Jednoduchá metoda k průkazu CD154 (CD40L) na lymfocytech v periferní krvi

Souhrn

Cíl práce:
Molekula CD154 (CD40L) je transmembránový glykoprotein přítomný především v aktivovaných lymfocytech T CD4+. Jeho receptorem je molekula CD40, která je v membráně lymfocytů B, ale též jiných buněk. Interakce CD154-CD40 je podmínkou optimálního rozvoje adaptivní imunitní reakce, jejím důsledkem je však i ovlivnění zánětlivého procesu. Porucha funkce CD154 je patognomická pro závažnou primární imunodeficienci – syndrom hyperimunoglobulinémie M. Odhalení abnormality CD154 je základem pro stanovení diagnózy tohoto syndromu.

Materiál a metodika:
Vypracovali jsme mikrometodu, která umožňuje průkaz CD154 na lymfocytech aktivovaných in vitro v plné krvi a srovnali ji s metodou vyšetření CD154 na izolovaných lymfocytech. Periferní heparinizovaná krev je inkubována 4 hodiny s aktivačními činidly (phorbol-myristat-acetat, ionomycin), inkubována s monoklonálními protilátkami a vyšetřena na průtokovém cytometru. Vzhledem k tomu, že v průběhu stimulace dochází ke ztrátě molekul CD4 v plazmatické membráně, jsou CD4+ lymfocyty identifikovány jako CD5+/CD8. Jejich aktivace je sledována expresí CD69. K simultánnímu hodnocení přítomnosti CD154 se používá tříbarevná průtoková cytometrie.

Výsledky:
Metodika byla aplikována u deseti zdravých dárců krve. K provedení testu stačí 0,5 ml heparinizované krve. Optimální doba aktivace, která umožňuje detegovatelnou expresi CD154 na lymfocytech T, jsou 4 hodiny. Zjistili jsme, že v průběhu této aktivace dochází ke snížení množství CD4 molekul na lymfocytech T. Hodnoty exprese CD154 jsou plně srovnatelné při použití naší metody s plnou krví i metody s izolovanými leukocyty.

Závěr:
Naše metodika k průkazu CD154 na lymfocytech aktivovaných v plné krvi je časově nenáročná, vyžaduje malé množství (0,5 ml) krve a lze ji doporučit při vstupním vyšetření dětí s podezřením na syndrom hyperimunoglobulinémie M. Umožňuje také záchyt přenašeček XHIGM.

Klíčová slova:
CD154, CD40L, CD40, syndrom hyperimunoglobulinémie M, průtoková cytometrie.

Úvod

Imunologická reaktivita je závislá na buněčných interakcích. Významné jsou interakce molekul plazmatické membrány CD40 a CD40 ligandu (CD40L, CD154). Při ní dochází prostřednictvím aktivace nukleárního faktoru kappa B ke zvýšené expresi cytokinů, chemokinů, metaloproteináz, růstových faktorů a adhezivních molekul [10, 24]. Vzájemná vazba buněčných receptorů CD40L/CD40 je nezbytná pro utváření zárodečných center v lymfatických uzlinách, proliferaci a diferenciaci paměťových B-lymfocytů do plazmatických buněk. Abnormality a nefunkčnost mohou vést k imunodeficienci, avšak nejen k ní. Byly objeveny další nové receptory pro CD154, jako jsou alfa5beta1, alfaIIbbeta3 a Mac-1 integriny, jež se uplatňují u zánětlivých procesů, včetně aterosklerózy a aterotrombózy [9, 13]. Navíc solubilní CD40L (sCD40L) uvolňovaný z krevních destiček může působit prozánětlivě, protromboticky a být rizikovým faktorem kardiovaskulárních onemocnění i metabolického syndromu [19, 23]. Také u autoimunitních onemocnění je role CD40L významná. Nezralé autoreaktivní B buňky mohou být zachráněny od apoptotické smrti signálem zprostředkovaným CD40 nebo IL-4 [8].

U hyper-IgM syndromu vázaného na X chromozom (XHIGM) není neschopnost izotypového přesmyku způsobena defektem B lymfocytů, nýbrž poruchou na úrovni T buněk. Po stimulaci T lymfocytů nedochází k funkční expresi CD40 ligandu. Tím je narušena žádoucí interakce T lymfocytů s B lymfocyty, odpovědnými za tvorbu protilátek. CD40L, membránový glykoprotein typu II, je fyziologicky exprimován na buněčném povrchu zejména CD4⁺ T buněk po aktivaci T lymfocytů. CD40L se váže na CD40 receptor, který je přítomen na B-lymfocytech i na dalších antigen prezentujících buňkách. Fyziologická aktivace B‑lymfocytů cestou CD40 receptoru umožňuje jejich proliferaci, diferenciaci, izotypový přesmyk, produkci IgA, IgG, IgE a vznik paměťových B buněk [1, 4–6, 16, 24].

Diagnóza XHIGM může být potvrzena nálezem chybějící exprese CD40 ligandu na aktivovaných CD4⁺ T lymfocytech. Vyšetření se provádí průtokovou cytometrií [3, 7, 16, 17, 22]. Je indikováno především u dětí v útlém věku. Odběr většího množství krve je proto omezen, získání dostatečného počtu izolovaných mononukleárních buněk periferní krve je obtížně realizovatelné.

V tomto sdělení porovnáváme spolehlivou úspornou praktickou metodu z 0,5 ml plné krve pro vyšetření exprese CD40L na CD4⁺ T lymfocytech s vyšetřením exprese CD40L na izolovaných buňkách.

Materiál a metoda

Buněčné kultury, separace buněk

Periferní krev dárců (n = 10) byla odebrána venepunkcí do heparinizovaných zkumavek (Vacutainer System Blood Collection Set; Becton Dickinson, Francie). Pro izolaci mononukleárních buněk byla krev naředěna ve fyziologickém roztoku (PBS, Life Technologies, Paisley, Skotsko). Mononukleární buňky (MNC) byly separovány metodou hustotního gradientu (Lymphoprep; Nycomed Pharma AS, Oslo, Norsko), 3krát promyty v PBS a resuspendovány v kultivačním médiu (RPMI 1640 Medium; Life Technologies) obohaceném 10% inaktivovaným (56 °C, 30 min.) fetálním telecím sérem (FCS; HyClone, Logan, UT), 2 mM L-glutaminem (Life Technologies), 100 U/ml penicillinem a 100 μg/ml stereptomycinem (Life Technologies).

Při vyšetření exprese CD40 ligandu (CD154) na CD4⁺ (CD5⁺CD8^-) T-lymfocytech v plné krvi byla periferní krev naředěna 1 : 20 v kultivačním RPMI mediu doplněným 2 mM L-glutaminem, penicillinem (100 U/ml) a streptomycinem (100 μg/ml).

Aktivace buněk

Izolované MNC (2x10⁶/ml/jamka) a v médiu naředěná plná krev (1 : 20; 1 ml inkubován v kultivační jamce) byly v kvadruplikátech nasazeny do kultivační destičky s 24 jamkami (Tissue Culture Plate 24-Well; Sarstedt, Newton, NC) a uloženy do inkubátoru s 95% vlhkostí, 5 % CO₂ a teplotou 37 °C. Buněčné kultury byly stimulovány phorbol 12-myristát 13-acetátem (PMA, 20 ng/ml; Sigma-Aldrich, Praha, ČR) a ionomycinem (IM, 1 μg/ml; Calbiochem, San Diego, CA) po dobu 4 hodin. Paralelně byly buňky inkubovány jen v médiu samotném (negativní kontrola). Po ukončení kultivace byly buněčné kultury z jamek odebrány, promyty v PBS a připraveny k imunofluorescenčnímu barvení.

Imunofenotypizace a vyšetření exprese CD40 ligandu

K imunofenotypizaci byly použity značené monoklonální protilátky: anti - CD3, CD4, CD5 (PE konjugované), CD8 (PerCP konjugované), CD69 (FITC konjugované) (vše Becton Dickinson, Hamburg, Německo) a CD154 (anti-CD40L/FITC; Ancell, Bayport, MN). Imunofluorescenční barvení bylo provedeno standardním způsobem běžným pro izolované buňky a pro plnou krev. Při barvení lymfocytů kultivovaných v plné krvi byl pro lýzu erytrocytů využit lyzátor Coulter Q-Prep (Coulter – Immunotech Diagnostics, Krefeld, Německo) a vlastní lýza provedena 0,1 % kyselinou mravenčí. Exprese CD40 ligandu byla studována na CD5⁺CD8^- (CD4⁺) T lymfocytech. Imunofluorescence byla vyhodnocena průtokovým cytometrem Coulter Epics XL (Coulter – Immunotech Diagnostics). Data byla zpracována pomocí EXPO Analysis Software v.2.

Výsledky

Stanovení populace aktivovaných CD4+ T lymfocytů

CD40 ligand (CD40L, CD154) je exprimován na povrchu aktivovaných T lymfocytů, zejména na pomocných CD4⁺ T lymfocytech [17, 22, 24]. Vyšetření CD40L je proto nutné provést na aktivovaných buňkách. Při optimální aktivaci lymfocytů v buněčné kultuře přímým aktivátorem proteinkinázy C phorbol 12-myristát 13-acetátem (PMA) v kombinaci s kalciovým ionoforem ionomycinem (IM) však dochází k výraznému snížení exprese CD4 znaku u aktivovaných T lymfocytů (obr. 1). MNC buňky byly stimulovány 4 hodiny s PMA a IM. Přítomnost CD4 molekul na membráně byla stanovena jak na aktivovaných T lymfocytech, tak na lymfocytech kultivovaných v médiu bez stimulace (negativní kontrola). Současně byla vyšetřena přítomnost molekuly CD69, dokládající časnou aktivaci lymfocytů (obr. 1). Výsledek optimální stimulace vykazuje signifikantní modulaci exprese CD4 molekul u aktivovaných T buněk v řádu desítek procent (viz obr. 1, znak CD4: Medium 58 % vs PMA plus IM 9 %). Vyšetřování exprese CD40L na aktivovaných CD4⁺ T lymfocytech za použití anti-CD4 protilátek by proto mohlo vést k nesprávné interpretaci a ke zkresleným výsledkům.

CD4⁺ T lymfocyty lze vymezit také kombinací znaků CD5 a CD8. CD5 receptor se vyskytuje na všech T lymfocytech, CD5⁺CD8^- lymfocyty periferní krve jsou převážně CD4⁺ T lymfocyty. Obrázek 2 dokládá stabilitu membránových receptorů CD5 a CD8 u buněčné populace lymfocytů stimulovaných PMA a IM, přítomnost znaku CD69 je kontrolou aktivace buněk. Stabilita znaků charakterizujících celou populaci CD4⁺ T buněk po optimální aktivaci je nezbytným předpokladem správného vyšetření exprese CD40L.

Vyšetření exprese CD40L na CD5+CD8- lymfocytech

V dřívější studii jsme provedli podrobné vyšetření kinetiky (0–16 hod.) pro stanovení doby optimální stimulace a expresi CD40L, s charakteristikou procentuálního zastoupení CD40L pozitivních buněk, intenzity exprese CD40L na povrchu CD4⁺ Tlymfocytů i genové exprese gp39 (CD40L) u různých buněčných aktivátorů [22]. Jak potvrzují výsledky na obrázku 3a u in vitro stimulovaných izolovaných MNC, je pro diagnostickou praxi 4hodinová aktivace a stimulace PMA plus IM v optimálních koncentracích vyhovující. Exprese CD40L (CD154) je vyhodnocována na CD5⁺CD8^- lymfocytech, znak CD69 je pozitivní kontrolou buněčné aktivace.

Současně jsme v nynější studii s vyšetřováním izolovaných MNC in vitro provedli testy aktivace buněk plné krve a vyhodnotili expresi CD40L na CD5⁺CD8^- lymfocytech při optimální stimulaci PMA plus IM (obr. 3b). Senzitivita metody vyšetření exprese CD40L na lymfocytech z plné krve je srovnatelná s vyšetřením izolovaných buněk (obr. 3, tab. 1).

Porovnání exprese CD40L na aktivovaných lymfocytech v plné krvi a na izolovaných MNC

V tabulce 1 jsou u skupiny 10 dárců shrnuty výsledky aktivace T lymfocytů a exprese CD40L v plné krvi s nálezy na izolovaných buňkách. Výsledky porovnávaných vyšetřovacích metod jsou naprosto srovnatelné, a to jak v parametrech maximální buněčné aktivace po stimulaci PMA plus IM (znak CD69), tak vystavení molekul CD154 na CD4⁺ T lymfocytech. Pro studium exprese CD40L a z důvodu závažnosti diagnózy XHIGM je prakticky významné, že v případě dostatečného množství krve lze u pacientů provést nejprve vyšetření z 0,5 ml plné krve a získat závěry provedeného vyšetření ještě v den odběru (doba stimulace 4 hodiny). Paralelně izolované MNC buňky mohou být ponechány v buněčné kultuře bez stimulace přes noc a pro konfirmaci získaných výsledků z plné krve aktivovány PMA s IM následující den.

Záchyt přenašeček XHIGM metodou vlné krvi

Obrázek 4 dokumentuje expresi CD40L (CD154) u matky a její dospělé dcery vodině, víž další dva sourozenci, bratři vyšetřované dcery, zemřeli vtlém dětství. Exprese CD40L na aktivovaných T-lymfocytech je u dcery i u její matky redukována vorovnání se zdravou kontrolou. Na základě výsledků vyšetření exprese CD40L na aktivovaných lymfocytech vlné krvi byla provedena genetická analýza. U obou žen potvrdila stejnou mutaci venu pro CD40L, vázaného na X chromozom.

Diskuse

Hyper-IgM syndrom (HIGM) se manifestuje v útlém věku, zejména u chlapců jako onemocnění vázané na X chromozom (jedná se přibližně o 70 % případů HIGM), vyskytují se však také formy s autosomálně recesivní i autosomálně dominantní dědičností, jakož i formy získané [1, 4–6, 14–16, 20, 24]. Intenzivní studium X-chromozomálně vázané formy hyper-IgM syndromu (XHIGM) vedlo k objasnění molekulární podstaty tohoto onemocnění v roce 1993. Byly nalezeny mutace genu pro CD40 ligand (gp39, CD40L, CD154), lokalizovaného na X-chromozomu, vedoucí k poruše exprese a funkce CD40L na T lymfocytech [1, 2, 11]. Proto je diagnóza X-vázaného hyper-IgM syndromu nejčastěji prokázána nepřítomností CD40L na aktivovaných CD4⁺ T buňkách pacienta.

Při laboratorním vyšetření a jeho správné interpretaci je potřeba vzít v úvahu řadu kritických faktorů. Aktivace CD4⁺ T buněk u vyšetřované osoby musí být dostatečná a stimulace lymfocytů optimální. Z tohoto důvodu je nezbytné v testu vždy sledovat kontrolní nezávislý aktivační znak, jímž může být po optimální stimulaci PMA plus ionomycin molekula CD69 [17, 22]. Při této silné aktivaci však dochází k modulaci povrchových znaků T lymfocytů, zejména CD4 (viz obr. 1), avšak také CD3 [18, 21, 22]. Není proto vhodné znaky CD4 a CD3 používat k definování aktivovaných CD4⁺ T lymfocytů. Jako výhodná a stabilní se prokázala kombinace znaků CD5 se znakem CD8 umožňující definování cílové populace aktivovaných, zejména CD4⁺ T buněk průtokovým cytometrem jako CD5⁺CD8^- lymfocytární populaci. I když se jedná o více kombinací protilátek, moderní cytometry tato vyšetření bez problémů umožňují zvládnout. Tato kombinace se jeví vhodná také z důvodů využití aktivace přes TCR/CD3 v případě jiných aplikací vyšetření, jako může být vyšetření pacientů s běžnou variabilní imunodeficiencí (CVID) [7, 22] i diferenciální diagnostická rozvaha CVID vs XHIGM [4, 7, 16, 22]. V dalších aplikacích může připadat do úvahy také stanovení reaktivity buněk pacientů po transplantaci [3, 24].

Vyšetření CD40L bylo v naší studii metodicky porovnáno na úrovni aktivace lymfocytů v plné krvi a u izolovaných MNC buněk. Oba testy jsou plně srovnatelné. Velkou výhodou u plné krve je spotřeba zcela minimálního množství krve pro vyšetření (0,5 ml), což je důležité pro diagnostiku u dětských pacientů. Současně však v případě dostatečného odběru krve může sloužit vyšetření CD40L na izolovaných buňkách ke konfirmaci nálezu v plné krvi, neboť metodicky je možné izolované buňky uchovat v buněčné kultuře bez stimulace v inkubátoru přes noc a aktivovat PMA s IM až následně druhý den. Optimální doba stimulace je v našem testu 4 hodiny. Tato rychlá možnost konfirmace výsledku je u závažných diagnóz, jako je XHIGM, zásadní.

Uvedená vyšetření využíváme v komplexní diagnostice pacientů se suspektním XHIGM a přispěly k záchytu pacientů s HIGM v ČR [Národní databáze primárních imunodeficiencí ČR; 12, 14, 15]. U chlapců s hyper-IgM syndromem je tímto způsobem také možné odlišit X-vázanou formu od autozomální formy HIGM [4, 5]. Nezávisle byl dalšími autory v modifikaci test plné krve použit i pro záchyt přenašeček XHIM [3, 17], u nichž lze na aktivovaných buňkách fenotypově nalézt částečně pozitivitu exprese CD40L z důvodu přítomnosti buněčných populací s mutovanou i nemutovanou CD40L [17]. Test však není vhodný u novorozenců, kde je fyziologicky exprese CD40L na aktivovaných T lymfocytech redukována.

Při interpretaci výsledku fenotypového vyšetření CD40L na aktivovaných CD4⁺ T lymfocytech je při zachování všech kritických předpokladů zásadní negativní nález exprese CD154 [17, 22]. Podporuje diagnózu XHIGM. I v případě pozitivity však může vzácně nastat situace, kdy se jak monoklonální protilátky, tak chimerická molekula CD40-Ig dokáží navázat na nefunkční molekulu CD40L. Tyto případy se mohou vyskytnout zejména u pacientů s missense mutacemi. V ČR jsme se s touto vzácnou situací setkali u jednoho pacienta [Thon, Litzman – Národní databáze primárních imunodeficiencí ČR]. Jednalo se o bodovou mutaci (G697C), jež vedla k záměně aminokyseliny na 226 pozici (G226R). V těchto nejasných případech je pro definitivní diagnózu nezbytná mutační analýza lokusu CD40L/TNFSF5.

Vypracovanou metodu k posouzení exprese CD40L (CD154) v plné krvi na průtokovém cytometru doporučujeme k diagnostickému vyšetření pacientů se suspektním XHIGM ve specializovaných laboratořích vybavených pro práci s buněčnými kulturami jako screeningovou. Její výsledky jsou srovnatelné s metodou vyšetření na izolovaných buňkách. Domníváme se, že perspektivně může přispět také při monitorování kardiovaskulárních a zánětlivých onemocnění, včetně vyhodnocování účinků potenciální terapie anti-CD154 protilátkami při prevenci komplikací asociovaných s aterosklerózou [9].

Podpořeno grantem IGA Ministerstva zdravotnictví ČR NR 9035-4.

MUDr. Vojtěch Thon, Ph.D.
Ústav klinické imunologie a alergologie LF MU
FN u sv. Anny
Pekařská 53
656 91 Brno
e-mail: vojtech.thon@fnusa.cz