Možnosti a výsledky preimplantační genetické diagnostiky (PGD) u párů s chromozomální translokací

Súhrn

Cíl studie:
Posoudit možnosti, úspěšnost a výsledky PGD u párů s chromozomální translokací na základě vlastního rozsáhlého souboru pacientů.

Typ studie:
Retrospektivní analýza.

Název a sídlo pracoviště:
Sanatorium Pronatal Praha, akreditované pracoviště reprodukční medicíny.

Metodika:
Do studie bylo zařazeno 94 párů s translokací léčených na našem pracovišti v období 1. 1. 2004 až 31. 5. 2010. U 50 párů byl jeden z partnerů nositelem reciproké translokace, u 44 párů se jednalo o translokaci robertsonskou. Průměrný věk žen v obou skupinách se nelišil (33±4,4 u robertsonských vers. 33±3,9 u reciprokých translokací). Po stimulaci agonisty GnRH s rekombinantním FSH či hMG v „dlouhém“ protokolu a transvaginální punkci folikulů byla provedena biopsie jedné buňky embrya 72 hodin po oplození. Po fixaci blastomery byly vyšetřeny translokované chromozomy a u balancovaných embryí byly vyšetřeny chromozomy 13, 18, 21, X a Y metodou FISH na interfázních jádrech. Do dělohy jsme přenášeli maximálně dvě embrya, případná další euploidní nadpočetná embrya byla kryokonzervována.

Výsledky:
Z celkového počtu 629 vyšetřených embryí byla u 126 nalezena balancovaná genetická informace (21,9 %) – z toho ve 25,2 % (68/270) u párů s robertsonskou a v 16,4 % (59/359) u párů s reciprokou translokací. Embryotransfer byl v proveden ve 30 cyklech (68,2 %) u robertsonských a ve 27 cyklech (54 %) u reciprokých translokací. Celkem bylo dosaženo 24 těhotenství – 15 u robertsonských translokací (34,1 % na cyklus a 50 % na transfer) a 9 u reciprokých translokací (18 % na cyklus a 33 % na transfer) – tento rozdíl je statisticky významný (p=0,033). Pouze jedno těhotenství v každé skupině skončilo potratem.

Závěr:
PGD umožňuje vysokému procentu párů s chromozomální translokací, kterým se nepodařilo otěhotnět nebo porodit dítě po spontánní koncepci, v krátkém časovém horizontu otěhotnět a porodit zdravého potomka. S ohledem na biologické aspekty a interchromozomální efekt mají signifikantně lepší prognózu páry s robertsonskou translokací oproti párům s reciprokou translokací.

Klíčová slova:
IVF, ICSI, preimplantační genetická diagnostika, robertsonské translokace, reciproké translokace, těhotenství.

ÚVOD

Genetické vyšetření preimplantačních embryí (Preimplantation Genetic Diagnosis – PGD) otevřelo možnost prevence porodu geneticky postižených plodů u rizikových párů [3, 4, 9]. Zásadní výhodou tohoto postupu oproti všem „klasickým“ metodám prenatální diagnostiky je to, že do dělohy jsou přenášena (z hlediska vyšetřovaných chromozomů) pouze „zdravá“ embrya a je minimalizováno riziko nutnosti přerušení již existujícího těhotenství v případě průkazu postižení plodu. Nedílnou součástí tohoto postupu je ovariální stimulace, odběr oocytů, mimotělní oplodnění (IVF) a následný přenos geneticky normálních embryí do dělohy. Jelikož neplodnost má často genetické pozadí, PGD má potenciál významně zvýšit efektivitu léčby sterility metodami asistované reprodukce. V této souvislosti se rozlišuje screening chromozomálních aneuploidií (PGS), kde cílem je detekce chromozomálních aneuploidií u párů bez definované genetické abnormity a vlastní PGD, kde je předem známo genetické riziko vycházející z prokázané abnormity, ať již na chromozomální nebo genové úrovni. V případě diagnostiky na chromozomální úrovni je dominujícím postupem FISH (Fluorescent In Situ Hybridization), při diagnostice na úrovni jednotlivých genů je používána metodika PCR (Polymerase Chain Reaction).

Cílem naší práce byloposoudit možnosti, úspěšnost a výsledky PGD u párů s chromozomálními translokacemi, které jsou nejčastější indikací PGD u poruch na chromozomální úrovni. U nosičů translokací je výrazně zvýšeno riziko opakovaných potratů, sterility, resp. porodu plodu s nebalancovaným karyotypem. Translokace patří mezi strukturální chromozomální abnormity. Rozlišujeme dva typy translokací: reciproké a robertsonské. U reciprokých dochází k výměně segmentů mezi dvěma chromozomy (obr. 1), postiženy mohou být kterékoliv dva chromozomy. Robertsonské translokace představují specifický typ translokace mezi dvěma akrocentrickými chromozomy – oba chromozomy se lámou v centromerické oblasti, jejich dlouhá ramena se spojí do jednoho celku a krátká ramena se ztrácejí (obr. 2). Výsledkem je karyotyp se 45 chromozomy, přičemž nejčastěji jsou postiženy chromozomy 13 a 14 (der(13:14)(q10:q10)) představující 75 % všech robertsonských translokací [7]. Pokud se translokace týká chromosomu 21, je nebezpečí vzniku trizomie chromozomu 21, tzv. translokační forma Downova syndromu. U obou typů translokací mohou u nositele vznikat gamety jak s balancovaným genotypem (v genomu není žádná přebývající ani chybějící informace), tak s nebalancovaným genotypem (v důsledku tvorby kvadrivalentu a způsobu segregace v meióze jsou v genomu přebývající či chybějící geny). Genetické vyšetření preimplantačních embryí (PGD) umožňuje vybrat chromozomálně normální (či balancovaná) embrya vhodná pro přenos do dělohy [1, 6].

Předpokladem úspěchu programu PGD je rutinní zvládnutí všech aspektů mimotělního oplodnění (IVF). Vlastní PGD vyžaduje navíc atraumatické odebrání jedné buňky dělícího se embrya, fixaci interfázního jádra buňky, zhodnocení genetické výbavy embrya FISH metodikou v genetické laboratoři a následný přenos „zdravých“ embryí do děložní dutiny.

SOUBOR A METODIKA

Do retrospektivní studie bylo zařazeno 94 párů s translokací, léčených na našem pracovišti v období 1.1. 2004 – 31. 5. 2010. U 50 párů byl jeden z partnerů nositelem reciproké translokace, u 44 párů se jednalo o translokaci robertsonskou. Průměrný věk žen v obou skupinách se nelišil (33±4,4 u robertsonských vers. 33±3,9 u reciprokých translokací). Před zahájením vlastní léčby absolvovali pacienti konzultaci s klinickým genetikem a specialistou v oboru reprodukční medicína, kteří je podrobně informovali o všech aspektech plánované léčby, a současně podepsali informované souhlasy. V přípravné fázi byly nejprve otestovány specifické FISH sondy na lymfocytech pacientů a teprve poté byl zahájen vlastní IVF cyklus. Po stimulaci agonisty GnRH a rekombinantním FSH nebo hMG v „dlouhém“ protokolu a následné transvaginální punkci folikulů byly oocyty oplozeny metodikou intracytoplazmatické injekce spermie (ICSI). Biopsie jedné blastomery byla provedena u všech embryí, které po 72 hodinách po oplození dosáhly 6–8buněčného stadia. Po fixaci blastomery na podložním skle byly vyšetřeny translokované chromozomy (pro robertsonské translokace jsou používány DNA sondy pro subtelomerické oblasti translokovaných chromozomů, pro reciproké translokace 2 DNA sondy pro oblasti distálně od zlomů + 1 DNA sonda pro proximální oblast (nebo na­opak), optimální jsou 2 distální a 2 proximální sondy) a u balancovaných embryí byly dále vyšetřeny klinicky relevantní chromozomy 13, 18, 21, X a Y metodou FISH na interfázních jádrech. Do dělohy jsme přenášeli maximálně dvě embrya, případná další euploidní nadpočetná embrya byla kryokonzervována. V případě amenorey byla 15 dnů po přenosu stanovena kvantita hCG a klinické těhotenství následně ověřeno ultrazvukovým vyšetřením. Při statistickém zpracování byl použit t-test, Mannův-Whitneyho test a χ² test.

VÝSLEDKY

Z 282 vyšetřovaných embryí s robertsonskou translokací bylo úspěšně vyšetřeno 270 embryí (95,7 %), z 376 embryí s reciprokou translokací bylo úspěšně vyšetřeno 359 embryí (94,9 %). Z celkového počtu 629 vyšetřených embryí u 126 byla nalezena balancovaná genetická informace (21,9 %) – z toho ve 25,2 % (68/270) u párů s robertsonskou a v 16,4 % (59/359) u párů s reciprokou translokací (tabulka 1). Embryotransfer byl proveden ve 30 cyklech (68,2 %) u robertsonských a ve 27 cyklech (54 %) u reciprokých translokací. Celkem bylo dosaženo 24 těhotenství (tab. 2) – 15 u robertsonských translokací (34,1 % na cyklus a 50 % na transfer) a 9 u reciprokých translokací (18 % na cyklus a 33 % na transfer) – tento rozdíl je statisticky významný (p=0,033). Pouze jedno těhotenství v každé skupině skončilo potratem (tab. 3).

DISKUSE

ESHRE PGD consorcium udává úspěšnost na transfer u robertsonských translokací 28,5%, u reciprokých translokací 21,8 % [2]. Nejnovější belgická data udávají baby take home rate na transfer u robertsonských translokací 38,1 %, u reciprokých translokací 23,2 % [11]. Významný rozdíl v úspěšnosti mezi oběma typy translokací je zřejmý i z našich vlastních výsledků (50 % klinických gravidit na transfer u robertsonských a 33 % u reciprokých translokací). Rozdíl v úspěšnosti odráží skutečnost, že u párů, kde jeden z partnerů je nosičem reciproké translokace, vzniká signifikantně vyšší procento nevyvážených gamet (a embryí) oproti párům s robertsonskou translokací [8]. V obou našich skupinách potratila pouze 1 pacientka, zatímco po spontánní koncepci u párů, kde jeden z partnerů je nosičem balancované translokace, končí potratem až 90 % těhotenství. Desetinásobné snížení rizika potratu u párů s translokacemi po přenosu embryí po PGD oproti spontánní koncepci popsali ve svých výsledcích jak Keymolen a Otani [5, 8], tak již dříve i Verlinsky [10]. Je však povinností lékaře upozornit pacienty, že metodika FISH při PGD u translokací nemůže rozlišit „normální“ embrya se zcela normální chromozomální výbavou od embryí s „balancovanou“ výbavou, tedy s „vyváženou“ translokací.

ZÁVĚR

PGD umožňuje vysokému procentu párů s chromozomální translokací, kterým se nepodařilo otěhotnět nebo porodit dítě po spontánní koncepci, v krátkém časovém horizontu otěhotnět a porodit zdravého potomka. S ohledem na biologické aspekty a interchromozomální efekt mají signifikantně lepší prognózu páry s robertsonskou translokací oproti párům s reciprokou translokací. Preimplantační screening a diagnostika se stále více prosazují jako nedílná součást léčby neplodnosti metodami asistované reprodukce, jsou příkladem stále užší a intenzivnější mezioborové spolupráce a nezanedbatelný není ani vědecký přínos těchto postupů otevírající zcela nový pohled na lidskou reprodukci.

Doc. MUDr. Tonko Mardešić, CSc.
Sanatorium Pronatal
Na Dlouhé mezi 4/12
147 00 Praha 4
e-mail: sanatorium@pronatal.cz
www.pronatal.cz