Semikvantitatívna analýza expresie mRNA aromatázy v eutopickom endometriu ako diagnostický marker endometriózy a estrogéndependentných ochorení

Souhrn

Cieľ štúdie:
Zistiť klinickú využiteľnosť semikvantitatívnej analýzy expresie mRNA aromatázy v eutopickom endometriu pri diagnostike endometriózy.

Typ štúdie:
Prospektívna klinická štúdia.

Názov a sídlo pracoviska:
Gynekologicko-pôrodnícka klinika JLF UK a MFN, Martin.

Metodika:
Do štúdie autori zaradili ženy, ktoré za sledované obdobie podstúpili laparoskopiu alebo laparotomiu z indikácie pelvických bolestí, sterility alebo nesuspektných tumorov malej panvy. Podľa peroperačného a histologického nálezu analyzovali výskyt endometriózy, myómov a hyperplázie endometria a korelovali s expresiou mRNA aromatázy v eutopickom endometriu.

Výsledky:
Do štúdie bolo zaradených 23 žien. Na základe peroperačného nálezu a/alebo histologických výsledkov bola endometrióza diagnostikovaná v 12 prípadoch. Zvyšných 11 žien tvorilo kontrolnú skupinu. Na základe semikvantitatívnej analýzy za hraničnú „cut-off“ hladinu bola považovaná aspoň slabá expresia mRNA aromatázy. Vyšetrenie podľa uvedených kritérií malo senzitivitu 75 % a špecificitu 54,5 %. Pri zohľadnení výskytu myomatózy a hyperplázie endometria bol základný súbor rozdelený na 18 žien s prejavmi uvedených ochorení a kontrolnú skupinu tvorilo 5 zdravých žien. Senzitivita na uvedené ochorenia v súbore bola 72,2% a 80% špecificita.

Záver:
Expresia mRNA aromatázy je dobrým markerom pri diagnostike endometriózy.

Kľúčové slová:
endometrióza, adenomyóza, aromatáza

Úvod 

Najčastejšou príčinou panvovej bolesti u žien vo fertilnom veku je endometrióza. Okrem bolestivých symptómov, ktoré nie sú špecifické, ochorenie sa spája aj s výskytom sterility, infertility. Často vyvoláva poruchu funkcie, ale aj anatomických pomerov postihnutých panvových orgánov, vzácne aj vzdialenejších napr. pľúc pri extrapelvickej lokalizácii. Ochorenie sa považuje za benigné, avšak svojim často agresívnym rastovým vzorom, rezistenciou na konvenčné liečebné metódy a častou recidívou nadobúda charakter malígneho ochorenia. Presné údaje o výskyte ochorenia nie sú známe. Predpokladá sa, že postihuje asi 10 % žien v uvedenom vekovom období [12, 13].

Existujú rôzne - navzájom kompatibilné teórie, podporené výsledkami experimentálneho výskumu, ktoré vysvetľujú etiopatogenézu ochorenia. Stredobodom pozornosti je estrogén/progesterónová regulácia endometria a jej poruchy vyvolané rôznymi endogénnymi ako aj exogénnymi vplyvmi [4]. Podľa najnovších vedeckých výskumov kľúčovým mechanizmom je autonómna tvorba estrogénov z androgénov nadobličkového pôvodu [5]. Uvedenú konverziu katalyzuje enzým aromatáza, ktorá sa u zdravých žien nachádza najmä v ovariálnom tkanive. Jej prítomnosť bola dokázaná aj v syncýciotrofoblaste, alebo mozgovom tkanive. U zdravých žien, bez postihnutia endometriózy sa aromatázová aktivita nepotvrdila, avšak takúto enzýmovú aktivitu vykazujú endometriózne ložiská - teda ektopicky uložené endometriálne tkanivo. Tento fakt sa považuje za doplňujúci faktor pri vzniku ochorenia na základe retrográdnej menštruácie. Počas menštruácie boli dokázané bunky endometria v peritoneálnej dutine u väčšiny žien, ale len u niektorých vedie k vzniku a progresii ochorenia. Pravdepodobnou príčinou je uvedená aktivita aromatázy, ktorá je zodpovedná za konverziu androgénov nadobličkového pôvodu na estrón a ďalšou premenou na estradiol. Vzniká pozitívna spätná väzba, ktorá stimuluje rast endometriózneho ložiska a vedie k progresii ochorenia (obr. 1). Uvedený mechanizmus je podporený aj klinickými skúsenosťami:

• pri liečbe ochorenia GnRH analógmi napriek navodeniu hypoestrinného stavu často dochádza k rezistencii ochorenia na liečbu, alebo po ukončení liečby k častej recidíve. Príčinou je pravdepodobná autonómna stimulácia ložiska estrogénmi „vlastnej tvorby“;
• existujú pomerne málo početné kazuistiky s použitím inhibítorov aromatázy zväčša po neúspešnej liečbe, najmä GnRH analógmi. V uvedených prípadoch takáto liečba inhibítormi aromatázy znamenala neporovnateľne vyššiu efektivitu v porovnaní s konvenčnou liečbou [3, 4, 5, 7].

Bolo by naivne tvrdiť, že endometrióza je vyvolaná čisto len rastom ektopického endometria vykazujúceho aromatázovú aktivitu, ktoré sa nachádza mimo dutiny maternice pri retrográdnej menštruácii. Poznáme niekoľko faktorov, ktoré sa dokázateľne spolupodieľajú pri vzniku ochorenia. Sú to polymorfizmy génov kódujúce enzýmy estrogénového metabolizmu, cytokíny, faktory vonkajšieho prostredia - najmä chemické látky podobné estrogénom, prevaha antiapoptotických faktorov apod. [6, 9].

Napriek intenzívnemu vedeckému bádaniu diagnostika ochorenia je aj v súčasnosti odkázaná na vizualizáciu ložísk makroskopicky (najmä laparoskopicky) a/alebo mikroskopickou analýzou tkaniva. Biochemické markery sú málo špecifické a obmedzene sa dajú používať pri sledovaní aktivity ochorenia- Ca 125, TNFá, IL [11]. Neinvazívne zobrazovacie metódy – najčastejšie ultrazvukové vyšetrenie a MRI majú len komplementárny charakter a slúžia k predoperačným algoritmom [2]. Klinický potenciál poznania aromatázovej aktivity endometrióznych ložísk spočíva v možnosti zjednodušenia diagnostiky ochorenia a efektívnejšej liečbe selektívnou inhibíciou enzýmu. Ak akceptujeme vplyv retrográdnej menštruácie na vznik ochorenia, je možné predpokladať aj koreláciu vlastností ektopického a eutopického endometria. Kľúčovým faktorom uvedenej teórie je „choré“ eutopické endometrium schopné rastu v iných podmienkach – mimo dutiny maternice [10, 15]

Porucha estrogénového metabolizmu je spojená aj s výskytom iných morfologických zmien, ako sú napríklad tvorby myomatóznych uzlov, hyperplázie endometria až karcinóm. Všeobecne estrogény pôsobia na cieľové orgány stimulačne a uvedené ochorenia sa často vyskytujú spoločne [16]. 

MATERIÁL A METODIKA

Na gynekologicko-pôrodníckej klinike MFN a JLF UK v Martine sme zahájili klinickú štúdiu za účelom zistenia korelácie expresie mRNA aromatázy v eutopickom endometriu s výskytom endometriózy a estrogéndependentných ochorení (myomatóza, hyperplázia endometria) a využiteľnosti v klinickej praxi. Do štúdie sme zaradili pacientky, ktoré boli prijaté od mája 2006 do augusta 2007 za účelom plánovaného operačného výkonu laparoskopie alebo laparotomie z indikácie pelvických bolestí, sterility alebo nesuspektných tumorov malej panvy. Predpokladom zaradenia do štúdie bolo transvaginálne ultrazvukové vyšetrenie vykonané erudovaným špecialistom, potvrdzujúce benígny charakter ochorenia. Pacientky, ktoré spĺňali uvedené kritéria, boli poučené o štúdii a požiadané o písomný súhlas. Pri operačnom výkone bol kladený dôraz na identifikáciu a popis endometrióznych ložísk, výskyt myomatózy event. iných malformácií. V prípade nálezu endometriózy bola vykonaná biopsia z ložiska za účelom histologickej verifikácie a hodnotenie štádia podľa rAFS. Vzorka eutopického endometria v prípade laparoskopie bola získaná po ukončení operácie pomocou ostrej kyrety po predchádzajúcej dilatácii krčka maternice. Časť materiálu bola odoslaná na histopatologické vyšetrenie za účelom vylúčenia malignity. V prípade hysterektómie ihneď po extrakcii maternice bola excidovaná časť endometria. Takto získané vzorky boli následne transportované v tekutom dusíku a ďalej skladované pri –80 °C až do samotného vyšetrenia. Analýza expresie mRNA aromatázy bola vykonaná podľa štandardizovaných biochemických metodík: extrakcia mRNA z tkaniva – následný prepis na cDNA – reverzný prepis pomocou PCR a elektroforetická detekcia produktov na 2% gélovom agare. Pre zjednodušené hodnotenie expresie boli vzorky hodnotené semikvantitatívne od 0 do 3: 0 - žiadna expresia, 1- slabá, 2 - stredná, 3 - silná expresia (obr. 2).

VÝSLEDKY

Do štúdie sme zaradili celkovo 23 žien. Priemerný vek bol 39,7 rokov. V 17 prípadoch bola vykonaná laparoskopia a 6 žien podstúpilo abdominálnu hysterektómiu. Endometrióza bola zistená v 12 prípadoch, zvyšných 11 žien nevykazovalo známky ochorenia a tvorilo kontrolnú skupinu. U žien s endometriózou bola priemerná hodnota expresie mRNA aromatázy 1,1, v kontrolnej skupine 0,73, p=0,01 (tab. 1).

Na základe výskytu estrogéndependentných ochorení, ako je myomatóza, endometrióza alebo hyperplázia endometria bol základný súbor žien rozdelený na skupinu s výskytom uvedených ochorení – 18 žien, a zdravú, kontrolnú skupinu – 5 žien, Priemerné hladiny aromatázovej expresie v uvedených skupinách boli 1,05 resp. 0,4 v kontrolnej skupine, p=0,004 (tab. 2).

Ak za hraničnú „cut off“ hladinu aromatázovej expresie považujeme aspoň slabú expresiu (v semikvantitatívnom vyjadrení 1) v prípade diagnostiky endometriózy a/alebo adenomyózy, senzitivita vyšetrenia v našom súbore bola 75 %, špecificita 54,5 %. V prípade diagnostiky estrogéndependentných ochorení senzitivita 72,2 % a špecificita 80 %.

DISKUSIA

Medicínska veda v posledných desaťročiach zaznamenala neočakávaný rozvoj. Ochorenia, ktoré v minulosti znamenali istú smrť pre pacientov, dokážeme v súčasnosti vyliečiť. Diagnostické možnosti z oblasti priamej vizualizácie sa posunuli postupne na bunkovú až génovú úroveň. Uvedené tvrdenia bohužiaľ neplatia pre endometriózu. Diagnostika endometriózy je odkázaná na priamu vizualizáciu a v princípe za posledných 80 rokov zostáva nezmenená – od prvého opisu „čokoládových“ endometrióznych cýst. Len zavedenie laparoskopie do klinickej praxi viedlo k zníženiu invazivity pre pacientky. Zostáva však záťaž celkovej intubačnej anestézy ako aj riziko možných operačných komplikácií [8].

Predpokladom univerzálnej diagnostickej metodiky pre dané ochorenie je vysoká senzitivita a špecificita, jednoduchosť vyšetrenia, nízka alebo žiadna invazivita a v neposlednom rade nízka finančná náročnosť vyšetrenia. Naším cieľom bolo, na základe existujúcich literárnych údajov, overiť využiteľnosť expresie mRNA aromatázy v eutopickom endometriu v korelácii s endometriózou a estrogéndependentnými ochoreniami. Náš súbor tvorili pacientky, ktoré podstúpili laparoskopiu alebo laparotomiu pre nutnosť korelácie s výskytom ochorenia. Odber materiálu však je možný aj za menej invazívnych kritérií, napr. aspiračnou kanylou bez nutnosti dilatácie krčka maternice. Pre nestabilný charakter mRNA získané vzorky treba ihneď fixovať- v našom prípade v tekutom dusíku, existujú však špeciálne fixačné roztoky na zjednodušenie práce. Ďalšie spracovanie a analyzovanie výsledkov vyžaduje vysoko špecializované pracovisko so skúsenosťami PCR metodiky.

V našom súbore sme potvrdili pomerne vysokú senzitivitu (75 %) avšak pomerne nízku špecificitu (54,5 %) expresie mRNA aromatázy v eutopickom endometriu pre diagnostiku endometriózy a/alebo adenomyózy. Pri analýze sme výskyt ochorenia považovali za absolútny fakt, bez rozdielu na štádium ochorenia, i keď počas operácie bola manifestácia endometriózy klasifikovaná podľa medzinárodných kritérií - na základe rAFS [14]. Zohľadnenie klinických štádií by bolo možné len pri podstatne väčšom súbore. Všetky diagnózy adenomyózy boli obdržané „ex post“, na základe výsledku histológie z uteru po vykonaní hysterektómie.

Pri zohľadnení výskytu estrogéndependentných ochorení - v našom súbore endometriózy, adenomyózy, hyperplázie endometria (simplexnej) a myomatózy - bola senzitivita 72,2 % a špecificita až 80 %. Podmienkou takejto analýzy je teoretický predpoklad centrálnej úlohy estrogénovej stimulácie pri vzniku uvedených – pomerne rôznorodých ochorení. Uvedené ochorenia bývajú často združené a v klinickej praxi sa často stretávame s výskytom myomatózy a adenomyózy u tej istej pacientky [17]. V tomto súbore žien bola zaradená pacientka medzi kontrolnú skupinu so stredne vysokou expresiou mRNA aromatázy s negatívnymi prejavmi estrogéndependetného ochorenia. U nej bola vykonaná laparoskopia z indikácie pelvických bolestí s negatívnym nálezom. V predoperačnom ultrazvukovom vyšetrení však bolo u nej vyslovené podozrenie na adenomyózu, ktorú v tomto štádiu nie je možné dokázať. Uvedený problém je univerzálny pre všetky štúdie zaoberajúce sa endometriózou. Nie je možné spoľahlivo vysloviť diagnostický záver pre endometriózu alebo adenomyózu. Aj pri laparoskopickom hodnotení belavých endometrióznych ložísk panuje dilema. Sú to vyhojené, fibrózne zmenené ložiská, z ktorých v budúcnosti nehrozí relaps ochorenia, alebo sú to len ložiská s nižšou biologickou aktivitou znamenajúce rovnakú hrozbu pre pacientku? V prvom prípade by sme mali pacientku s takýmto nálezom považovať za zdravú, v druhom za chorú a zaradiť ju minimálne do I. stupňa endometriózy. Sú to zásadné otázky nielen vyhodnocovania klinických štúdií, ale aj každodennej praxe [1].

Diagnostická validita vyšetrenia expresie mRNA aromatázy za účelom myomatózy a hyperplázie endometria je značne obmedzená. Myómy sú spoľahlivo detekovateľné pri bežnom ultrazvukovom vyšetrení. Pri odobratí vzorky endometria má histologické vyšetrenie nenahraditeľnú hodnotu pri diagnostike hyperplázií. Uvedená spojitosť medzi expresiou mRNA aromatázy a výskytom uvedených ochorení dokazuje úlohu estrogénovej stimulácie senzitívnych tkanív pri vzniku ochorenia.

Treba konštatovať, že uvedený súbor je pomerne malý, aby sme dospeli k všeobecne platným záverom. Potvrdili sme však významnú úlohu estrogénového stimulu pri vzniku uvedených ochorení. 

ZÁVER

Expresia mRNA aromatázy v eutopickom endometriu je dobrým markerom pri diagnostike enodmetriózy. Je možné ho použiť v klinickej praxi a môže slúžiť na určenie rizikových skupín žien a tým k redukcii invazívnych diagnostických postupov – najmä laparoskopie.

Poďakovanie

Autori vyjadrujú poďakovanie pracovníkom Ústavu klinickej biochémie JLF UK za ich odbornú pomoc, ako aj pacientkam, ktoré sa zúčastnili tejto štúdie. Práca bola podporená grantom VEGA 1/3374/06. 

Doc. MUDr. Jozef Višňovský, CSc.

Gynekologicko-pôrodnícka klinika JLF UK a MFN

Kollárova 2

036 01 Martin

Slovenská republika

e-mail: visnovsky@jfmed.uniba.sk