Plazmatické buňky jako marker predikující odpověď na anti-TNF léčbu

Souhrn

Cílem této studie bylo identifikovat buněčnou populaci, kterou by bylo možné využít k předpovědi reakce na anti-TNF terapii. Celkem bylo analyzováno 46 pacientů, jimž byly podávány anti-TNF preparáty: 23 pacientů s juvenilní idiopatickou artritidou (11– Enbrel, 11– Remicade a 1– Humira), 16 pacientů s ankylozující spondylitidou (8 – Enbrel, 8 – Remicade), 5 pacientů s revmatoidní artritidou (všichni Enbrel) a 2 pacienti s psoriatickou artritidou (oba Enbrel) a dále 19 kontrol. U 11 pacientů s juvenilní idiopatickou artritidou a 3 pacientů s ankylozující spondylitidou byly k dispozici klinické parametry před začátkem biologické léčby a 3 měsíce po začátku (hladina CRP, rychlost sedimentace, DAS28, BASDAI, VAS skóre, počet citlivých a oteklých kloubů). K imunofenotypizaci mononukleárních buněk periferní krve pacientů a kontrol byla použita polychromatická průtoková cytometrie. Identifikovali jsme dvě skupiny pacientů, odpovídající na léčbu a rezistentní na léčbu, které se významně lišily frekvencí CD19⁺CD20⁻CD27^highCD38⁺CD138⁺ plazmatických buněk (odpovídající pacienti: 1,3-10,3 %; medián 7,04±1,05; 95 %CI 4,06–9,03 vs. rezistentní pacienti 17,3–37,3; medián 27,75±9,18; 95%CI 18,12–37,38; p=0,0007). U všech pacientů reagujících na léčbu byly všechny klinické parametry statisticky významně sníženy. Frekvence CD19⁺CD20⁻CD27^highCD38⁺CD138⁺ plazmatických buněk byly u pacientů odpovídajících na léčbu nejméně 13x nižší než u rezistentních pacientů a tato populace by tak mohla představovat biologický marker predikující úspěšnost anti-TNF terapie.

Klíčová slova:
anti-TNF, B lymfocyty, plazmatické buňky, průtoková cytometrie, odpověď na léčbu

Úvod

TNFα je prozánětlivý cytokin, jehož hlavními producenty jsou monocyty a jako první byla objevena jeho schopnost indukovat lýzi nádorových buněk. Postupně byly odhaleny jeho další funkce, jako je např. stimulace produkce různých cytokinů a chemokinů, proliferace fibroblastů a endoteliálních buněk, a aktivace fagocytózy (1, 2).

Význam TNFα v patogenezi revmatických chorob byl potvrzen na myším modelu transgenním pro lidský TNFα (tzn. do myšího genomu je vložen gen pro lidský protein), u něhož docházelo ke spontánnímu rozvoji destruktivní artritidy, který bylo možné zvrátit aplikací anti-TNF monoklonálních protilátek (3). Výsledky této studie byly pak podpořeny experimentem na myším modelu kolagenem II indukované artritidy (CIA), kdy podání TNFα během rozvoje CIA vedlo k výrazné destrukci kloubu. Avšak pokud byla myším v době rozvoje CIA podána anti-TNF monoklonálních protilátka, ke kloubním destrukcím nedošlo a naopak celkový klinický stav se zlepšil (4, 5). Tato práce se pak stala kruciální pro pozdější široké využití anti-TNF monoklonálních protilátek v léčbě revmatoidní artritidy (RA), Crohnovy choroby, juvenilní idiopatické artritidy (JIA), ankylózující spondylitidy (AS) a psoriatické artritidy (PsA) (6, 7).

U všech současných používaných preparátů blokujících TNFα (chimerická nebo humanizovaná monoklonální anti-TNF protilátka – Remicade/Infliximab a Humira/Adalimumab nebo solubilní rekombinantní receptor TNFα - Enbrel/Etanercept) se však lze setkat se situací, kdy je léčba málo účinná nebo pacient na podaný lék vůbec nereaguje.

Účinnost anti-TNF terapie je obvykle monitorována pomocí klinických parametrů, jako je např. hladina CRP, rychlost sedimentace erytrocytů, aktivita nemoci (DAS28, BASDAI a VAS skóre) nebo počet citlivých a oteklých kloubů. Tento přístup je spojen s nutností po určitý čas na pozorovatelnou změnu čekat (cca v rozsahu několika měsíců), což může být zčásti nevýhodné právě pro pacienty, kteří na léčbu nereagují a musí jim být posléze podán jiný preparát. Proto by bylo vhodné najít marker na buněčné nebo molekulární úrovni, který by bylo možné použít buď k monitorování, nebo k predikci odpovědi na anti-TNF léčbu (a to v rozsahu dnů nebo nejvýše několika týdnů).

Naším záměrem proto bylo pomocí polychromatické průtokové cytometrie najít v periferní krvi pacientů léčených anti-TNF preparáty B buněčnou populaci popřípadě populaci plazmatických buněk, s jejíž pomocí by bylo možné vytypovat pacienty potenciálně nereagující na podávaný anti-TNF lék ještě před jeho podáním.

Soubor pacientů a metody

U všech pacientů byla podávána následující anti-TNF léčba: 23 pacientů s JIA (11–47,8 % Enbrel, 11–47,8 % Remicade a 1–4,4 % Humira), 16 pacientů s AS (8–50 % Enbrel, 8–50 % Remicade), 5 pacientů s RA (všichni Enbrel) a 2 pacienti s PsA (oba Enbrel). Pacienti s výše uvedenými revmatickými chorobami byli klasifikováni podle publikovaných kritérií (8–10).

Imunofenotypizace byla provedena na průtokovém cytometru LSR II (Becton and Dickinson, San Jose, USA) podle již publikovaného postupu (11). Byly použity následující monoklonální protilátky konjugované s fluorochromy: anti-CD19 PeCy7 (klon SJ25-CI, Dako, Glostrup, Dánsko), anti-CD20 FITC (klon B-Ly-1, Dako), anti-CD27 PE (klon M-T271, Dako), anti-CD38 APC-Cy5.5 (klon HIT 2, Dako) a anti-CD138 PE –Cy5.5 (klon ID4, Dako).

Výsledky

Celkem bylo analyzováno 23 pacientů s JIA, z nichž 8 (34,8 %) mělo artritidu s entezitidou HLA B27+, 8 (34,8 %) polyartritidu RF-negativní, 2 (8,7 %) polyartritidu RF-pozitivní, 2 (8,7 %) s psoriatickou formou nemoci, 2 (8,7 %) s rozšířenou oligoartritidou a 1 (4,3 %) se systémovou artritidou. Jako kontroly byly použity vzorky periferní krve od pacientů s jinými systémovými autoimunitními chorobami (AS n=16; RA n=5; PsA n=2) a dále od zdravých dárců (KO n=19).

Jak bylo výše uvedeno, byly zkoumány různé kombinace povrchových aktivačně-diferenciačních znaků (CD19, CD20, CD27, CD38 a CD138) a na základě výsledků jako významná byla vybrána populace plazmatických buněk charakterizovaná přítomností znaků CD19, CD27, CD38 a CD138 a nepřítomností povrchové molekuly CD20, tj. CD19⁺CD20^-CD27^highCD38⁺CD138⁺populace (obr. 1). Jak je vidět na obrázku 2, frekvence této populace v periferní krvi byla u pacientů se systémovými autoimunitními chorobami vždy statisticky významně vyšší oproti kontrolám (JIA: rozsah 0,0–54,2 %; medián 14,3±3,1, 95 %CI 11,1-24,0; p<0,0001; AS: rozsah 0,65–32,2 %; medián 11,3±2,7, 95 %CI 7,9–19,3; p=0,0008; RA: rozsah 10,3–23,3 %; medián 12,8±5,2, 95 % CI 7,8–20,7; p=0,0019; PsA: rozsah 9,1–14,0 %; medián 11,6±2,5, 95 % CI 19,7-42,7; KO: rozsah 0,0–3,51 %; medián 0,52±0,26, 95 % CI 0,47–1,57).

U 11 pacientů s JIA a 3 pacientů s AS léčených anti-TNF preparáty jsme měli k dispozici klinická data po třech měsících od započetí biologické léčby a proto jsme se zaměřili na to, zda lze najít souvislost mezi námi specifikovanou populací plazmatických buněk a klinickým průběhem léčby. Podle výše uvedených parametrů (CRP, rychlost sedimentace erytrocytů, DAS28 nebo BASDAI, VAS, počet citlivých a oteklých kloubů) byli pacienti rozděleni do dvou skupin: respondéři (R: n=8, z toho 5 s JIA a 3 s AS) a non-respondéři (NR: n=6, všichni s JIA).

Když jsme těmto pacientům pak přiřadili odpovídající hodnoty frekvencí CD19⁺CD20^-CD27^high CD38⁺CD138⁺ plazmatických buněk stanovené před aplikací léčby, ukázalo se, že se obě skupiny statisticky významně liší právě frekvencí uvedené buněčné populace (obr. 3). Zatímco se její frekvence v periferní krvi respondérů (R) se pohybovala v rozsahu 1,3–10,3 % (medián 7,04±1,05; 95 % CI 4,06–9,03), u non-respondérů (NR) byla tato frekvence nejméně 13krát vyšší (rozsah 17,3–37,3; medián 27,75±9,18; 95 % CI 18,12– –37,38; p=0,0007).

Všechny sledované klinické parametry u skupiny respondérů (R) vykazovaly statisticky významná snížení hodnot po třech měsících od počátku léčby, zatímco u non-respondérů takový trend nebyl patrný (tab. 1a, b). Skupina non-respondérů se pak vyznačovala také tím, že počáteční hodnoty klinických parametrů byly nevýznamně zvýšeny oproti skupině respondérů (tab. 2a, b), například hladina CRP, VAS skóre a počet citlivých a oteklých kloubů.

Frekvence CD19⁺CD20^-CD27^highCD38⁺CD138⁺plazmatických buněk ani hodnoty klinických parametrů nekorelovaly s typem JIA nebo druhem podávaného anti-TNF preparátu.

Diskuse

V literatuře existuje mnoho prací popisujících vliv anti-TNF terapie na buňky imunitního systému. U pacientů s RA, jimž byla podávána Humira (Adalimumab) do 15. dne od podání preparátu, došlo ke zvýšení počtu CD4⁺CD25^higha CD4^{+ +}CTLA4⁺ T regulačních buněk a CD3⁺ T buněk v periferní krvi. Avšak po 180 dnech od podání léku již nebyly patrné žádné významné změny ve frekvenci uvedených buněčných populací (12).

Biologické účinky anti-TNF terapie byly studovány na chimérickém modelu, kdy byly do SCID myší (s těžkým kombinovaným imunodeficitem, severe combined immunodeficiency) vneseny lidské monocytární (THP-1) buňky nebo T buňky (Jurkat). Po aplikaci Remicadu (Infliximab) došlo k indukci apoptózy jak u monocytární linie THP-1, tak u CD3⁺CD28⁺ Jurkat T buněk (13).

U Crohnovy choroby podání Remicadu (Infliximab) vedlo k redukci sérových hladin solubilního sCD40, k vymizení exprese CD40 a VCAM-1 ve střevní mukóze a k indukci apoptózy u CD3^{+ +}CD28⁺ T buněk (14).

Rovněž švédská studie provedená u 12 pacientů s RA léčených Enbrelem (Etanercept) a 9 pacientů s RA léčených Remicadem (Infliximab) prokazuje na monocytech (CD68⁺ a CD163⁺) a T lymfocytech (CD3⁺) izolovaných ze synoviální tekutiny postižených kloubů indukci apoptózy po podání léku, v důsledku čehož jsou zmíněné populace redukovány (15).

Biologické účinky léků blokujících TNF jsou tedy různorodé a pravděpodobně velice komplexně zasahují do buněčné a humorální homeostázy. Vzhledem k heterogenitě samotného imunitního systému není jednoduché výsledné efekty monitorovat a jak se ukazuje na základě výše uvedené studie aplikace Humiry (Adalimumabu) u pacientů s RA (12), důležitou roli v takovém pozorování bude mít především zvolené časové schéma během sledování změn parametrů.

Neméně složité bude identifikovat takové buněčné nebo molekulární markery, které pomohou předpovědět možnou odpověď pacienta na podávanou biologickou léčbu ve smyslu její individualizace a přitom budou dostupné, informativní, relativně snadno proveditelné a ekonomicky nenáročné.

Nedávno skupinou T. Dörnera bylo ukázáno na pacientech se systémovým lupus erythematodes, že lze plazmatické buňky (CD19⁺CD20^-CD27^high) využít k monitorování aktivity nemoci. Vysoké frekvence této buněčné populace korelovaly s aktivitou nemoci stanovené pomocí SLEDAI i s titry anti-dsDNA autoprotilátek (16).

V naší studii jsme identifikovali populaci plazmatických buněk (CD19⁺CD20^-CD27^highCD38⁺⁺CD138⁺), jejíž frekvence v periferní krvi pacientů s JIA anebo AS odpovídajících na anti-TNF terapii byla významně nižší oproti pacientům, kteří na léčbu nereagovali, přičemž se tyto dvě skupiny v žádném jiném parametru nelišily. Zajímavé je však také zjištění, že pacienti se dvěma různými autoimunitními chorobami, (tj. JIA a AS) vykazují signifikantní klinické zlepšení a obě skupiny mají nízké frekvence studované populace plazmatických buněk před započetím léčby. Je otázka, jak vysoké frekvence těchto buněk u pacientů rezistentních k léčbě souvisí s absencí zlepšení klinických parametrů a jakou biologickou funkci tato populace u rezistentních pacientů plní nebo čím jsou determinovány jejich značně rozdílné výchozí frekvence v periferní krvi ještě před začátkem léčby. Je možné, že se jedná o tzv. dlouhožijící plazmatické buňky, které v případě anti-TNF rezistentních pacientů unikají imunosupresivním účinkům TNF blokády. Řešení těchto otázek bude vyžadovat jednak analýzu dalších pacientů a jednak analýzu cytokinového profilu (prozánětlivé vs. protizánětlivé) v séru právě před prvním podáním anti-TNF preparátu.

Závěr

V periferní krvi pacientů s JIA nebo AS jsme pomocí polychromatické průtokové cytometrie identifikovali CD19⁺CD20^-CD27^highCD38⁺CD138⁺ populaci plazmatických buněk, jejíž frekvence v periferní krvi před započetím anti-TNF léčby významně odlišuje pacienty reagující na léčbu a pacienty k léčbě rezistentní. Tato populace by mohla být v budoucnu využívána jako standardní predikční marker především ve smyslu individualizovaného rozhodování o aplikaci biologické léčby konkrétnímu pacientovi.

Poděkování:

Tato práce byla podpořena grantem IGA MZ ČR NR/7922-3. Autoři děkují za vynikající technickou podporu Z. Hůzlové, I. Veselé, J. Ferdanové, H. Janochové a K. Kohoutové.

RNDr. Šárka Růžičková

Biotechnologický sektor

Ústav molekulární genetiky AV ČR

Vídeňská 1083

142 20 Praha 4

e-mail: sarka.ruzickova@img.cas.cz