Rezistence k terbinafinu u Trichophyton mentagrophytes a Trichophyton rubrum: situace v České republice a ve světě

ÚVOD

Pro léčbu dermatofytózy jsou k dispozici léčiva patřící do několika různých tříd antimykotik, přičemž terbinafin je antimykotikum ze skupiny allylaminů a patří mezi léčiva první volby [25]. Terbinafin inhibuje enzym skvalen-epoxidázu (SQLE), a narušuje tak oxidaci skvalenu na skvalen-epoxid. To vede k akumulaci skvalenu, prekurzoru ergosterolu, který je nezbytný v plasmatických membránách, kde mimo jiné hraje roli při udržování její fluidity a propustnosti. Zvýšená propustnost buněčné membrány nakonec vede k buněčné smrti [35, 47].

Nárůst výskytu rezistence k terbinafinu je popisován zejména u druhů Trichophyton mentagrophytes a T. rubrum, u kterých byly stanoveny breakpointy pro rezistenci s in-vitro hodnotami 0,25 mg/l pro T. mentagrophytes a 0,125 mg/l pro T. rubrum [1]. Nárůst rezistence je v současnosti popisován zejména v Indii a jihovýchodní Asii. Problém s léčbou dermatomykóz v této oblasti existuje již zhruba od roku 2010 a vykazuje zhoršující se trend [9]. Rezistentní izoláty obvykle obsahují bodové nesynonymní mutace v genu SQLE, které vedou k záměně jedné nebo více aminokyselin. To má za následek změnu konformace vazebného místa enzymu pro léčivo a významně se tak snižuje afinita léčiva k enzymu [33, 40]. To vede k rezistentnímu fenotypovému projevu, což je možno in vitro detekovat zvýšením minimální inhibiční koncentrace (MIC) antimykotika. V jihovýchodní Asii se k léčbě dermatofytóz běžně používají nevhodné léky, např. krémy obsahující kombinaci antibiotik, antimykotik a kortikosteroidů. Pacienti se těmito přípravky často léčí sami (kombinací nevhodné formy léčiva, nedostatečné koncentrace antimykotika a nevhodného léčebného režimu), protože jsou snadno dostupné bez lékařského předpisu a za relativně nízkou cenu [45]. Mezi další obecně platné formy neadekvátní léčby, které mohou vést k rozvoji rezistence, patří nedokončení celého léčebného cyklu, nízké dávkování a nedodržování dávkovacích intervalů. Tyto faktory přispívají k selhání léčby a perzistenci původce, což vede k selekci méně citlivých kmenů [39].

Taxonomický koncept druhu T. rubrum, náležejícího do T. rubrum komplexu spolu s T. violaceum a T. soudanense, je relativně stabilní a druh je definován na základě molekulárních a fenotypových znaků [7, 12]. Taxonomie komplexu Trichophyton interdigitale/mentagrophytes je však mnohem více turbulentní a za poslední tři dekády v ní došlo k mnoha zásadním

změnám, popsaným do detailu v četných publikacích [17, 18, 31, 42]. Podle většiny současných publikací zahrnuje komplex tři hlavní druhy, jejichž hranice jsou z taxonomického pohledu umělé a nevhodně definované [42]. Jedná se o druhy T. mentagrophytes, T. interdigitale a T. indotineae [20], přičemž T. indotineae je nedávno popsaný druh, u kterého se vyskytuje vysoké procento kmenů rezistentních k terbinafinu, a je z převážné většiny zodpovědný za současnou vysokou prevalenci této rezistence v JV Asii. Jiné označení pro T. indotineae je

„ITS genotyp VIII druhu T. mentagrophytes“, což vychází z iniciativy označovat veškeré unikátní ITS genotypy v komplexu T. interdigitale/mentagrophytes/indotineae římskými číslicemi. V současnosti je známo minimálně 28 takových genotypů, přičemž pět z nich náleží druhu T. interdigitale a zbylé druhu T. mentagrophytes [22, 44]. Protože druhy T. mentagrophytes, T. interdigitale a T. indotineae nemají unikátní morfologii, ani nejsou monofyletické, bylo navrženo je všechny sloučit do druhu T. mentagrophytes s možností odlišovat jednotlivé populace jako variety: T. mentagrophytes var. mentagrophytes, T. mentagrophytes var. interdigitale a T. mentagrophytes var. indotineae [42]. V této práci následujeme toto doporučení a označujeme všechny izoláty z komplexu jako T. mentagrophytes a v případě potřeby užíváme kategorie variety pro upřesnění identifikace.

Cílem této práce je seznámit čtenáře s problematikou šíření rezistence k terbinafinu u dermatofytů, konkrétně druhů T. rubrum a T. mentagrophytes, včetně molekulárních mechanismů rezistence a prevalence rezistence k terbinafinu v České republice a ve světě. Vzhledem k rostoucímu celosvětovému trendu výskytu rezistence se tento výzkum významně dotýká klinické praxe a může ovlivnit zavedené standardy v preskripci antimykotik užívaných k léčbě dermatofytóz.

PREVALENCE REZISTENCE K TERBINAFINU VE SVĚTĚ

Uváděná prevalence rezistence k terbinafinu ve státech JV Asie a v Indii se pohybuje v širokém rozmezí od 0–76 %, což je způsobeno rozdílným zaměřením studií, které se soustředily na různé skupiny pacientů a geografické oblasti [11, 15]. Výskyt rezistence však není omezen pouze na oblast Jižní Asie, ale je stále častěji pozorován po celém světě. Jedním z možných důvodů šíření rezistence je zavlečení rezistentních kmenů turisty a imigranty z Indie, Bangladéše, Pákistánu, Saúdské Arábie nebo Thajska [19]. Značný podíl infekcí je však v evropských zemích v současné době hlášen u rezidentů, což naznačuje komunitní šíření [32]. Jednotlivé případy nebo série případů způsobených rezistentními kmeny T. rubrum nebo T. mentagrophytes byly zdokumentovány v různých evropských i mimoevropských zemích, včetně Belgie [36], Dánska [38], Francie [19], Itálie [5], Íránu [37, 43], Japonska [16, 21], Kanady [34], Německa [32], Polska [26], Ruska [28], Řecka [41], Turecka [10] a USA [13, 30]. Pouze několik málo studií však zkoumalo prevalenci rezistence u významného počtu kmenů T. rubrum nebo T. mentagrophytes v průběhu delšího časového horizontu. Například dvě studie provedené ve Švýcarsku zkoumaly vzorky od pacientů s podezřením na dermatofytózu z jednoho pracoviště v letech 2013–2016 a 2013–2021. Tyto studie ve zmíněných obdobích zjistily celkovou prevalenci rezistence k terbinafinu v rozmezí 0,92–0,97 % pro T. rubrum a 0,24–0,57 % pro T. mentagrophytes [4, 46]. Ve Francii byla provedena prospektivní multicentrická studie, do které se zapojilo sedm diagnostických laboratoří v oblasti Paříže v období od ledna do září 2021. Zjištěná prevalence rezistence dosahovala 0,23 % pro T. rubrum a 0,69 % pro T. mentagrophytes [29]. Studie provedená v Řecku v letech 2010–2019 zkoumala všechny dermatofyty odebrané v jedné laboratoři. Žádný z testovaných izolátů T. rubrum nebyl rezistentní (0/436), rezistenci však vykazovalo 25 % izolátů T. mentagrophytes (9/36). Všechny rezistentní izoláty byly identifikovány jako T. mentagrophytes var. indotineae, kdežto citlivé izoláty patřily do variet T. mentagrophytes var. interdigitale a T. mentagrophytes var. mentagrophytes [41]. Studie z USA, zaměřená na pacienty s mykózou nehtů nohou, zaznamenala prevalenci rezistence 3,6 % u T. rubrum a 4,3 % u T. mentagrophytes [15]. Další studie provedená v letech 2021–2022 v referenční laboratoři shromažďující izoláty dermatofytů z institucí v Severní Americe, zaznamenala vysokou míru rezistence 18 % pro T. rubrum (21 rezistentních izolátů ze 117) a 56 % pro T. mentagrophytes (23 rezistentních izolátů ze 41 : 1/15 T. mentagrophytes var. mentagrophytes, 1/5 T. mentagrophytes var. interdigitale a 21/21, T. mentagrophytes var. indotineae) [6]. Uváděná vysoká úroveň rezistence je v tomto případě pravděpodobně značně nadhodnocená, jelikož specializované klinické laboratoře tohoto typu často dostávají pouze kmeny s podezřením na rezistenci [27]. Podobně je tomu i v případě studie z Dánska, která během dvou let detekovala rezistenci u 31 izolátů T. rubrum z 51 zkoumaných (61 %) a 7 T. mentagrophytes z 11 zkoumaných (63 %) [3].

K celosvětově nejběžnějším typům mutací v genu SQLE u rezistentních kmenů patří mutace F397L, L393P a L393S, které ovlivňují konformaci vazebného místa enzymu pro terbinafin [38, 39, 41]. Zjištěné prevalence rezistence T. rubrum a T. mentagrophytes k terbinafinu v různých zemích včetně odhalených mutací v genu SQLE jsou shrnuty v tabulce 1.

*Minimální inhibiční koncentrace terbinafinu
1Pacienti nereagovali na předchozí léčbu terbinafinem. 2Všechny testované kmeny měly mutace v genu SQLE. 3Pacienti byli dříve léčeni antibiotiky a kortikosteroidy.

SITUACE V ČESKÉ REPUBLICE

Cílem této části je seznámit čtenáře s výsledky nedávno publikované studie zaměřené na rezistenci k terbinafinu u dermatofytů v ČR [23]. Ve studii Kolarczyková et al. byly české klinické izoláty T. mentagrophytes prospektivně sbírány v letech 2018–2021 a izoláty T. rubrum v letech 2020–2021 ze čtyř klinických institucí: Dermatovenerologická klinika Všeobecné fakultní nemocnice a 1. lékařské fakulty Univerzity Karlovy v Praze; Zdravotní ústav se sídlem v Ústí nad Labem, Praha; Zdravotní ústav se sídlem v Ostravě; Nemocnice České Budějovice. Izoláty byly získány od pacientů s různými formami dermatofytóz, především onychomykózou a tineou pedis a tineou corporis (včetně podtypů tinea faciei a tinea cruris). Izoláty byly identifikovány klinickými lékaři nebo odbornými pracovníky laboratoří na základě makromorfologie kolonií a mikromorfologických znaků jako T. rubrum nebo T. mentagrophytes/ T. interdigitale. Identifikace všech izolátů T. mentagrophytes/T. interdigitale byla ověřena sekvenováním DNA v oblasti ITS rDNA, jak je detailně popsáno ve studii [42]. Molekulární identifikace izolátů T. rubrum pomocí sekvenace byla provedena pouze u morfologicky atypických kmenů, zatímco kmeny s typickou morfologií [8, 12] byly považovány za T. rubrum. Na obrázku 1 je uveden kompletní přehled metodik použitých k detekci rezistentních kmenů a molekulárních mechanismů zodpovědných za rezistenci.

Celkem bylo ve studii shromážděno 514 kmenů T. rubrum (2020, n = 171; 2021, n = 343) a 240 kmenů T. mentagrophytes (2018, n = 32; 2019, n = 84; 2020, n = 54; 2021, n = 70). Nejčastějším typem dermatofytózy u pacientů s T. rubrum byla onychomykóza (tinea unguium) (61,5 %), následovaná tineou pedis (25 %) a tineou corporis (13,4 %). Věkový medián pacientů byl 48 let. Izoláty T. mentagrophytes byly odebrány od pacientů trpícími převážně onychomykózou (40 %), méně často tineou corporis (32,5 %) a tineou pedis (27,5 %). Věkový medián pacientů byl 47 let. Na základě molekulární identifikace pomocí ITS oblasti rDNA bylo 7 kmenů klasifikováno jako T. mentagrophytes var. indotinae (ITS genotyp VIII), 162 jako T. mentagrophytes var. interdigitale a 71 jako T. mentagrophytes var. mentagrophytes.

Všechny kmeny byly testovány na rezistenci k terbinafinu screeningovou metodou, kdy suspenze konidií každého kmenu byla inokulována na dvě jamky: jedna jamka s agarovým médiem obsahovala terbinafin o koncentraci 0,125 μg m/l a další jamka byla kontrolní bez antimykotika. U všech rezistentních izolátů a také všech izolátů klasifikovaných jako T. mentagrophytes var. indotineae byl sekvenován gen SQLE, aby bylo možno identifikovat potenciální mutace zodpovědné za rezistenci. Amplifikace byla provedena pomocí primerů a postupu publikovaného autory Kong et al. [24]. Výsledná aminokyselinová sekvence byla porovnána se sekvencemi citlivého kmene (wild type, WT) T. mentagrophytes TIMM2789 (přístupové číslo v databázi GenBank: KU242352).

Mezi 514 kmeny T. rubrum nebyly detekovány žádné kmeny vykazující rezistentní fenotyp. Naproti tomu u druhu T. mentagrophytes bylo odhaleno šest rezistentních kmenů, které byly dle ITS sekvence identifikovány jako T. mentagrophytes var. indotineae. Celková míra rezistence v letech 2018–2021 u T. mentagrophytes tedy byla 2,5 %. Tyto kmeny byly získány v letech 2019 (n = 1), 2020 (n = 4) a 2021 (n = 1), přičemž v roce 2018 nebyly zjištěny žádné rezistentní kmeny. Míra rezistence v roce 2019 tedy činila 1,2 % (1/84), v roce 2020 9,3 % (4/54) a v roce 2021 1,4 % (1/70). Kromě těchto šesti kmenů T. mentagrophytes var. indotineae s rezistentním fenotypem, byl zjištěn ještě jeden kmen této variety, který byl k terbinafinu citlivý.

Všechny kmeny T. mentagrophytes var. indotineae byly testovány metodou EUCAST E.Def 11.0 [2] za účelem stanovení přesné MIC pro několik antimykotik (tab. 2). U všech rezistentních izolátů byla MIC pro terbinafin > 4 mg/L, zatímco u citlivého kmenu (CCF 7006) byla MIC 0,008 mg/l. MIC azolových antimykotik (itrakonazolu, ketokonazolu, klotrimazolu a efinakonazolu), ciclopirox olaminu a amorolfinu byly u všech testovaných izolátů nízké, zatímco u flukonazolu se MIC pohybovaly mezi 8 a > 64 (viz tab. 2).

Šest ze sedmi izolátů T. mentagrophytes var. indotineae mělo missense mutaci F397L. U citlivého kmenu CCF 7006 nebyly nalezeny žádné mutace v genu SQLE. Informace o pacientech infikovaných kmeny T. mentagrofihytes var. indotineae jsou shrnuty v tabulce 2.

DISKUSE

Šíření rezistence k terbinafinu u dermatofytů se v posledních letech stalo celosvětovým fenoménem [39]. Nezkreslené údaje o prevalenci rezistence v dostatečně velkých souborech kmenů (zahrnujících všechny případy, nikoliv pouze suspektně rezistentní kmeny, nebo případy neodpovídající na terapii terbinafinem), jsou však dostupné pouze z několika zemí [4, 11, 14, 29, 41, 46]. Z převážné většiny evropských států však data stále chybí a do nedávna k nim patřila i Česká republika. Studie Kolarczyková et al. [23] v období 2020–2021 nezjistila u českých pacientů přítomnost terbinafinové rezistence u klinických izolátů T. rubrum [23], což odpovídá studii z Řecka [41], která u tohoto druhu taktéž nedetekovala rezistenci. Oproti tomu srovnatelné studie z Dánska, Francie, Švýcarska a USA terbinafinovou rezistenci u T. rubrum detekovaly [15, 29, 38, 41, 46] – viz tabulka 1. U T. mentagrophytes byla v ČR za období 2018–2021 zjištěna souhrnná úroveň rezistence 2,5 %, která je vyšší než úroveň rezistence zjištěná v obdobných studiích ve Švýcarsku a Francii, ale nižší než v USA, Řecku a Indii [11, 14, 32, 41] (viz tab. 1). V ČR bylo detekováno šest rezistentních kmenů T. mentagrophytes var. indotineae a u všech byla odhalena missense mutace F397L (viz tab. 2), která patří k celosvětově nejběžnějším popsaným mutacím (viz tab. 1), a je zodpovědná za vysoký stupeň rezistence k terbinafinu [3, 4, 11, 14, 41]. Tyto kmeny vykazovaly nízké MIC k amorolfinu, ciclopirox olaminu a azolovým antimykotikům s výjimkou flukonazolu, ke kterému jsou však dermatofyty většinou přirozeně rezistentní [48]. Azolová antimykotika tak představují vhodnou alternativu pro léčbu dermatofytóz při selhání terbinafinu [15].