Stanovení DNA HPV v lymfatických uzlinách u časných stadií karcinomu děložního hrdla

Souhrn

Cíl studie:
Podat přehled současných znalostí o významu detekce DNA HPV ve spádových lymfatických uzlinách u pacientek s karcinomem děložního hrdla.

Typ studie:
Literární přehled.

Název a sídlo pracoviště:
Gynekologicko – porodnická klinika 1. LF UK a VFN, Praha.

Výsledky:
Metastatické postižení lymfatických uzlin je nejdůležitější prognostický faktor u časných stadií karcinomu děložního hrdla. Přesto až u 20 % radikálně operovaných žen s histopatologicky negativními uzlinami dojde k recidivě onemocnění. Stanovení DNA HPV v lymfatických uzlinách by mohlo představovat marker jejich okultního postižení. Publikovaná data jsou však limitována zejména nejednotnou metodikou. Jen 3 práce byly prospektivní, využívající čerstvou či zmraženou tkáň, v ostatních případech byla DNA získávána retrospektivně z parafínových bločků. Byl popsán souhlas mezi incidencí DNA HPV a metastatickým postižením pánevních uzlin. Průkaz DNA HPV v histopatologicky negativních uzlinách byl v některých studiích spojen s vyšším rizikem recidivy onemocnění. Ačkoliv byla přítomnost DNA HPV 18 na malých souborech popsána jako prognosticky nepříznivý faktor, význam jednotlivých genotypů HPV pro prognózu zůstává stále nejasný.

Závěr:
Stanovení DNA HR HPV ve spádových lymfatických uzlinách by mohlo být dalším prognostickým faktorem u časných stádií karcinomu děložního hrdla. Naopak skupina pacientek s histopatologickou i DNA HR HPV negativitou lymfatických uzlin by mohla představovat kohortu s výjimečně dobrou prognózou.

Klíčová slova:
HPV, lymfatické uzliny, karcinom děložního hrdla, prognostické faktory.

ÚVOD

Karcinom děložního hrdla je celosvětově druhým nejčastějším zhoubným nádorem u žen. V České republice je jeho incidence neměnná od 70. let minulého století. Jen o něco více než polovina případů je zjištěna v časném stadiu, které považujeme za operabilní. Nejvýznamnějším prognostickým faktorem časných stadií onemocnění je metastatické postižení spádových lymfatických uzlin, které snižuje 5leté přežití o 25 – 60 % [9, 10]. Proto je součástí standardního postupu při radikálním operačním výkonu provedení systematické pánevní lymfadenektomie, obvykle doplněné o biopsii a peroperační zhodnocení sentinelových uzlin. Přítomnost metastastatického postižení získaných lymfatických uzlin je nejdůležitějším kritériem pro indikaci adjuvantní léčby.

I při histopatologické negativitě preparátů získaných lymfatických uzlin však dojde ve 12,1 – 19,6 % případů k recidivě onemocnění, lokalizované až v 60 % v pánvi [7, 8]. V této souvislosti byla studována řada markerů, které by mohly korelovat s biologickým chováním nádoru, s rizikem „okultního“ metastatického postižení lymfatických uzlin a s rizikem relapsu onemocnění. Mezi studovanými byly například transformující růstový faktor beta, inhibitor aktivátoru plazminogenu 1, vaskulární endoteliální růstový faktor C, matrixové metaloproteinázy 2 a 9, cyklooxygenáza 2, syndekan 1 a tumorové markery (SCC, cyfra 21, CA 125, CA 19-9). Žádný však nesplnil očekávání a nebyl uveden do běžné klinické praxe.

Prokázaným etiologickým agens karcinomu děložního hrdla je perzistentní infekce vysoce rizikovými genotypy lidských papilomavirů (HR HPV) [3, 4, 8, 9]. Vzhledem k této kauzální souvislosti je jednou z perspektivních metod detekce možného subklinického metastatického postižení pánevních uzlin stanovení přítomnosti DNA HR HPV. V literatuře byl již význam stanovení DNA HPV ve spádovém lymfatickém řečišti diskutován jako faktor ovlivňující prognózu onemocnění. Cílem této práce je podat přehled současných znalostí. 

PRŮKAZ HPV V LYMFATICKÝCH UZLINÁCH

Prevalence HR HPV ve spádovém lymfatickém řečišti je v literatuře uváděna v širokém rozmezí 25 až 80 % [2, 8]. Omezená literární data neprokázala častější nález DNA HPV v závislosti na stadiu onemocnění nebo dalších rizikových faktorech. Největší prospektivní studie, která zjistila velmi častou přítomnost HPV v pánevních LN (69,8 %), zahrnovala více než 17 % pacientek s nemocí ve stadiu IIB a u více než 60 % byly metastaticky postiženy pánevní uzliny [9]. V jiné recentní studii, ve které převažovala časná stadia (IB1 = 50,9 %), mělo dokonce 80 % pacientek (45 z 55) HPV v lymfatických uzlinách, metastázy v pánevních uzlinách však byly nalezeny pouze u 19 % [8]. Naopak překvapivě malý výskyt HPV ve 25,4 % (15 z 59) popsal Coutant, který vyšetřoval pouze sentinelové uzliny (SLN) v souboru s častým zastoupením stadia II (37,3 %) [2].

Dosud není jasné, zda je relativně častá přítomnost HPV v negativních uzlinách skutečně markerem jejich okultního postižení, které není dosud možné histopatologicky ani imunohistochemicky detekovat. Je velmi pravděpodobné, že se v některých studiích jedná o chybu metodiky, dalším možným vysvětlením je imigrace imunitních buněk s HPV částicemi, případně důsledek lymfogenního rozsevu volných HPV partikulí [10].

Některé publikace prokázaly úzkou korelaci mezi metastatickým postižením uzlin a jejich HPV pozitivitou [1, 5]. Hernádi vyšetřoval 39 pacientek s pozitivitou HPV 16 v primárním nádoru. Ve 100 % případů prokázal DNA HPV 16 v metastaticky postižených lymfatických uzlinách, naproti tomu v nepostižených uzlinách detekoval DNA HPV 16 jen ve 35,7 % (p = 0,001). U pacientek s HPV pozitivitou lymfatických uzlin zjistil častěji recidivu onemocnění než u pacientek s HPV negativními uzlinami (42,9 % vs. 11,1 %, p = 0,0009) [5]. V jiné práci autoři zaznamenali v jednom případě metastatické postižení pánevních lymfatických uzlin při současné negativitě SLN. Vyšetření přítomnosti HPV v tomto případě prokázalo DNA HR HPV nejen v metastaticky postižené pánevní uzlině, ale i v SLN bez metastázy. Doplnění biopsie sentinelových uzlin o HPV test mělo při kombinaci obou vyšetření 100 % pozitivní prediktivní význam pro metastatické postižení spádových lymfatických uzlin [8].

Některé studie souhlas mezi nálezem DNA HPV a metastatickým postižením spádových LN nepotvrdily [3, 4, 6]. Jejich metodika však byla většinou nepřesná. Příkladem může být práce Baaye, který ve svém souboru analyzoval u všech pacientek vždy jen 1 uzlinu z každé obturatorní fosy, ačkoliv podle studií mapování sentinelových lymfatických uzlin, je jejich nejčastější lokalizací oblast externích ilických cév [4].

Velmi malá pozornost byla dosud věnována korelacím genotypů nalezených v nádoru a v lymfatických uzlinách. Füle hodnotil zvlášť spinocelulární karcinomy a adenokarcinomy. U obou skupin vyšetřoval nejčastější HR genotypy HPV 16, 18 a 33. Shodu v genotypu mezi nádorem a lymfatickou uzlinou nalezl častěji u HPV 16 (52 % a 72 %), ve srovnání s HPV 33 (29 % a 23 %) [4]. Lee, který vyšetřoval 22 genotypů, prokázal rovněž nejvyšší shodu u HPV 16 (78,7 %) a o něco nižší u HPV 18 (60 %) [8]. O významu shody mezi genotypy pro prognózu onemocnění dosud není v literatuře žádná informace.

METODIKA STUDIÍ

Jednou ze zásadních odlišností publikovaných dat je způsob získávání a zpracování materiálu k vyhodnocení. Pouze 3 publikace pracovaly se soubory prospektivně [2, 8, 9, 10], ostatní autoři využívali více či méně selektovaných kohort z různě dlouhého retrospektivního období. Metodika detekce je založena na extrakci a amplifikaci virové DNA z části tkáně. Amplifikována a následně identifikována je oblast onkogenů E6, E7 a/nebo hlavního kapsidového genu L1.

V retrospektivních souborech jsou k vyšetření využívány parafínové bločky. Parafín je odstraněn promytím v xylenu a 96% etanolu, ale k izolaci DNA je použit vždy jen omezený počet plátků (obvykle 2 – 5) z jednotlivých tkáňových řezů. Senzitivita a reprodukovatelnost těchto výsledků však dosud nebyla prospektivně ověřena. Podle Lukaszuka je vyšší citlivosti dosaženo při vyšetření z nativních nebo čerstvě zmražených tkání než při vyšetření prováděném z parafínových bločků [9].

Technika odběru materiálu k molekulárně genetické analýze v prospektivních studiích byla dosud popsána pouze v jedné práci [9]. Lukazsuk z každého odebraného a zmrazeného vzorku tkáně oddělil část o velikosti 25,0 mg Ī 5,5 mg a ponechal ji přes noc při stabilní teplotě 50 °C inkubovat s proteinázou K. Extrahovaná DNA byla posléze detekována pomocí PCR. Všechna vyšetření počínaje izolací DNA prováděl vždy opakovaně v odstupu minimálně dvou týdnů a za pozitivní považoval teprve souhlasné závěry. Zamezení iatrogenní kontaminace je ve všech případech nezbytnou součástí manipulace s materiálem.

Kromě převažujícího využívání parafínových bločků mají publikované práce i další limitace. Problémem metodiky prospektivních studií je vysoká náročnost na dodržení všech součástí protokolu (izolace, amplifikace a detekce DNA HPV), zvláště při nutnosti opakovaného potvrzení pozitivity testované tkáně [9, 10], a v některých protokolech ztráta podstatné části vyšetřovaného materiálu [8]. Lee identifikované SLN půlil, jednu polovinu analyzoval na přítomnost DNA HPV, druhá polovina byla určena k histopatologickému vyšetření. Důsledkem byla ztráta poloviny materiálu buď k histopatologickému vyšetření, nebo k PCR [8]. Další pravděpodobná příčina odlišných výsledků v literatuře je absence standardizovaného protokolu molekulárně genetického vyšetření HPV v LN [11].

Pouze Lee a Coutant ve svých pracích zohlednili rozdělení spádových uzlin na SLN a ostatní lymfatické uzliny, všechny další publikace hovoří souhrnně o pánevních uzlinách. Stratifikace na SLN a ostatní pánevní uzliny významně zvyšuje validitu vyšetření, neboť peroperační odběr k DNA analýze je jinak možný pouze z makroskopicky patrných uzlin [2, 8]. Vynechání biopsie SLN znamená absenci důležité informace o možném mikrometastatickém postižení na základě výsledků ultramikrostagingového a imunohistochemického vyšetření, které je standardní součástí protokolu vyšetření SLN. Zároveň tak chybí i možnost korelovat nález s výsledkem HPV DNA analýzy.

VÝZNAM PRO PROGNÓZU

Nejednotné jsou závěry o významu přítomnosti DNA HR HPV v LN pro prognózu onemocnění. Přehled publikovaných dat shrnuje tabulka 1. V největší prospektivní studii představovala skupina pacientek s HPV v lymfatických uzlinách kohortu s významně horší prognózou [9, 10]. Soubor 116 radikálně operovaných pacientek byl rozdělen na 3 skupiny: pacientky s metastatickým postižením uzlin, pacientky bez metastatického postižení, ale s DNA HPV pozitivními uzlinami a pacientky bez metastatického postižení a bez přítomnosti DNA HPV v lymfatických uzlinách. Celkové přežití ve skupině s histopatologickou i HPV negativitou vykazovalo oproti ostatním skupinám statisticky lepší výsledky (p < 0,001). Relativní riziko mortality stanovené pro přítomnost DNA HPV ve spádových LN dosahovalo 2,31, samostatná přítomnost metastatického postižení LN však pouze 1,23.

Obdobné výsledky prezentovaly i největší retrospektivní soubory [7, 11]. Data od 236 pacientek s primárním nádorem HPV 16 a/nebo 18 pozitivním byla analyzována po období 4letého sledování po radikální operaci. U 10 pacientek s histopatologicky negativními uzlinami byla zjištěna za 5 – 42 měsíců recidiva onemocnění, u všech kromě 1 byla zároveň prokázána přítomnost DNA HPV v lymfatických uzlinách. Korelace mezi průkazem HPV ve spádovém lymfatickém řečišti a rizikem recidivy byla statisticky významná (p = 0,0004) [7].

Naopak v dalším souboru 150 pacientek s průměrným follow-up v délce 48 měsíců nebyla prokázána souvislost mezi HPV v lymfatických uzlinách a celkovým přežitím [4]. Autor však uvádí, že u 16 % případů HPV pozitivních uzlin nebyl prokázán HPV v primárním tumoru a že 35 % metastaticky postižených uzlin bylo HPV negativních. Hodnocení bylo navíc limitováno počtem 6 lymfatických uzlin získaných od každé pacientky. Je pravděpodobné, že tyto diskrepance jsou důsledkem nízké citlivosti PCR techniky prováděné z parafínových bločků, ale i omezeného počtu vyšetřených uzlin.

Na malém souboru byl prezentován význam přítomnosti genotypu HPV 18 v histopatologicky negativních lymfatických uzlinách. Autoři poukazovali na HPV 18 pozitivitu jako na významný rizikový faktor nejen pro časnou recidivu onemocnění, ale i pro její rychlou progresi s krátkým intervalem přežití [12]. Podobná data přinesl i Coutant v případě HPV 18 pozitivity v SLN [2]. Vysvětlení pro horší prognózu spojenou s HPV 18 pozitivitou je stále nejasné, ačkoliv byly popsány některé molekulární změny, včetně vysoké frekvence integračních příhod a zvýšené fosforylace E7. Diskutuje se i vyšší invazivita HPV 18 pozitivních nádorů s rychlejší progresí do lymfatických uzlin ve srovnání se stejně velikými non - HPV 18 nádory [8, 12].

ZÁVĚR

Stanovení DNA HR HPV ve spádových lymfatických uzlinách by mohlo být dalším významným prognostickým faktorem zejména u časných stadií karcinomu děložního hrdla s histologicky a imunohistochemicky negativními uzlinami. Naopak ženy se současnou histologickou negativitou a negativitou DNA HPV ve spádovém lymfatickém řečišti by mohly představovat skupinu s výjimečně dobrou prognózou. K vyhodnocení významu HPV pozitivity případně i nálezu konkrétních genotypů HPV pro prognózu je nutný nejen delší follow up radikálně operovaných žen, ale i standardizace metodiky vyšetření z nativních či čerstvě zmražených tkání. 

MUDr. Jiří Sláma

Gynekologicko-porodnická klinika VFN a 1. LF UK

Apolinářská 18

128 51 Praha 2

slamajiri@centrum.cz