNK2A2, SPATA16, CAPZA3. Pacienti s poruchou spermiogeneze (cílová skupina cca 200 osob) jsou vyšetřeni v Centru asistované reprodukce 1. LF UK a VFN a následně odesláni na genetickou konzultaci do ÚBLG, kde je získán jejich informovaný souhlas a odebrána krev na izolaci DNA a RNA. Kontrolní skupinu tvoří muži s prokázanou normospermií. Úseky vybraných genů jsou amplifikovány pomocí PCR nebo RT-PCR a podrobeny amplikonové sekvenaci „nové generace“ na přístroji GS Junior (Roche).

Dosud je do souboru zařazeno zhruba 70 pacientů a 70 kontrol. Zavedli jsme metodu sekvenace z genomové DNA a vyšetřili první pacienty. Kromě známých, klinicky bezvýznamných variant, jsme nalezli novou bodovou záměnu báze v intronu genu CNTROB. Není zatím jasné, zda tato varianta ovlivní expresi genu CNTROB.

Achondroplázia a molekulárno-genetická diagnostika

Lukáčková L., Jungová P., Petrušová M., Chandoga J.

ÚLBGKG LFUK a UNB; Katedra genetiky PrF UK, Bratislava, Slovakia

e-mail: lukackovalivia@gmail.com

Achondroplázia patrí medzi skeletálne dysplázie s autozómovo dominantným typom dedičnosti, úplnou penetranciou, vysokým výskytom de novo mutácii (80–90 %) a prevalenciou 1 : 10 000 až 1 : 30 000. Najčastejšou príčinou sú mutácie typu gain-of-function v 10-tom exóne génu FGFR3 (4p16, 19 exónov) kódujúcom receptor pre fibroblastový rastový faktor typu 3, s důležitou úlohou v metabolizme spojiva. Následkom je neprimeraná aktivácia receptora, potlačeni proliferácie chondrocytov – ovplyvnenie rastových platničiek a diferenciácie kostného tkaniva. Klinický obraz typický pri narodení zahŕňa disproporcionálny krátky vzrast (rizomelické skrátenie končatín), užší, dlhší hrudník, väčšiu hlavu s výrazným čelom a hypopláziou strednej faciálnej časti s charakteristickým röntgenologickým nálezom. Vyvíja sa výrazná lordóza, možné sú rôzne neurologické komplikácie a obštrukčné poruchy dýchania. Až u 99 % pacientov kaukazoidnej populácie je toto ochorenie spôsobené zámenou glycínu za arginín v pozícii 380 (G380R). Z toho 98% predstavuje tranzícia G→A a 1 % transverzia G→C v nukleotide 1138. Závažnejší fenotyp sa manifestuje pri náleze mutácie v homozygotnom stave.

V rámci laboratórneho prístupu pre stanovenie diagnózy analyzujeme sekvenciu DNA zodpovedajúcu 10-temu exónu génu FGFR3 pomocou dvoch molekulárno-genetických metód – PCR-RFLP a sekvenačnou analýzou. Vyšetrenie je možné v indikovaných prípadoch realizovať aj z plodovej vody, pričom stanovenie suspektnej diagnózy na základe abnormálnych ultrazvukových nálezov je možné až v treťom trimestri gravidity.

Detekcia mutácií génov GJB2 a GJB6 u pacientov s bilaterálnou senzorineurálnou poruchou sluchu

Mašindová I.¹, Varga L.^1,2, Hučková M.¹, Jovankovičová A.³,Balogová M.¹, Jakubíková J.³, Klimeš I.¹, Profant M.², Gašperíková D.¹

¹Laboratórium diabetu a porúch metabolizmu & Diabgene, Ústav experimentálnej endokrinológie, Slovenská akadémia vied, Bratislava, Slovakia

²I. Otorinolaryngologická klinika, Lekárska fakulta Univerzity Komenského, Bratislava, Slovakia

³Detská ORL klinika LF UK,, Bratislava, Slovakia

e-mail: ivica.masindova@gmail.com

Úvod: Prevalencia hluchoty sa odhaduje na 1 : 1000 živonarodených detí. Približne polovica prípadov vrodenej straty sluchu vzniká v dôsledku genetických zmien vo viac ako 100 nesyndrómových a 400 syndrómových lokusoch. Mutácie v géne GJB2 sú predominantnou príčinou nesyndrómovej senzorineurálnej poruchy sluchu (SNHL). Obrovské delécie v géne GJB6 môžu byť v závislosti od populácie prítomné zriedkavo alebo až u 50 % nositeľov GJB2 mutácií.

Cieľ: Cieľom našej práce bolo analyzovať gén GJB2 a GJB6 u jedincov so senzorineurálnou poruchou sluchu v rámci celého územia Slovenska.

Metódy: Pacienti nášho súboru pochádzali v rovnomernom počte z celého územia Slovenskej republiky. Do súboru boli vyberaní na základe prítomnosti bilaterálnej senzorineurálnej poruchy sluchu diagnostikovanej do veku 60 rokov. Kritéria spĺňalo 390 nepríbuzných jedincov, u ktorých bol sekvenovaný gén GJB2 (exóny 1 a 2). Navyše 149 pacientov bolo podrobených aj analýze delécií génov GJB2 a GJB6, metódou MLPA (SALSA MLPA KIT 163-C1).

Výsledky: V súbore 390 nepríbuzných jedincov bolo v géne GJB2 detegovaných 11 známych patogénnych mutácií v exóne 2 (c.35delG, c.71G>A, c.94C>T, c.101T>C c.109G>A, c.167delT, c.224G>A c.229T>A, c.313_326del14, c.250G>A, c.269T>A,),1 intrónová mutácia (c.1-3201G>A) a 6 polymorfizmov (c.79G>A, c.380G>A, c.457G>A, c.475G>A, c*3C>A, c*84T>C). U 33,1 % (129) jedincov boli identifikované mutácie obochaliel, v homozygotnej forme u 22,1 % alebo vo forme zložených heterozygotov u 11 % pacientov. Podiel jedincov bez nálezu patogénnej mutácie dosiahol 59,7 %. Najrozšírenejšími mutá-ciami génu GJB2 v našom súbore boli c.35delG a c.71G>A (60,8 % a 15,3 % zo všetkých patogénnych aliel). Veľká delécia v géne GJB6 (delD13S1830) bola detegovaná u jedného jedinca súčasne s GJB2 mutáciou c.35delG.

Záver: Analýza génov GJB2 a GJB6 u pacientov so senzorineurálnou poruchou sluchu priniesla prehľad jednotlivých mutácií v géne GJB2 na Slovensku a potvrdila genetickú príčinu straty sluchu u 33,1 % jedincov.

S podporou grantov APVV 0148-10, VEGA 1/0465/11 a TRANSMED 2 (ITMS:26240120030).

Mutation and polymorphisms in the PPOX gene in Jewish family with porphyria variegata

Medek K.¹, Mamet R.², Kučerová J.¹, Puchmajerová A.¹, Martásek P.¹, Schoenfeld N.²

¹First Medical Faculty of the Charles University, Prague, Czech Republic

²National Laboratory for the Biochemical Diagnoses of Porphyrias, Petah Tikva, Israel

e-mail:medekk@seznam.cz

Porphyria variegata (PV, OMIM 176200), a type of acute hepatic porphyrias, is characterized by a deficiency in the activity of the enzyme protoporphyrinogen oxidase (PPOX, E.C.1.3.3.4), the penultimate enzyme in the heme biosynthesis pathway. Affected individuals show increased cutaneous photosensitivity that may occur alone or in combination with acute neurovisceral symptoms such as abdominal pain, hypertension and hemiplegia. PV is inherited as an autosomal dominant disease with low penetrance, as not all individuals carrying a mutation in the PPOX gene develop clinical symptoms. The human PPOX gene is located on chromosome 1q22 and contains one non-coding and 12 coding exons. In heterozygote patients, PPOX activity is decreased by approximately 50% and symptoms do not usually appear before puberty. For diagnosis of PV, plasma fluorescence emission spectroscopy is a first-line test because a peak at 624–626 nm (excitation by 400 nm) establishes the diagnosis of PV. Abnormal fecal porphyrin profile characterized by increased fecal coproporphyrin and protoporphyrin IX, and reversal of the of copro III/I ratio are basal biochemical findings in PV.

In this study, sequencing analysis revealed mutation in new family of Jewish Maroccan origin within exon 10 in PPO gene (frameshift mutation, c1083delT), together with known polymorphisms in exon 1 (g.5044C>A; rs2301286) and in exon 9 (g.8558G>A; rs36013420; R304H). The PV diagnosis was previously determined by clinical symptomatology and biochemical analyses. The identified mutation is a single nucleotide deletion, previously described (Frank and Christiano, 1997). Genetic analysis of 4 family members revealed one silent carrier of causal mutation in the PPOX gene. The identification of the asymptomatic family member can help to reduce risk of onset PV by avoiding triggering factors.

Supported by grants from Charles University in Prague, Czech Republic PRVOUK P24/LF1/3 and UNCE 204011/12).

Frequencies of single nucleotide polymorphisms of SLCO1B1 gene in Slovak population

Mikulová M.^1,2, Chandoga J.²

¹Department of Genetics, Faculty of Nat. Sci. Comenius University in Bratislava, Slovakia

²Institute of Medical biology, Genetics and Clinical Genetics Comenius University Faculty of medicine, University Hospital Bratislava, Slovakia

e-mail: mjurkovicova@gmail.com

SLCO1B1 gene is located on the short arm of a chromosome 12 and consists of 15 exons. The product of this gene is a transmembrane protein OATP1B1, which is localized at the basolateral part of the hepatocytes. It mediates the uptake of diverse endogenous substrates, such as bile acids, bilirubin, conjugates of steroid hormones, and several drugs such as HMG-CoA reduktase inhibitors (statins), fexofenadine, rifampicin, lopinavir, bosetan and irinotecan. A lot of allelic variants of SLCO1B1 gene were identified in the past, some of which might be important in the metabolism of certain drugs and also can characterized a potential risk factor for the hyperbilirubinemia. Among the polymorphisms, that may cause modulation of the transport function OATP1B1 protein, there are two common variants of the 521T>C and 388A>G, which together form four reference haplotypes SLCO1B1*A (388A, 521T), SLCO1B1*1B (388G, 521T), SLCO1B1*5 (388A, 521C), SLCO1B1*15 (388G, 521C).

We have tested 80 healthy volunteers for the presence of polymorphisms 521T>C and 388A>G. Polymorphisms in the gene were analyzed by PCR-RFLP analysis (388A>G) and allele-specific Real-Time PCR analysis (521T>C). The genotype frequencies for polymorphism 388A>G was AA – 35.5%, AG – 48.7%, GG – 15.8%, for 521T>C was TT – 56.4%, TC – 39.7%, CC – 3.9%. In considering the high incidence of polymorphisms associated with a possible impact on the level of bilirubin and pharmacokinetics of certain drugs, it is appropriate to monitor these polymorphisms and search their significance on clinical status and therapeutic efficiency.

NGS in molecular diagnostics of epilepsies

Minichová L., Genčík M.

MedGene, Bratislava, Slovakia

e-mail: lucia.minichova@medgene.eu

The molecular genetic diagnosis of epilepsy particularly in children is essential for precise diagnosis, prognosis and has significant implications for the therapeutic strategy. Until now mutation screening was performed by DGGE, Sanger sequencing and MLPA technique.

Here we report on a new mutation screening protocol for Dravet syndrome & GEFS+ associated genes based on Next-Generation Sequencing (NGS) using the Roche 454J platform. Our current testing panel includes mutation analysis of genes SCN1A, SCN1B, GABRG2, GABRD and PCDH19.

So far, 22% of the patients suspected for Dravet syndrome/GEFS+ harboured a mutation in the SCN1A gene, one patient had a mutation in the GABRD gene. The spectrum of identified mutations included small deletions, insertions, indel mutations, truncating and missense mutations, mostly located in the pore and voltage sensitive region of the SCN1A protein. We have also detected a deletion of the whole SCN1A gene as well as a large duplication by MLPA. Interestingly, in two patients with a severe clinical manifestation a homozygous and two compound heterozygous mutations were identified, respectively.

Genetic diagnostics based on the NGS platform enables the analysis of multiple disease-related genes in parallel, to reduce TAT and the cost of the test as well and therefore outperforms the conventional Sanger sequencing.

Thiopurin S-methyltransferáza (TPMT) – interpretace komplexního vyšetření farmakofenotypu/genotypu pro terapii thiopuriny

Mrkvicová M.^1,2, Demlová R.^2,3, Mikušková A.⁴, Pilátová K.¹,Štěrba J.⁴, Zdražilová Dubská L.^1,2,Valík D.¹

¹Oddělení laboratorní medicíny, Masarykův onkologický ústav, Brno

²Farmakologický ústav LF MU, Brno

³Regionální centrum aplikované molekulární onkologie (RECAMO), Oddělení klinických hodnocení, Masarykův onkologický ústav, Brno

⁴Klinika dětské onkologie FN a LF MU, Brno

e-mail: martina.mrkvicova@mou.cz

Thiopurin S-methyltransferáza (TPMT) je cytoplasmatický enzym katalyzující S-methylaci aromatických a heterocyklických sulfhydrylových komponent thiopurinových léčiv včetně 6-thioguaninu, 6-merkaptopurinu a azathioprinu. Tato léčiva se používají v medicíně jako protinádorová léčiva a imunosupresiva při terapii autoimunitních onemocnění, hematoonkologických onemocnění u dětí, idiopatických střevních zánětů a při transplantacích.

Z thiopurinových léčiv vznikají vlastní účinné thioguaninové metabolity, které se jako falešné báze inkorporují do nukleových kyselin a inhibují tak jejich transkripci. Dalším mechanismem cytotoxického a imunosupresivního účinku je inhibice de novo syntézy purinových nukleotidů zprostředkovaná dalším účinným metabolitem methylthio-inosinmonofosfátem, vytvářeným alternativní metabolickou cestou. Dostatečná aktivita TPMT zabraňuje při odbourávání thiopurinových léčiv hromadění thioguaninových nukleotidů a vzniku vedlejších nežádoucích účinků jako jsou neurotoxicita, hepatotoxicita, myelosuprese, záněty sliznic atd.

Snížená metabolická aktivita enzymu TPMT je důsledkem funkčních polymorfizmů v kódující oblasti genu TPMT, z nichž mezi nejčastější variantní alely v indoevropské populaci patří TPMT*2 (g.238G>C; p.Ala80Pro), TPMT*3A (g.460G>A a g.719A>G; p.Ala154Thr a p.Tyr240Cys), TPMT*3C (g.719A>G; p.Tyr240Cys) a méně častá TPMT*3B (g.460G>A; p.Ala154Thr).

U běžné populace neléčené thiopuriny se polymorfismus TPMT neprojevuje. Klinické projevy deficitu TPMT mohou být závažné pro thiopuriny léčené heterozygoty a homozygoty pro funkčně variantní alely, a genetické polymorfismy tak značnou měrou mohou pacienta predisponovat pro účinnost a úspěšnost léčby. Vyšetření TPMT patří mezi doporučovanou součást farmakogenetického algoritmu pro individualizaci dávek léčiva před podáním thiopurinových léčiv, zvláště u dětských onkologických pacientů při léčbě ALL. Komplexní farmakogenetický protokol vyšetření pacienta před terapií thiopuriny zahrnuje vyšetření farmakofenotypu TPMT i stanovení polymorfismů v genu pro TPMT.

Polymorfismus genu TPMT byl stanoven s využitím metody real-time PCR. V námi vyšetřeném souboru 193 pacientů byly zastoupeny následující genotypy TPMT*1/*1 (wildtype) (87 %; 167 jedinců), TPMT*3A/*1, resp. TPMT*3B/*3C, (13 %;19 jedinců), TPMT*2/*1 (2 %; čtyři jedinci), TPMT*3C/*1 (0,5 %; jeden jedinec) a TPMT*2/*3A (0,5%; jeden jedinec), genotyp TPMT*3B/*1 nebyl v našem souboru zachycen. Aktivita enzymu TPMT byla u pacientů sledována v erytrocytech pomocí kinetické HPLC. U vyšetřených pacientů byly zjištěny jak individuální rozdíly v aktivitě TPMT, tak významné rozdíly v závislosti na stanoveném genotypu TPMT. Převážná většina jedinců nesoucí variantní alelu vykazovala sníženou aktivitu enzymu. V případě pěti pacientů nesoucích nemutovaný genotyp byla stanovena velmi vysoká aktivita enzymu TPMT, kdy nám možnost současného studia farmakofenotypu navíc poskytuje ojedinělou možnost studovat klinickou relevanci superaktivitních variant, o jejichž farmakologickém, resp. patofyziologickém významu není v současnosti mnoho známo.

Vzhledem ke skutečnosti, že nerovnoměrné rozložení aktivity TPMT v populaci způsobuje rozdíly v účinnosti léčby, je stanovení aktivity TPMT a příslušného genotypu před začátkem léčby dobrým nástrojem pro určení vhodného dávkování léčiva. Postup stanovení polymorfismů v genu TPMT a famakofenotypu byl úspěšně zaveden na OLM MOÚ jako diagnostický test (http://www.mou.cz/file.html?id=979), přičemž genotypizace TPMT byla akreditována ČIA, o.p.s. dle kritérií ČSN EN ISO15189. Nespornou výhodou námi zoptimalizovaného a zavedeného testu je nestandardně malý objem vstupního biologického materiálu (2,6 ml periferní krve) pro obě složky vyšetření představující sníženou zátěž pro pediatrického pacienta. Komplexní farmakogenetické vyšetření TPMT s individuální interpretací výsledku bylo provedeno u 172 dětských pacientů s ALL a dle našeho názoru poskytuje ojedinělé korelativní informace o genotypu a farmakofenotypu pro konkrétního vyšetřovaného jedince.

Práce byla podpořena z OP VaVpI financovaným Evropským fondem pro regionální rozvoj a státním rozpočtem České republiky pro RECAMO (CZ.1.05/2.1.00/03.0101) a projektem BBMRI_CZ (LM2010004).

Molekulární diagnostika svalových kanalopatií – analýza genů CLCN₁, SCN₄A a CACNA₁S

Páclová D., Stehlíková K., Zídková J., Fajkusová L.

Centrum molekulární biologie a genové terapie FN Brno, IHOK

e-mail: daniela.paclova@fnbrno.cz

Kanalopatie kosterní svaloviny jsou skupinou heterogenních onemocnění spojených s poruchou funkce iontových kanálů. Klinicky se projevují svalovou ztuhlostí, zvanou také myotonie, nebo svalovou slabostí vedoucí až k periodické paralýze. Svalové kanalopatie jsou spojovány s poruchou chloridových, sodíkových, případně vápníkových kanálů kosterní svaloviny (gen CLCN1, SCN4A, resp. CACNA1S).

Nejčastější formou myotonie je kongenitální myotonie způsobená mutacemi v genu CLCN1. Mutace v tomto genu jsou spojované s Thomsenovou kongenitální myotonií (autozomálně dominantní typ) a s Beckerovou kongenitální myotonií (autozomálně recesivní typ). Mutace nacházející se genu SCN4A mají dědičnost autozomálně dominantní a jsou spojené s onemocněními paramyotonia congenita, myotonie provokované draslíkem, hyperkalemická a hypokalemická periodická paralýza. Mutace v genu CACNA1S jsou autozomálně dominantní a způsobují hypokalemickou periodickou paralýzu.

Z důvodu možného prolínání klinických obrazů jednotlivých typů myotonie a periodické paralýzy právě molekulárně-genetická analýza výše zmíněných genů umožňuje stanovení konečné diagnózy. Molekulární diagnostika svalových kanalopatií je založena na přímé sekvenční analýze kódující oblasti genů CLCN1, SCN4A a vybraných exonů genu CACNA1S.

V souboru 92 probandů s projevy myotonie jsme u 42 z nich detekovali mutaci v genu CLCN1 (38 probandů s recesivní formou a čtyři s dominantní) a u 17 probandů byla nalezena mutace v genu SCN4A. V genu CLCN1 jsme nalezli celkem 28 různých mutací, z nichž 13 je dosud nepopsaných. V genu SCN4A jsme detekovali pět různých mutací spojených s fenotypem myotonie, z nichž jedna mutace je nepopsaná. U čtyř probandů s klinickou diagnózou hypokalemická periodická paralýza jsme provedli analýzu vybraných exonů genu SCN4A a CACNA1S. U tří pacientů jsme detekovali mutaci v genu SCN4A a jeden pacient nesl popsanou mutaci v genu CACNA1S. V genu SCN4A jsme detekovali dvě různé mutace spojené s fenotypem hypokalemické periodické paralýzy, z nichž jedna mutace je dosud nepopsaná.

Pharmacogenetic approach to the selection of chemotherapy using 5-fluorouracil and thiopurine D

Petrovič R., Unterländerová D., Krajčíová Ľ., Chandoga J.,Böhmer D., Pastoráková A.

Institute of Medical biology, Genetics and Clinical Genetics Faculty of Medicine Comenius University

e-mail: robkop@post.sk

Gene polymorphism analysis of enzymes involved in metabolism and detoxication of chemotherapy is very important information for prediction of fatal reaction to chemotherapy in case of intoxication of patient. Genotyping of patients is crucial factor for evaluation of effectiveness of the therapy.

Mercaptopurine belongs to the family of thiopurine antimetabolites and is used for the treatment of childhood acute lymphoblastic leukaemia (ALL). Its derivate, azathioprine, is being metabolized similarly, and is administered for immunosuppression to transplant recipients and patients with severe autoimmune diseases. Inside the human body both drugs can be inactivated by thiopurine methyltransferase (TPMT). Approximately 10% of population possess intermediate level of mercaptopurine methylation, and about 0.3% subjects are totally deficient for this enzyme. The reason of 90% cases of reduced or absent TPMT activity are 4 single nucleotides polymorphisms (SNPs- TPMT*3A, TPMT*3C, TPMT*2, TPMT*4). TPMT genotyping analysis is recommended prior prescription of mercaptopurine, azathioprine and thioguanine, in order to avoid life-threatening therapy of TPMT-deficient patients. These patients can be treated but drug-dose adjustment is required – usually 10–15 times lower comparing to normal individuals. We analysed more than 1000 of alleles (control group – Slovak population) and we detect that about 4% of Slovak population is endangered with severe hematopoietic toxicity after standard dosage of thiopurine drugs. We have also identified a patient with homozygous mutation (TPMT*3A/3A) with severe life- threating hematopoietic toxicity.

5-fluorouracil (5-FU) is a fluoropyrimidine drug and is the most frequently used chemotherapeutic drug in the treatment of colorectal cancer and other solid tumors. Pharmacogenetic variation may contribute to risk of toxicity and/or altered therapeutic benefit.

DPYD mutations have been identified in patients with severe 5-FU toxicity. The most common and clinically significant variant *2A (IVS+14G>A) is associated with reduced enzymatic function. In Slovak population we found frequency 0.27% of this variant (3 alleles out of 1120).

Prediction of tumour sensitivity to 5-FU therapy can be predicted by analysis TYMS gene. Mutations in this gene result in reduced expression of thymidylate synthase (TS) and may be associated with higher clinical responsiveness to 5-FU therapy and increased risk of toxicity. TS overexpression leads to worse prediction and failure of chemotherapy. Variation of 28-bp repeat in 5´untranslated region of TS gene is the best studied polymorphism of TS. Most people have either 2 or 3 tandem repeats (TSER*2 and TSER*3). The TSER*3 allele is associated with higher expression of TS gene and higher resistance, indeed. In addition, some people carry the 6-bp deletion in the 3´- untranslated region of TS gene, which is connected with reduced TS expression, thus leading to better therapy prognosis.

Through the PCR, fragmentation analysis and RFLP we have found out the representation of the single genotypes in Slovak population: frequency of TSER*2 allele = 41% and TSER*3 = 59%; 3UTR region deletion allele = 37%, allele without deletion 63%.

This work was supported by grant of Ministry of health: 2007/39--FNSPBA-04.

Strategie molekulárně genetického vyšetření pacientů s hereditárním angioedémem

Ravčuková B.¹, Grodecká L.¹, Kazdová L.¹, Kuklínek P.², Litzman J.^2,3, Freiberger T.^1,2,3

¹Genetická laboratoř Centra kardiovaskulární a transplantační chirurgie, Brno

²Ústav klinické imunologie a alergologie LF MU a Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně

³CEITEC MU, Brno

e-mail: barrav@cktch.cz

Hereditární angioedém (HAE) je autozomálně dominantně dědičné onemocnění (1 : 10 000 – 50 000), charakterizované kvantitativním nebo kvalitativním deficitem C1 inhibitoru (C1INH). Většina pacientů s HAE (85 %) je řazena k typu I (transkripčně, translačně nebo sekretoricky deficientní pacienti, se sníženou hladinou C1INH v séru (5–30 %)). Zbylých 15 % pacientů je řazeno k typu II (dysfunkční C1INH,s redukovanou aktivitou, ale kvantitativně normální, klinicky s opakujícími se epizodami podkožních otoků, otoků laryngu nebo trávicího traktu). Projevy jsou variabilní mezi jedinci a nezávisí na typu mutace.

Gen SERPING1 na 11. chromozomu je tvořen 8 exony kódujícími plazmatický protein C1INH o 478 aminokyselinách. Lokus pro C1INH obsahuje Alu repetice, které vedou ke genovým přestavbám až v 20 % případů typu I. Pacienti s typem II jsou často nositeli bodové mutace v reaktivním centru molekuly C1INH nebo jejím okolí (oblast exonu 8).

K identifikaci mutací v genu SERPING1 přistupujeme na základě klinického obrazu pacienta a imunologických laboratorních výsledků. Při vyšetřování DNA pacientů s HAE typu II začínáme analýzou exonu 8. Pokud není mutace detekována a v případech pacientů s HAE typu I využíváme denaturační gradientové gelové elektroforézy (DGGE) k mutačnímu screeningu všech exonových oblastí. Následuje vyšetření na přítomnost velkých delecí či duplikací jednoho nebo více exonů pomocí semikvantitativní multiplexové PCR a následnou detekcí pomocí fragmentační analýzy. Kombinací těchto metod jsme schopni zachytit asi 90 % mutací. V případech negativního výsledku jsou tyto metody následně doplněny přímou sekvenací celého genu. V rodinách s pozitivním záchytem mutace můžeme nabídnout prenatální diagnostiku.

Zavedení molekulární diagnostiky glykogenózy typu III, zajímavý případ uniparentální disomie

Šilerová P.¹, Pavloušková J.¹, Taslerová R.¹, Plevová K.¹, Honzík T.², Fajkusová L.¹

¹Centrum molekulární biologie a genové terapie, IHOK FN, Brno

²Ústav dědičných metabolických poruch VFN a 1. LF UK, Praha

e-mail: pavla.silerova@fnbrno.cz

Glykogenóza typu III (GSD III, OMIM #232400) je autozomálně recesivně dědičné onemocnění způsobené mutacemi v genu AGL, který kóduje enzym účastnící se degradace glykogenu (enzym odvětvující glykogen). Incidence onemocnění se odhaduje na 1 : 83 000. V některých populacích (např. Faerské ostrovy) je incidence GSD III vyšší, a to z důvodu efektu zakladatele. Klinické projevy GSD III zahrnují jaterní poruchy a postižení srdeční a kosterní svaloviny. Většina pacientů má jaterní i svalové symptomy onemocnění (GSD IIIa). Asi 15 % pacientů má pouze symptomy postižení jater a je klasifikována jako GSD IIIb. Dvě další podskupiny (IIIc a IIId) se odlišují selektivní ztrátou jedné ze dvou aktivit odvětvujícího enzymu a jsou velmi vzácné.

Gen pro odvětvující enzym je lokalizován do oblasti 1.p21.2 a má 35 exonů, z toho 33 je kódujících. Dodnes bylo ve spojitosti s GSD III popsáno v genu AGL nejméně 147 sekvenčních variant. Pouze pro GSD IIIb, kde převažují mutace ve 3. exonu genu AGL, existuje korelace genotyp-fenotyp. U ostatních mutací nebyla doposud nalezena korelace mezi typem mutace a závažností choroby.

Molekulární diagnostika GSD III je založena na sekvenační analýze genu AGL. DNA analýzu genu AGL jsme provedli u 13 probandů, z toho jsme u čtyř probandů diagnózu potvrdili (30,8 %; dva homozygoti a dva složení heterozygoti). U jednoho probanda byla nalezena pouze jedna kauzální mutace v heterozygotním stavu. Celkem bylo nalezeno sedm různých mutací, z nichž v pěti případech se jedná o v literatuře dosud nepopsané mutace. Následné vyšetření rodičů probanda s genotypem c.4260-12A>G/c.4260-12A>G odhalilo přenašečství mutace pouze u jednoho z rodičů. Veškerá polymorfní místa byla u probanda v homozygotní podobě. Domnívali jsme se proto, že se jedná buď o rozsáhlejší deleci, nebo o případ uniparentální disomie. Další vyšetření probanda za využití cytogenetického čipu odhalilo na celém chromozomu jednu ztrátu heterozygotnosti beze změny v počtu kopií, tedy v důsledku paternální uniparentální disomie (UPD). Jedná se o celosvětově první popsaný případ GSD III, jehož příčinou je vytvoření homozygotního stavu mutace v důsledku UPD.

Genotypizace RHD genu z volné fetální DNA

Štolba P., Masopust J.

Transfuzní oddělení, Krajská zdravotní a.s. – Masarykova nemocnice v Ústí nad Labem, o.z.

e-mail: petr.stolba@mnul.cz

Úvod: Pro detekci a kvantifikaci volné plazmatické fetální DNA (cfDNA) se v současnosti nejčastěji používá metoda Real-Time PCR. Ověření přítomnosti fetální DNA se testuje pohlavním markerem SRY a několika dalšími markery, jako Serpin B5 nebo RASSF1A geny, které se liší svou metylací u fetu a jedince po narození. Fetální cfDNA umožňuje provádět neinvazivní vyšetření mutací paternálního původu a také detekci krevních skupin, obvykle RhD.

Metody: K analýzám byla použita metoda Real-Time PCR se značenými sondami FAM/HEX – TAMRA. K detekci přítomnosti fetální DNA sloužil gen RASSF1A a pro kontrolu též SRY gen (Hromadníková et al. 2010). Pro vlastní detekci RHD genu jsme použili systém exonů 5 a 7 (Grootker et al. 2006), na rozdíl od ostatních prací v České republice. Volná DNA v plazmě byla analyzována celkem v 70 vzorcích v různých stadiích těhotenství v širokém rozmezí 12.–37. týden. Všechny vzorky byly odebrány mezi lety 2009–2011, a proto v době vyšetření cfDNA již byla známa krevní skupina a pohlaví.

Výsledky: Všech 70 vzorků bylo úspěšně vyšetřeno na přítomnost fetální cfDNA a podařilo se nám spolehlivě určit pohlaví od 12. týdne gravidity. Po srovnání Ct obou exonů RHD genu ze vzorků RhD pozitivních plodů a RhD pozitivních dospělých kontrol se podařilo určit hraniční Ct, při kterém máme jednoznačný záchyt dospělého jedince s RHD pozitivním genotypem, a to do Ct 33. U vyšších Ct se vždy jednoznačně jedná o průkazný záchyt cfDNA plodu; hodnoty Ct obvykle 35–37.

Závěr: Ověřili jsme, že je v podmínkách naší laboratoře možné testovat pohlaví plodu a krevní skupinu RhD již od 12. týdne gravidity. Výhodou testování kombinace exonů 5 a 7 RHD genu je možnost záchytu RHDψ i RHCDE přestavby, obě mutace se v České republice zatím vyskytují pouze v minoritním zastoupení, ale jejich přítomnost v české populaci bude díky migraci narůstat.

Pilotní studie – srovnání vybraných izolačních metod mikroRNA ze séra

Tavandzis S., Krhutová V., Roszková B.

Laboratoř molekulární biologie, P&R LAB a.s.

e-mail: spiros.tavandzis@pr-lab.cz

Úvod: MikroRNA (miRNA) jsou krátké jednovláknové řetězce nekódující RNA, které se podílejí na regulaci genové exprese až u 30 % lidských genů. Mezi geny regulované miRNA patří především geny odpovědné za buněčnou proliferaci, diferenciaci, apoptózu a angiogenezi, ale i za celou řadu dalších biologických procesů. Nedávné studie ukázaly, že miRNA mohou plnit funkci nádorových supresorů a onkogenů, a mají tedy vliv na vznik a vývoj nádorového onemocnění.

Cíl: Výběr nejvhodnější metodiky pro izolaci miRNA ze séra, která může být využita při studiu regulace genové exprese.

Metody: Do pilotní studie byly zahrnuty čtyři kontrolní vzorky a jeden pacient. Vzorky srážlivé krve byly po odběru centrifugovány 10 minut/4000 ot. při pokojové teplotě. Poté byly připraveny alikvoty, ze kterých byla provedena izolace miRNA a zbylá séra byla zamražena při –80oC pro validaci výsledků. K izolaci miRNA byly vybrány tři různé izolační kity – NucleoSpin miRNA Plasma (MACHEREY-NAGEL), mirVana™ miRNA Isolation Kit (Ambion) a Plasma/Serum Exosome RNA Isolation Kit (Norgen Biotek). Přítomnost miRNA byla kontrolována na přístroji Agilent 2100 Bioanalyzer pomocí komerční sady Agilent Small RNA Kit. Po izolaci byly miRNA přepsány specifickou reverzní transkripcí pomocí TaqMan^® MicroRNA Reverse Transcription Kitu (Ambion). Získanou cDNA jsme amplifikovali pomocí TaqMan^® MicroRNA Assay na přístroji LightCycler 480 Real-Time PCR (Roche), kde jsme sledovali možné rozdíly v detekci exprese čtyř miRNA (miR195, miR155, miR296, miR328) izolovaných výše zmíněnými komerčně dodávanými kity.

Výsledky a závěr: První výsledky ukazují výrazné rozdíly v úspěšnosti izolace miRNA vybranými typy souprav. Pro konečný výběr metody jsme rozšířili kontrolní skupinu vzorků a také jsme se zaměřili na faktory ovlivňující preanalytickou fázi izolace. Sledování úrovně exprese miRNA izolované ze séra/plasmy může být dalším prostředkem neinvazivních diagnostických vyšetření nádorových onemocnění. Použití molekulárních markerů při monitorování průběhu nemoci by mohlo přesněji odrážet aktuální biologický stav pacienta a jeho odpověď na léčbu.

Syndrom fragilního chromozomu X – 10 let zkušeností s diagnostikou ve FN Brno

Tichý L.¹, Stehlíková K.¹, Vrzalová Z.¹, Fajkusová L.²

¹Centrum molekulární biologie a genové terapie, Interní hematologická a onkologická klinika FN, Brno

²Central European Institute of Technology, Brno

e-mail: ltichy@fnbrno.cz

Syndrom fragilního chromozomu X je nejčastější příčinou dědičných mentálních retardací s frekvencí výskytu1 : 4000 u mužů a 1 : 8000 u žen. Z molekulárního hlediska je syndrom fragilního chromozomu X charakterizován expanzí trinukleotidových repetic CGG v 5’ nepřekládané oblasti FMR1 genu. Od roku 2002 je molekulárně biologická diagnostika tohoto onemocnění prováděna také v laboratořích Centra molekulární biologie a genové terapie IHOK.

Za uplynulých 10 let bylo na našem pracovišti analyzováno více než 2600 pacientů z více než 2200 nezávislých rodin. Tento rozsáhlý soubor analyzovaných vzorků nám umožnil statisticky zpracovat řadu parametrů týkajících se například rozložení počtu repetitivních trinukleotidů CGG v 5’ nepřekládané oblasti FMR1 genu v české populaci, závislosti pravděpodobnosti expanze premutovaných alel na počtu repetic a v neposlední řadě i korelace mezi genotypem a fenotypovými projevy u nosičů expandovaných alel.

Molecular genetic testing in patients with Non-Small Cell Lung Carcinoma

Urbanovská I.^1,2, Konvalinka D.¹, Žebráková I.¹, Žmolíková J.^1,2,Uvírová M.^1,2, Dvořáčková J.²

¹CGB laboratoř a.s.,

²LF Ostravské univerzity

e-mail: irena.urbanovska@pathology.cz

Introduction: Non-Small Cell Lung Carcinoma (NSCLC) is one of the most serious cancers. For targeted biological treatment, sensitive and specific identification of genetic changes is necessary. Identification of genetic changes (mutations) within EGFR, KRAS and ALK oncogenes, associated with NSCLC, allows choosing the patients, which benefit from therapy with tyrosin-kinase inhibitors (TKIs).

Methods: DNA is isolated from biopsy and cytology specimens with verified histological diagnosis. Mutation detection is performed by real-time PCR, fragment analysis, primer-extension analysis and mutant-enriched PCR. Wt-EGFR patients (e.g. with no mutation detected) are tested for ALK gene rearrangement, causing the EML4-ALK fusion gene formation. Analyses are performed on histological slides using the FISH method.

Results: Since 10/2010 till 9/2012, 326 DNA samples were successfully analyzed. Out of these, 22 patients (6.75%) were found to be positive for activating mutations within EGFR gene. One patient was found to carry resistant mutation (insertion in exon 20). Since 07/2011 till 9/2012, 132 patients were successfully tested for ALK gene rearrangement. This change has been proven in 9 cases (6.8%).

Discussion: Activating mutations of the EGFR gene correlate with therapeutic response to tyrosin kinase inhibitors. Frequency of mutations within the EGFR gene is 5–20%. ALK gene rearrangement can predict therapeutic response for ALK inhibitors. These rearrangements are found approximately in 5% of NSCLC patients. Our results correlate with abovementioned findings. Occurrence of certain mutations, e.g. T790M or insertion in exon 20, as well as KRAS gene mutations and ALK gene rearrangements predicts resistance to TKIs therapy.

Conclusions: Determination of tumor mutational status can provide powerful tool for setting up strategy and therapeutic protocols in NSCLC patients.

Syndrom Li-Fraumeni - molekulárně genetická analýza genu TP53 v MOU Brno

Vašíčková P., Macháčková E., Házová J., Sťahlová Hrabincová E., Navrátilová M., Foretová L.

Oddělení epidemiologie a genetiky nádorů - laboratoř, Masarykův onkologický ústav, Brno

e-mail: vasickova@mou.cz

Protein p53 je kódován nádorově supresorovým genem TP53 lokalizovaným na krátkém raménku chromozomu 17 (17p13.1). Jedná se o multifunkční protein, který se v návaznosti na stresové faktory (např. poškození DNA, zánět) účastní klíčových procesů jako jsou regulace buněčného cyklu, opravy DNA, apoptóza či senescence. Somatické mutace v tomto genu jsou detekovány až u 50% lidských nádorů, zárodečné mutace genu TP53 jsou pak nejčastější příčinou Li-Fraumeni syndromu. Jedná se o vzácný autozomálně dominantní syndrom dědičné predispozice k nádorům, kdy 50 % jedinců onemocní nádorem do 40 let věku a 90 % pak do 60 let věku. Nejčastějšími malignitami jsou sarkomy měkkých tkání a kostí, časný karcinom prsu, mozkové nádory, nádory kůry nadledvinek, leukémie a lymfomy.

V případě lidských nádorových onemocnění patří k nejvíce frekventovaným změnám v genu TP53 missense mutace v DNA vazebné doméně, které naruší schopnost proteinu vázat DNA a následně transaktivovat expresi cílových genů. Nalezené sekvenční změny, somatické i zárodečné, jsou evidovány v IARC databázi (International Agency for Research on Cancer).

Laboratoř Oddělení epidemiologie a genetiky nádorů Masarykova onkologického ústavu v Brně provádí molekulárně genetické vyšetření Li-Fraumeni syndromu od roku 2009. Vyšetření musí být indikováno klinickým genetikem po provedení genetického poradenství a podepsání informovaného souhlasu. Molekulárně genetická analýza genu TP53 zahrnuje jednak přímé sekvenování jeho kompletní kódující sekvence a míst sestřihu, jednak vyšetření velkých intragenových přestaveb metodou MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification).

Ve skupině dosud vyšetřených 114 pacientů bylo nalezeno šest různých patogenních mutací, které lze označit za příčinu dědičné predispozice ke vzniku nádorového onemocnění: Li-Fraumeni syndromu. Ve čtyřech případech se jednalo o missense substituce ve vysoce konzervované oblasti p53 proteinu – DNA vazebné doméně (dva záchyty v exonu 7, po jednom záchytu v exonech 4 a 8), v jednom případě pak o mutaci v donorovém místě sestřihu exonu 4 a v jednom případě o velkou deleci celé kódující oblasti genu. V jedné z pozitivních rodin se klinicky jednalo o výskyt pouze nádorů prsu v časném věku. Testování TP53 mutace je vhodné i u pacientek s nádorem prsu diagnostikovaným ve věku pod 30 let, kde nebyla zachycena mutace v genu BRCA1/2. Příbuzným v rizikových rodinách je možné po předchozí genetické konzultaci nabídnout prediktivní testování familiární mutace a následná preventivní opatření. Vzhledem k možnostem komplexní preventivní péče včetně celotělové MR by bylo možné nabídnout prediktivní testování i před 18 rokem věku (Klin Onkol (Suppl) 2009, 22: S20–S22, 2012; 25: S49–54 ).

Práce byla podpořena Evropským fondem pro regionální rozvoj a státním rozpočtem České republiky (OP VaVpI – RECAMO, CZ.1.05/2.1.00/03.0101).

An Expanded Multiplex for New Global Standards

Vokurkova Chocova M., Sprecher C., Oostdik K., Ensenberger M., Bourdeau-Heller J., Lenz K., Storts D.

Promega Corp., WI, USA

e-mail: martina.vokurkova@promega.com

As DNA databases continue to grow and international cooperation increases, the need for a common set of markers is required to facilitate data sharing and to reduce adventitious matches. Promega’s PowerPlex^® Fusion System provides all of the materials needed for co-amplification and five-color fluorescent detection of 24 loci (23 STR loci and Amelogenin), including the CODIS core loci and the European Standard Set (ESS) loci. The PowerPlex^® Fusion System will enable increased discriminatory power and data sharing possibilities by means of the incorporation of common and informative loci used throughout the world. In addition, the PowerPlex^® Vision System builds upon recent advances in Promega STR chemistries, including improved inhibitor resistance, faster cycling time, and direct amplification from a variety of common sample types, resulting in more meaningful analyses for both casework and databasing efforts.

Can myoadenylate deaminase deficiency cause severe metabolic disorder?

Vrbová S., Jungová P., Kramarová V., Petrovič R., Mattošová S., Lisyová J., Chandoga J.

Institute of Medical Biology, Genetics and Clinical Genetics, Comenius University Medical School, University Hospital, Bratislava, Slovakia

e-mail: salix@hotmail.sk

Enzyme activities of myoadenylate deaminase are multiple times higher in skeletal muscles than in other tissues. Myoadenylate deaminase with adenylosuccinate synthetase and adenylosuccinate lyase catalyze reactions of purine nucleotide cycle. Putative function of myoadenylate deaminase is to shift equilibrium of myoadenylate kinase reaction towards to production of ATP by removing of AMP. T in position 34, exon 2. As a result of premature stop codon, less than 2% of enzymatic activity remains in cells. In Caucasian population frequency of mutant allele is 10–14%, and frequency of homozygotes is 2%. Primary myoadenylate deaminase deficiency is probably the most common inherited metabolic alteration of skeletal muscle in Caucasian population. In this population, in most cases of genetically claused myoadenylate deaminase deficiency is caused by transition C.

There are two grups of individuals with primary myoadenylate deaminase deficiency: 1. asymptomatic individuals, 2. individuals with difficulties evoked by exercise such as cramps, muscle pain and weakness, fast muscle fatigue. Some of affected individuals have post-exercise myoglobinuria and approximately half of them have elevation of creatine kinase. Ischemic test doesn´t demonstrate elevation of venous ammonia.

Methode PCR-RFPL is used in our departement for dia-gnostic purpose of this disorder. By PCR amplified 197 bp long fragment is cleaved by HpyCH4IV to two fragments of length of 87bp and 110bp. If mutation C34T is present, restriction site is destroyed and fragment with length of 197bp is detected.

During last 6 years, in our department, molecular-genetic detection of C34T mutation of AMPD1 gene was performed in 206 probands. Out of all probands, there were 149 (72.4%) without mutation, 46 (22.3%) heterozygotes and 11 (5.3%) mutant homozygotes.

Rettův syndrom a jeho varianty – klinické a genetické aspekty

Záhoráková D.¹, Baxová A.², Puchmajerová A.¹, Martásek P.¹

¹Klinika dětského a dorostového lékařství 1. LF UK a VFN, Praha

²Ústav biologie a lékařské genetiky 1. LF UK a VFN, Praha

e-mail: Daniela.Zahorakova@lvfn.cz

Rettův syndrom je vážná porucha psychomotorického vývoje a postihuje téměř výlučně dívky. Primární genetickou příčinou Rettova syndromu jsou de novo mutace v X-vázaném MECP2 genu, jehož produktem je důležitý regulátor transkripce a chromatinového remodelingu, metyl-CpG- vazebný protein 2 (MeCP2). Kromě klasické formy Rettova syndromu existuje několik atypických variant se závažnějším nebo mírnějším průběhem. Na jejich vzniku se podílejí nejen mutace v MECP2 genu, ale i v dalších genech (CDKL5 a FOXG1) a pravděpodobně i jiné genetické faktory.

Prezentujeme klinické příznaky a aktuální diagnostická kritéria klasické formy Rettova syndromu a jeho atypických variant a shrneme naše výsledky mutačních analýz odpovědných genů.

Metody: Mutační analýza genů MECP2, CDKL5 a FOXG1 (jednotlivé geny nebo jejich kombinace) byla dosud provedena u 397 pacientů (384 dívek a 13 chlapců) z České republiky a u 68 pacientů (63 dívek a 5 chlapců) ze zahraničí s podezřením na Rettův syndrom. Analýza MECP2 genu byla provedena DNA sekvenováním, analýzou křivek tání s vysokým rozlišením (HRM) a metodou MLPA. CDKL5 gen byl analyzován DNA sekvenováním a metodou MLPA, FOXG1 gen byl vyšetřen DNA sekvenováním.

Výsledky: Patognomické mutace v genu MECP2 byly potvrzeny u 87 pacientek (60 z České republiky, 27 ze zahraničí). U jedné pacientky, u které byla původní diagnóza suspektního Rettova syndromu změněna na suspektní Lennox Gastautův syndrom, byla detekována mutace v genu CDKL5. Mutace v genu FOXG1 zatím u vyšetřených pacientů nebyla detekována.

Závěr: Mutace v MECP2 genu jsou asociovány především s fenotypem Rettova syndromu i když s nízkou frekvencí jsou detekovány také u jiných, tzv. MECP2 onemocnění. V případě atypických variant Rettova syndromu, kdy pacientka nesplňuje všechna diagnostická kritéria, je doporučeno zvážit také mutační analýzu některého z dalších odpovědných genů, CDKL5 resp. FOXG1.

Práce byla podpořena granty UNCE 204011/12, Prvouk P24/LF1/3 a NT 13120-4/2012.

Androgen receptor mutations and their molecular diagnostics

Zelinková H., Lexová-Kolejáková K., Petrovič R., Chandoga J., Böhmer D.

Ústav lekárskej biológie, genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB, Bratislava, Slovakia

e-mail: hana.zelinkova@gmail.com

Androgen receptor (AR) is a phosphoprotein of the nuclear receptor family and is primarily responsible for the mediation of the physiological actions of androgens. AR bound to androgen serves as a transcription factor in the regulation of genes that are involved in the regulation of various physiological processes, particularly male sexual differentiation and maturation, and maintenance of spermatogenesis. AR protein is encoded by AR gene, which is located on X chromosome and therefore the manifestation of genetic pathology is almost exclusively in males.

When compared to other members of nuclear receptor family, defects in AR are quite common and they cause wide spectrum of phenotypic abnormalities during male sexual development. Defective AR is directly involved in three basic pathological situations. These are neurological disorders, such as Kennedy disease (spinal and bulbar muscular atrophy), then androgen insensitivity and also prostate cancer. More than 600 mutations have been identified in AR gene so far, most of which are associated with androgen insensitivity and they are primarily substitutions in the ligand-binding domain of AR. Most of them can be detected only by the complete AR gene sequencing. In case of neurodegenerative Kennedy disease, length analysis of the region comprising CAG repeats in the first exon of the gene is sufficient. Currently, we focus mainly on Kennedy disease diagnostics in patients with definite suspicion of the disease. Disorder is confirmed by fragmentation analysis. Another part of our study was to establish the method of sequencing this gene on the basis of optimized conditions for PCR amplification of exons 2–8 of AR gene. This methodical approach allows diagnostics of androgen insensitivity syndromes and prostate cancer.

VÝTAHY PŘEDNÁŠEK “8TH GOLDEN HELIX PHARMACOGENOMICS DAY“

ITFoM Future of Medicine, Pharmacogenomics and Public Health Genomics

Angela Brand

Autorka přednesla jednu z nejzajímavějších přednášek tohoto “DNE” a jako ředitelka European Centre for Public Health Genomics (ECPHG), pochopitelně zdůraznila nejen nezbytnost procesu individualizace zdravotní péče (from the Human Genome Project to the Personal Genome Project), ale i používání hlediska populačního. Public Health Genomics (PHG), obor zabývající se významem genomiky použité v rámci péče o veřejné zdraví, je odpovědný za účinné přenášení poznatků získaných analýzou genomu a s tím souvisejícími technologiemi do obecné politiky a do zdravotních služeb ku prospěchu zdravotního stavu celé populace. Ve své přednášce načrtla cestu po které by se tyto snahy měly ubírat např. bychom měli: 1. začít vnímat běžné komplexní choroby jako mnohočlené vzácné choroby, 2. změnit přístup od nemocí k “diseasomes”, 3. postoupit od rizikových faktorů k rizikovým vzorcům (risk pattern), 4. a od klinické užitečnosti přejít k užitečnosti pro danou konkrétní osobu (personal utility). Jednou z oblastí, která má na náš pokrok neobvykle velký vliv jsou rychle se zmnožující informace, které bychom měli využít přesunem zájmu od statistických údajů o rizicích platných pro skupiny osob k charakteristikám jednotlivých osob s vytvářením virtuálních osobních modelů zdravotního stavu s čímž souvisí uplatnění informačních a komunikačnch technologií (ICT) s heslem: ”ICT for health & health for ICT” ITFoM (www.itfom.eu).

Next-Generation Sequencing and microarray applications in pharmacogenomics

Florian Graedler

Zástupce evropské sekce firmy Illumina, která je množstvím vyrobených strojů pro novou (druhou) generaci sekvenátorů patrně první na světě, předvedl aplikační možnosti, kterými výrobky této firmy disponují. Zabýval se rozvojem genomiky v posledním desetiletí a ukázal jak se používání sekvenátorů a čipových analyzátorů transkripce liší podle sledovaného cíle. Stroje s největším výkonem např. typ HiSeq 2500, založený na principu sekvenace syntézou, je používán zvláště pro základní výzkum, který se věnuje celogenomovému sekvenování, kdežto stroje typu MiSeq s menším výkonem se s výhodou používají pro medicínské aplikace, a předvedl některé ze systémů k tomu určených (TrueSight). Ty jsou vhodné pro sledování stavu vybraných lokalit v genomu a jsou vybrány podle potřeb některých oborů, např. onkologie. Při použití stroje MiSeq lze testovat 212 amplikonů současně v jedné zkumavce (TruSight Cancer, 48 genů). Podobně ve spolupráci s jinými společnostmi sestavila Illumina na základě exomového testování výzkumné testy zaměřené na autism, kardiomyopathie a test zaměřený na závažné, v dětském věku se rozvíjející, dědičné choroby. Samostatnou soupravou je Cystic Fibrosis Diagnostic Assay, která dokáže detekovat všechny známé mutace i varianty CFTR genu a Cystic Fibrosis Carrier Screening Assay zaměřená na diagnostiku nosičství patogenně významných alel. Firma Illumina se zaměřuje ve svých klinických aplikacích pomocí sekvenování nové generace i na choroby komplexní, mitochondriální, ale i podložené epigenetickými změnami genomu.

Impact of Pharmacogenomics In Europe

George P. Patrinos

Ve své přednášce nejdříve připomněl starořecké myslitele Homera, který v Odysei v uvedl, že drogy mohou být současně jak léčivé tak jedovaté, a Hipokrata s jeho názorem, že je důležitější poznat jaká osoba určitou chorobou trpí, než jakou chorobou trpí. Tak naznačil, že otázkám příčin nemoci, poznání nemocného a vhodného léčení se lidé zabývali „odjakživa“. Hlavně se věnoval aktivitám uskutečňovaným pod hlavičkou PGENI, což je nezisková instituce jejímž cílem je, mimo jiné, podpořit zavzetí genetických informací do procesu zdravotnického rozhodování o veřejném zdraví. Za tím účelem sbírá výsledky ze spolupracujících států (104 států reprezentujících cca 78 % světového obyvatelstva) tak, aby byla schopna vytvořit lékařská doporučení s celosvětovým dosahem z hlediska priorit platící pro jednotlivé země v rámci farmakogenomicky významných informací.

http://www.pharmgkb.org/

http://www.pharmgkb.org/search/browseVip.action?browseKey=vipGenes

Pharmacogenomics in colorectal and brestcancers

Kateřina Kubáčková

Připomněla dokumenty řešící otázky léků pro pacienty trpící vzácnými chorobami:

• Regulation (EC) No 141/2000 of the European Parliament and of the Council on Orphan Medicinal Products of 16 December 1999,
• Commission Regulation (EC) No 847/2000 of 27 April 2000,
• Directive 95/46/EC of the European Parliament and of the Council of 24 October 1995 on the protection of individuals with regard to the processing of personal data on the free movement of such data. (Data Protection Directive),

a zásadu, že pacientům trpícím „vzácnými chorobami“ by měla být věnována péče stejné kvality jako ostatním pacientům. Tzv „Orphan drugs“ – léky pro vzácné choroby mají tu nevýhodu, že nesplňuji požadavek farmaceutických firem, které vyžadují návratnost svých investic. Za vzácné choroby jsou považovány takové, které splňují tři kritéria a podle nichž se posuzuje zařazení léků pro vzácné choroby, je to jednak jejich prevalence (≤ 5/10 000), pak závažnost onemocnění, ale i možnost dosažení dostatečného benefitu. Touto problematikou se zabývá Committee for Orphan Medicinal Products – COMP, která je poradním orgánem EU komise a zajišťuje mezinárodní spolupráci. Zajišťuje spolupráci s dalšími organizacemi jako např. HTA (Health Technology Assessment): http://czechhta.cz/. Účinkem „orphan drugs“ se v Evropě zabývá European Union Committee of Experts on Rare Diseases (EUCERD) www.eucerd.eu, organizace Orphanet: s internetovým portálem www.orpha.net a agentura (EMA) www.ema.europa.eu.

Stav farmakogenomiky v ČR

Ondřej Slanař

První domácí publikace, kterou můžeme zařadit do této oblasti, se v Československu zřejmě objevila již v roce 1978. Ve svém příspěvku se zmínil o European Medicines Agency (EMA), při které v roce 2005 vznikla Pracovní skupina pro Farmakogenetiku. V České republice, která se zvláště po roce 2008 téměř svou publikační aktivitou v této oblasti (vzhledem k počtu obyvatel) vyrovnala Německu, platí doporučení pro farmakogenetické testování genotypů TPMT, CYP2D6, CYP2C19, CYP3A5, CYP2C9, VKORC1, HLA-B*5701 a OATP1B1. Americký federální úřad (FDA) podobně jako EMA klasifikuje léky používané u různých chorob podle významu testování genetických markerů pro jejich používání. Zatím však se do příbalových letáků pro léky dostávají spíše informace o nezbytnosti ujistit se o správné funkci jater a ledvin, avšak uvedení nezbytné informace o potřebě testování genetických markerů se prosazují mnohem obtížněji.

Pharmacogenomics in colorectal & breast cancers

Pavel Souček

Zásadní problémy nádorových procesů vyjádřil ve schématu, v němž jsou propojeny klíčové problémy.

Rovněž se zmínil o dalších genech spojovaných s otázkou prognózy vývoje nádorového onemocnění prsu ABCC1 (MRP1) a ABCC8. Jejich produkty patří mezi „transportery“ a snížená transkripce je z hlediska úspěchu léčby, např. antracycliny výhodnější.

Ilustraci genového ovlivnění účinku léků přinášejí obrázky 1 a 2. Křivky A až D znázorňují rozdíl v účinku vyvolaný geny rozhodujícími o vstřebávání, distribuci, metabolismu a vylučování podaných léků.

Upozornil rovněž na vývoj rezistence na základě selekce nádorových buněk s genovou výbavou zajišťující jim odolnost proti použitému léku. Vzhledem k vysoké mutabilitě je pravděpodobnost existence takových buněk poměrně vysoká.

Uvedl příklady dalších, dnes již farmakogeneticky významných genů např rodiny CYP, genu pro glukuronosyltransferázu UGT1A1 (www.invaderchemistry.com). Problematikou vztahu genové výbavy k účinku léků se zabývá pracovní skupina AGAPP (Evaluation of Genomic Applications in Practice and Prevention – www.egappreviews.org). Práce skupiny je zatím komplikována omezeným množství použitelných údajů, jak na úrovni stanovení genotypů, klinických dat, počtu sledovaných osob a mezipopulačních rozdílů.

State-of-the-art pharmacogenomics in Slovenia

Vita Dolžan

Podobně jako u nás je i v dalších zemích Evropské unie věnována farmakogenomice stále se zvyšující pozornost a to nejen vzhledem k zásadnímu významu pro pacienty léčené farmaky, která mohou, jsou-li podávána nevhodně, být neúčinnými anebo sama způsobit závažné obtíže, případně i smrt. V přednášce byla uvedena přehledná tabulka některých genů a jejich vlivu na léčiva, jimž je ve Slovinsku věnována zvláštní pozornost.

SEKCE MEZILABORATORNÍ KONTROLY KVALITY

Metodické pokyny pro akreditaci poskytovatelů schemat EQA/PT

Radim Brdička

Politika ČIA pro účast v národních a mezinárodních aktivitách v oblasti zkoušení způsobilosti MPA 30 - 03 - 12 http://www.cai.cz/files/02_03-MPA%2030-03-12%20

V zájmu sjednocení kritérií posuzování a způsobu hodnocení mezilaboratorního porovnávání byla vypracována doporučení, která by měla být organizátory dodržována i pokud nebudou pro tuto činnost akreditováni. K lepší orientaci v příslušných dokumentech pomůže následující seznam:

1. ILAC P 9:11/2010 Politika ILAC pro účast v aktivitách zkoušení způsobilosti.
2. EA-4/18:2010 Návod pro určení úrovně a četnosti ve zkoušení způsobilosti.
3. ISO/IEC 17043:2010 Zavedena v ČSN EN ISO/IEC 17043:2010 Posuzování shody – Všeobecné požadavky na zkoušení způsobilosti.
4. ISO/IEC 17025:2005 Zavedena v ČSN EN ISO/IEC 17025:2005 Posuzování shody – Všeobecné požadavky na způsobilost zkušebních a kalibračních laboratoří.
5. ISO 15189:2007 Zavedena v ČSN EN ISO 15189:2007 Zdravotnické laboratoře – Zvláštní požadavky na kvalitu a způsobilost.
6. ISO/IEC 17020:2004 Zavedena v ČSN EN ISO/IEC 17020:2005 Posuzování shody – Všeobecná kritéria pro činnost různých typů orgánů provádějících inspekci.
7. IAF/ILAC A4:2004 Směrnice pro aplikaci normy ISO/IEC 17020.
8. Kvalimetrie 17 Mezilaboratorní porovnávání a zkoušení způsobilosti. Pomůcka k zajišťování kvality v chemických, biochemických a klinických laboratořích, Eurachem 2011.

Nabídka poskytovatelů zkoušení způsobilosti a testování kvality i v oboru, jakým je genetické testování neustále stoupá: např. Eurogentest : Pro molekulární genetiku http://www.eurogentest.org/web/info/unit1/molecular.xhmtl

Pro biochemickou diagnostiku

http://www.eurogentest.org/web/info/unit1/biochemical.xhtml

Pro cytogenetické vyšetřování

http://www.eurogentest.org/web/info/unit1/cytogenetics.xhtml

Další nabídky najdeme u European Molecular Genetics Quality Network (EMQN)

www.emqn.org/emqn/Schemes

Diagnostic Mutation Database

http://www.ngrl.org.uk/Manchester/page/dmudb-statistics

Domácí pak na stránkách SLG. Pravidelní účastníci jsou obvykle informováni poskytovateli přímo, noví zájemci o poskytování těchto služeb jsou vítáni.