Nádorová hypoxia –  molekulárne mechanizmy a klinický význam

Souhrn

Kyslík je absolútne nevyhnutný pre fungovanie živých organizmov a zmeny v jeho koncentrácii majú dramatické následky. V nádorovom tkanive zohráva kyslík významnú úlohu v produkcii energie a modulácii oxidačno- redukčnej rovnováhy. Výsledkom jeho nedostatočnej hladiny je hypoxia, ktorá predstavuje charakteristickú črtu nádorového mikroprostredia. Kľúčovým koordinátorom odpovede na hypoxiu na bunkovej úrovni je hypoxiou- indukovaný transkripčný faktor, ktorý reguluje expresiu viac ako stovky génov zapojených do významných bunkových procesov. Z klinického hľadiska sú fenotypové zmeny navodené hypoxiou veľmi závažné. Nádorová hypoxia je asociovaná s rezistenciou voči terapii, progresiou a rekurenciou ochorenia ako aj so zvýšenou mortalitou. Preto intratumorová hypoxia predstavuje vážny terapeutický problém a jej detekcia môže prispieť k zlepšeniu stratifikácie pacientov pre vhodnú terapiu. V súčasnej dobe dostupné stratégie zamerané na detekciu hypoxie v nádorovom tkanive prinášajú pomerne dosť limitácií, napr. invazívnosť, nedostupnosť tkaniva, nízku citlivosť, nepresnú interpretáciu a pod. Na druhej strane sa však ponúka využitie endogénnych markerov hypoxie, ktorých detekcia prostredníctvom imunohistochémie je pomerne ľahká, dostupná, reprodukovateľná a použiteľná nielen prospektívne, ale aj retrospektívne na archivovaných vzorkách tkanív. Patrí medzi ne napr. karbonická anhydráza IX (CA IX), ktorá v súčasnosti predstavuje jeden z prominentných indikátorov chronickej hypoxie v nádoroch. Hypoxiou- indukované proteíny (vrátane CA IX) sú zároveň aj potenciálnymi terčami protinádorovej terapie a ich praktické využitie je predmetom intenzívneho výskumu.

Kľúčové slová:
hypoxia –  nádorové mikroprostredie –  hypoxiou- indukovaný faktor –  rezistencia –  karbonická anhydráza IX

Úvod

Hypoxia ako súčasť nádorového mikroprostredia a charakteristika pevných nádorov bola po prvýkrát popísaná pred viac ako 60 rokmi. Pomerne rýchlo bolo zrejmé, že bude predstavovať vážny klinický problém spojený s neúčinnou terapiou. Hoci sa za posledné obdobie podarilo prostredníctvom mnohých klinických a experimentálnych štúdií prispieť k pochopeniu hypoxie a jej vplyvu na bunkovej/ molekulárnej úrovni, cielená terapia hypoxických nádorov zostáva naďalej otvorená.

Termín hypoxia používame na označenie situácie s nedostatočnou hladinou kyslíka, ktorá nastáva nielen v nádoroch, ale aj v zdravých tkanivách a v ranách. Naproti tomu normálna hladina kyslíka v tkanivách je označovaná ako tkanivová normoxia, resp. physioxia a jej hladina je medzi tkanivami značne variabilná. Kým v prípade obličky bola dokázaná hladina kyslíka na úrovni 9,5 ± 2,6 % O₂, tak v prípade mozgu je to hodnota 4,4 ± 0,3 % O₂ [1].

Hypoxia rôzneho stupňa je charakteristická pre väčšinu pevných nádorov. Prispieva k nej mnoho rôznych faktorov vrátane rýchleho rastu nádorovej masy a jej nedostatočnej vaskularizácie. Je známe, že aj v rámci konkrétneho nádora je situácia veľmi heterogénna, a tak odlišujeme miesta s miernou hypoxiou (≤ 2 % O₂) od miest so striktnou hypoxiou (< 0,1 % O₂). Pritom pre vyjadrenie hladiny koncentrácie kyslíka sa najčastejšie v medicíne používa buď milimeter ortuťového stĺpca (1 mmHg = 0,13 % O₂ 133,322 Pa) alebo percento (1 % O₂ = 7,6 mmHg, 1 013 kPa) [1]. Okrem toho dochádza v tkanive často aj k striedaniu fázy hypoxie s fázou reoxygenácie.

K vzniku hypoxie dochádza v dôsledku proliferácie nádorových buniek, ktoré sa dostanú do vzdialenosti prekračujúcej difúznu kapacitu kyslíka z najbližšej cievy (100– 150 µm) a sú nedostatočne zásobované kyslíkom a nutričnými látkami. Okrem toho cievny systém nádorového tkaniva je veľmi nedokonalý, vytvára množstvo slepých zakončení, obštrukcií a nefunkčných arterio- venóznych prepojení, čím prispieva k narastajúcej absencii kyslíka a živín v tkanive ako aj k vytváraniu nádorového mikrosprostredia s nižším pH [2]. Dlhodobá existencia hypoxie v nádorovom tkanive má za následok odumieranie buniek a vznik nekrotických oblastí obklopených prežívajúcimi adaptabilnými bunkami.

Adaptácia buniek na hypoxiu

Hypoxia predstavuje nepriaznivý faktor, ktorý v mnohých situáciach môže viesť k bunkovej smrti. Avšak práve v dôsledku adaptácie na hypoxiu dokážu mnohé bunky prežiť aj spomínané nepriaznivé podmienky. V procese adaptácie na hypoxiu sa spúšťa kaskáda rôznych zmien v génovej expresii a metabolizme s cieľom eliminovať stres vyvolaný hypoxiou a umožniť prežívanie nádorových buniek (obr. 1A). Výsledkom toho je tzv. tolerancia hypoxie, ktorá výrazne prispieva k rozvoju karcinogenézy a k rezistencii na rádioterapiu a chemoterapiu [3]. Jedným z prvých adaptačných mechanizmov na hypoxiu je inhibícia bunkovej smrti. Okrem toho dochádza k indukcii angiogenézy s cieľom zvýšiť okysličenie nádorových buniek. Hypoxické nádorové bunky nadobúdajú tzv. onkogénny metabolizmus a podliehajú s vyššou frekvenciou mutáciám. Významný je aj vplyv hypoxie na schopnosť buniek invadovať a metastázovať. Hypoxia tak vytvára selekčný tlak v prospech klonálnej expanzie nádorových buniek s agresívnejším fenotypom [4].

Signálna dráha indukovaná hypoxiou a hypoxiou-idukovaný faktor

Kľúčovú pozíciu pri reakcii na zníženú dostupnosť kyslíka na molekulovej úrovni má hypoxiou-indukovaný faktor (HIF), ktorý spúšťa expresiu cieľových génov nevyhnutných pre prežitie buniek [5]. HIF je transkripčný faktor regulujúci expresiu génov zodpovedných za reakciu bunky na hypoxické prostredie. Je to heterodimér tvorený z dvoch podjednotiek, z konštitutívne exprimovanej β-podjednotky (označovanej HIF- β, resp. ARNT) a z regulovateľnej α-podjednotky, ktorej stabilita a transkripčná aktivita závisí od koncentrácie kyslíka. Podjednotka α sa nachádza v troch izoformách, HIF- 1α, HIF- 2α (inak známa ako EPAS- endoteliálny proteín s PAS doménou) a HIF- 3α [6].

Regulácia stability a aktivity transkripčného faktora HIF- 1

Transkripcia génu HIF- 1α je závislá predovšetkým na aktivite transkripčného faktora SP1. Avšak v promótorovej oblasti génu HIF- 1α sú prítomné väzbové miesta aj pre iné transkripčné faktory, ako napr. AP- 1, NF- 1, NF-κB. V podmienkach hypoxie je účinnosť translácie proteínu HIF- 1α zaručená prostredníctvom existencie IRES (internal ribosome entry site) sekvencie v 5’- neprekladanej oblasti [7].

Prolyl- a asparaginylhydroxylácia a ubikvitinácia

K degradácii podjednotky HIF- 1α v normoxických podmienkach dochádza prostredníctvom degradačnej domény závislej od kyslíka (oxygen- dependent degradation domain –  ODD) [8]. V ODD doméne sú dva prolylové zvyšky (Pro⁵⁶⁴ a Pro⁴⁰²), ktoré sú hydroxylované enzýmami s prolyl hydroxylázovou doménou (prolyl hydroxylase domain –  PHD), pričom k spomínanej reakcii dochádza v závislosti od kyslíka a iónov železa (Fe²⁺) [9,10]. Doposiaľ boli identifikované tri prolyl hydroxylázy závislé na 2- oxoglutaráte (PHD1, PHD2 a PHD3), ktorých aktivita je v podmienkach buď hypoxie alebo pri nahradení Fe²⁺ alebo 2- oxoglutarátu potlačená, čo vedie k stabilizácii HIF-1 α podjednotky [11]. Štúdie založené na RNA interferencii odhalili, že vo väčšine buniek je pre aktiváciu proteínu HIF postačujúce potlačenie aktivity PHD2 [12,13]. Za normálnych okolností je vo väčšine buniek dominantný enzým PHD2, avšak v podmienkach so zvýšenou expresiou PHD1 (napr. v odpovedi na stimuláciu hormónmi) alebo PHD3 (napr. pri predĺženom trvaní hypoxie) dochádza k posilneniu ich funkcie v rámci hydroxylácie podjednotky HIF- 1α [13].

Pri degradácii podjednotky HIF- 1α sú hydroxylované prolíny rozpoznávané nádorovým supresorovým proteínom von Hippel- Lindau (VHL), ktorý sa spolu s elongínom B a C, Cullinom 2 a Rbx podieľa na vytvorení funkčnej E3 ubikvitín ligázy (pVHL-elonginB- elenginC- Cul2- Rbx) ubikvitinujúcej podjednotku HIF- 1α pred následnou degradáciou v proteazóme (obr. 1B) [14]. K degradácii podjednotky HIF- 1α v normoxii dochádza za menej ako 5 minút. Proteín HIF- 1α má okrem bHLH/ PAS a ODD domény aj transaktivačnú doménu (N- TAD t.j. N-terminálnu resp. C- TAD t.j. C-terminálnu) [15]. V rámci C- TAD domény dochádza k hydroxylácii asparagínových zvyškov (Asn⁸⁰³) prostredníctvom asparaginyl hydroxylázy závislej na 2- oxoglutaráte (inak označovanej ako FIH –  faktor inhibujúci HIF). Spomínaná hydroxylácia bráni naviazaniu sa ko- aktivátorov CBP (CREB- väzbový proteín) a p300, čím dochádza k inhibícii transaktivácie HIF- 1α v normoxických podmienkach [7,16].

V hypoxii sú enzýmy PHD aj FIH v dôsledku nízkej hladiny O₂ inaktivované, čo má za následok stabilizáciu podjednotky HIF- 1α, jej translokáciu do jadra a dimerizáciu s podjednotkou HIF- 1β. Takto vytvorený komplex HIF- 1 sa spolu s ko- aktivátormi (CBP/ p300, Ref- 1, SRC- 1, TIF2) viaže na hypoxické responzívne elementy (HRE- hypoxia response element; 5’- G/ ACGTG- 3’) nachádzajúce sa v promótorových, resp. enhancerových oblastiach jednotlivých hypoxiou- regulovaných cieľových génov a spúšťa ich transkripciu (obr. 1B). Najznámejšie cieľové gény sú zahrnuté vo viacerých významných procesoch, akými sú glykolýza, erytropoéza a angiogenéza [17,18].

Fosforylácia

Fosforylácia podjednotky HIF- 1α je realizovaná prostredníctvom p42/ p44 a p38 kináz. Vzhľadom na osem serínových zvyškov v HIF- 1α, ktoré môžu byť fosforylované prostredníctvom mitogénom- aktivovanej proteín kinázy (mitogen-activated protein kinases –  MAPK), platí, že aktivovaná MAPK signálna dráha vedie k zvýšenej transkripčnej aktivite komplexu HIF- 1 [19]. Transaktivačná funkcia komplexu HIF- 1 je zvýšená nielen v dôsledku preferenčne zvýšenej väzby HIF- β k fosforylovanej α- podjednotke, ale aj v dôsledku toho, že fosforylácia Thr⁷⁹⁶ bráni hydroxylácii Asn⁸⁰³ prostredníctvom proteínu FIH [20,21].

Okrem horeuvedených modifikácií bola vo vzťahu k regulácii stability a aktivity proteínu HIF- 1α popísaná aj lyzínacetylácia, nitrozylácia a sumoylácia [22– 24].

Ostatné izoformy α- podjednotky proteínu HIF

Vzhľadom na podobnú štruktúru a aminokyselinovú sekvenciu medzi podjednotkami HIF- 1α a HIF- 2α je zrejmé, že budú mať aj podobné mechanizmy regulácie. Okrem toho však existujú aj rozdiely, napr. v distribúcii jednotlivých izoforiem. Kým HIF- 1α mRNA je exprimovaná vo väčšine ľudských tkanív, tak expresia HIF- 2α je obmedzená a skôr špecifická pre endotelové bunky [25].

Podjednotka HIF- 3α je v hypoxických podmienkach schopná rovnako ako ostatné dve izoformy dimerizácie s β- podjednotkou a následnej transaktivácie cieľových génov [26]. Doposiaľ bolo identifikovaných niekoľko skrátených variantov HIF- 3α vznikajúcich v dôsledku zostrihu (splicingu). Z nich najviac charakterizovaný je tzv. inhibičný proteín s PAS doménou (IPAS), ktorý je skrátený o časť nachádzajúcu sa za PAS B doménou. Vzhľadom na chýbajúce domény (ODD a TAD) nie je IPAS schopný transaktivácie cieľových génov. Jeho expresia však môže byť v hypoxických podmienkach zvýšená prostredníctvom HIF- 1α transaktivácie. Naproti tomu bolo pozorované, že IPAS má dominantne negatívny vplyv na HIF- 1α, čo naznačuje existenciu negatívnej spätnej väzby [27].

Hypoxiou-indukované cieľové gény a ich úloha v bunke

S ohľadom na in vivo rozdiely medzi jednotlivými bunkami a tkanivami, ktoré sa na zmeny v dostupnosti kyslíka musia nevyhnutne adaptovať, nie je vôbec prekvapivé, že dôsledky vyvolané aktiváciou transkripčného komplexu HIF sa od bunky k bunke líšia. Jednou z foriem adaptácie nádorových buniek na hypoxiu je pomerne rýchle zníženie syntézy proteínov (až na úroveň 30– 40 % normálnej hladiny), nakoľko proteosyntéza predstavuje energeticky náročný proces, ktorý je pre bunku v takto obmedzených podmienkach neudržateľný (obr. 1A) [3]. Na druhej strane napriek zníženej hladine proteosyntézy existuje skupina proteínov, ktorých hladina je v podmienkach hypoxie indukovaná.

V dnešnej dobe je známa viac ako stovka cieľových génov, ktoré sú rozpoznávané transkripčným komplexom HIF a ktoré sa podieľajú na erytropoéze, angiogenéze a metabolizme glukózy [28,29]. Najstarší a najviac preskúmaný mechanizmus regulácie transkripcie v podmienkach hypoxie je známy pre hormón erytropoetín (EPO) produkovaný prevažne v obličke a nevyhnutný pre erytropoézu [30]. V podmienkach s nízkou hladinou kyslíka je indukovaná expresia EPO, ktorá vedie k zvýšenej tvorbe červených krviniek v snahe zachovať homeostázu dostatočným prísunom kyslíka do tkanív. Hypoxia indukuje aj expresiu vaskulárneho endotelového rastového faktora (VEGF) a jeho receptora (VEGFR), ktoré sa zúčastňujú na angiogenéze a stimulujú proliferáciu endotelových buniek. Okrem toho je cirkulácia krvi regulovaná cievnym tlakom prostredníctvom produkcie: NO (NO syntázou –  iNOS), CO (hém oxygenázou 1 –  HO- 1), endotelínu (ET- 1), adrenomedulínu (ADM) a α1_B-adrenergného receptora. V hypoxii dochádza aj k zvýšenej expresii proteínov, akými sú matrixová metaloproteináza (MMP), inhibítor plazminogénového aktivátora (PAI) a angiopoetín [28].

Expresia génov erytropoézy a angiogenézy je zahrnutá v celkovej a systémovej odpovedi organizmu na hypoxiu. Okrem toho však prebiehajú aj reakcie na úrovni bunky. Jednou z nich je prepnutie bunky z aeróbneho na anaeróbny metabolizmus. Spomínaný efekt, ktorý zahŕňa zníženie oxidačnej fosforylácie a zvýšenie anaeróbnej glykolýzy, bol po prvýkrát popísaný Pasteurom. V dôsledku anaeróbnej glykolýzy je však hladina vytvoreného ATP nedostatočná. Z dôvodu zvýšeného príjmu glukózy do bunky je indukovaná expresia glukózových transportérov (GLUT1 a GLUT3). Okrem toho však dochádza aj k indukcii a zvýšenej aktivite glykolytických enzýmov (napr. hexokináza 1/ 2 –  HK1/ 2, laktát dehydrogenáza A –  LDHA, pyruvát dehydrogenáza kináza 1 –  PDK1). Ich expresia je regulovaná práve prostredníctvom komplexu HIF- 1 a v procese adaptácie bunky na hypoxické prostredie [31,32].

V hypoxii pozorujeme okrem zmien v metabolizme buniek aj iné javy. Jedným z nich je acidóza, ktorá v nádorových bunkách spôsobuje kyslejšie extracelulárne pH oproti extracelulárnemu pH v zdravom tkanive. Naproti tomu hodnoty intracelulárneho pH sú medzi nádorovými a zdravými bunkami porovnateľné. Stabilné intracelulárne pH je pre každú bunku nevyhnutné. K jeho udržiavaniu prispieva expresia viacerých membránových transportérov a výmenníkov, medzi ktoré patria napr. monokarboxylátový transportér (MCT4) alebo sodíkovo- vodíkový výmenník (NHE1). Do skupiny hypoxiou- indukovaných génov, ktorých produkty sa podieľajú na regulácii pH, patrí aj membránová karbonická anhydráza IX (CA IX). V podmienkach hypoxie dochádza okrem doposiaľ spomínaných génov aj k indukcii expresie génov zodpovedných za bunkovú proliferáciu, adhéziu, invazívnosť a i. [33].

Nádorová hypoxia a jej klinický význam

Na základe mnohých klinických štúdií je zrejmé, že hypoxické nádory sú rezistentnejšie voči dostupnej protinádorovej terapii, vrátane rádio-  a chemoterapie [34]. K chemorezistencii dochádza nielen na základe faktu, že aplikované chemoterapeutiká sú vzhľadom k nedostatočnej cievnej sieti neefektívne doručované do hypoxických oblastí nádorov, ale aj kvôli zníženej proliferačnej aktivite hypoxických buniek a zníženej apoptóze (v dôsledku mutácie p53) (obr. 1C) [35]. K chemorezistencii prispieva tiež hypoxiou- indukovaná expresia génu mnohopočetnej liekovej rezistenice (MDR1), v promótorovej oblasti ktorého sa nachádza funkčné HRE miesto a produktom ktorého je P- glykoproteín [36]. Takto rezistentné bunky nie sú prostredníctvom konvenčnej chemoterapie efektívne eliminované.

Nádorová hypoxia predstavuje vážny problém aj z hľadiska rádioterapie. Pacienti s hypoxickými nádormi dosahujú oveľa horšie liečebné výsledky s celkovo kratšou dobou prežívania. Fenomén rádiorezistencie bol po prvýkrát popísaný v roku 1955 Thomlinsonom a Grayom, ktorí odhalili prítomnosť hypoxických nádorových buniek v malígnych nádoroch [37]. Rádiosenzitivita tkanív je založená na fakte, že dobre okysličené tkanivá sú senzitívnejšie na letálny efekt ionizujúceho žiarenia nakoľko molekuly kyslíka reagujú s vznikajúcimi voľnými radikálmi v miestach poškodenia DNA a fixujú ich, v dôsledku čoho dochádza k bunkovej smrti. Výsledkom nedostatočnej hladiny kyslíka je až trojnásobne vyššia rezistencia hypoxických buniek voči rádioterapii v porovnaní so situáciou v normoxii.

Súčasné chemo-  a rádioterapeutické prístupy sú v dôsledku hypoxiou-indukovanej rezistencie schopné dostatočne a účinne eliminovať len senzitívne nádorové bunky. Rezistentné bunky sú ochránené a následne poskytujú základ pre relaps ochorenia a vznik nových nádorov a metastáz, ktoré sú malígnejšie, invazívnejšie a rezistentnejšie, čím sa prognóza pacienta výrazne zhoršuje. Preto sa do pozornosti dostávajú nové stratégie, ktoré by prispeli k riešeniu spomínaného problému. V prípade rádioterapie sa využíva zvýšenie oxygenácie tumoru (prostredníctvom hyperbarickej oxygenácie, transfúzie a aplikácie erytropoetínu) a frakcionovaná rádioterapia. Prínosom frakcionácie je dosiahnutie vyváženého účinku rádioterapie, t.j. maximálny biologický účinok na nádorové bunky a súčasne minimálny účinok na zdravé tkanivo [38]. V prípade chemoterapie sa ako riešením javí využitie metronomickej chemoterapie, ktorá je založená na dlhodobom podávaní nízkych dávok chemoterapie. Na rozdiel od konvenčnej chemoterapie je účinnejšia a dobre tolerovaná [39].

V súvislosti s rezistenciou na terapiu sa v súčasnej dobe do pozornosti dostáva aj problematika nádorových kmeňových buniek, ktoré sa podieľajú na raste a udržiavaní nádorov a prispievajú k rekurencii nádorového ochorenia po terapii [40]. Hypoxia prispieva k dediferenciácii nádorových buniek ako aj k navodeniu a udržiavaniu kmeňového fenotypu. Hoci mechanizmy a signálne dráhy ovplyvňujúce hypoxiu a nádorové kmeňové bunky nie sú úplne objasnené, výsledky výskumu poukazujú na interakciu medzi transkripčným faktorom HIF- 1α a trankripčnými faktormi zodpovednými za fenotyp kmeňových buniek, napr. Sox2, Klf4, c- Myc, Oct4 a Nanog ako aj signálnymi dráhami napr. Notch, Wnt alebo Smad/ TGFβ, ktoré sú zodpovedné za proliferáciu a diferenciáciu buniek [41– 43].

Okrem spomínanej rezistencie voči konvenčným protinádorovým stratégiám je existencia hypoxie spojená aj s horšou prognózou z pohľadu chirurgického riešenia ochorenia. Hlavnou príčinou je predovšetkým fakt, že hypoxické nádory majú predispozíciu k získaniu metastatického fenotypu a invazívnosti, a pre nádorové bunky je charakteristická zvýšená frekvencia mutácií [35].

Stratégie stanovenia nádorovej hypoxie

Nádorová hypoxia predstavuje relevantný klinický fenomén, ktorý ovplyvňuje terapiu a progresiu nádorového ochorenia ako aj celkové prežívanie pacientov. Detekcia hypoxických oblastí v nádoroch je preto kritická z pohľadu stratifikácie pacientov pre optimálnu terapiu ako aj z pohľadu prognózy ochorenia.

Jeden z najstarších spôsobov, ktorý bol po prvýkrát popísaný v roku 1986 Weissom a Fleckensteinom, predstavuje lokálne použitie polarografickej mikroelektródy v nádorovom tkanive pacienta in vivo. Aplikáciou tohto merania bola potvrdená existencia hypoxického mikroprostredia v nádorovom tkanive (porovnanie hladiny koncentrácie kyslíka v zdravom prsníku –  65 mmHg vs. v prsníkovom karcinóme –  30 mmHg) [44]. Kým na jednej strane je táto metóda vzhľadom na technické vybavenie ľahko realizovateľná, tak na druhej strane má invazívny charakter a jej použitie je limitované vzhľadom k dostupnosti nádorového tkaniva.

Alternatívu k mikroelektróde predstavuje aplikácia pimonidazolu –  nitroimidazolovej zlúčeniny, ktorá je redukovaná v podmienkach hypoxie a ktorá sa selektívne viaže na makromolekuly v hypoxických bunkách. Pimonidazol sa podáva pred odberom biopsie a následne je jeho akumulácia v hypoxických oblastiach tkaniva (pod hladinou koncentrácie kyslíka 10 mmHg) vizualizovaná prostredníctvom špecifických protilátok a imunohistochémie [45]. Tento prístup je prínosný nielen z pohľadu detekcie nádorovej hypoxie prostredníctvom tzv. exogénneho markera, ale aj z dôvodu senzitizácie hypoxických buniek, ktoré sú následne citlivejšie voči rádioterapii [46].

Za posledné dve desaťročia sa do popredia dostávajú nové zobrazovacie stratégie, ktoré ponúkajú širší pohľad vzhľadom na lokalizáciu a dynamiku nádorovej hypoxie. Takýto neinvazívny prístup stanovenia hypoxie v nádorovom tkanive ponúka napr. pozitrónová emisná tomografia (PET). Táto stratégia je veľmi vhodná nie len preto, že ponúka celkový pohľad na nádorové tkanivo, ale aj z dôvodu možnosti opakovaného merania, ako aj širokej aplikovateľnosti pre všetky typy nádorov. Pre úspešnosť a relevantnosť zobrazovania je však veľmi dôležité, aby mal použitý rádioaktívne-značený nosič optimálne farmakokinetické parametre a aby bol minimalizovaný signál z pozadia. Zjednodušene sa PET nosiče dajú rozdeliť do dvoch skupín vzhľadom na to, či majú alebo nemajú nitroimidazolový charaktrer.

Medzi vybraných zástupcov nitroimidazolovej skupiny patria [¹⁸F]- fluoromi-sonidazol ([¹⁸F]- FMISO), [¹⁸F]- fluoroazomycín arabinozid ([¹⁸F]- FAZA) a [¹⁸F]- fluoroerytronitroimidazol ([¹⁸F]- FETNIM). Mechanizmus ich fungovania spočíva v redukcii NO₂ skupiny v hypoxických bunkách a v naviazaní sa vytvorených aniónov na makromolekuly nádorových buniek. V nekrotických oblastiach nedochádza k redukcii, v dôsledku čoho nosič difunduje von z bunky [47]. K zástupcom druhej skupiny nosičov patria [¹⁸F]- fluorodeoxyglukóza ([¹⁸F]- FDG; s pomerne širokým klinickým využívaním) a Cu- ATSM (komplex medi-  a dithiosemikarbazónu, pri ktorom dochádza k redukcii Cu²⁺ na Cu¹⁺). Prvý zavedený nosič, [¹⁸F]- FMISO, predstavuje tzv. zlatý štandard a bol najviac používaný na identifikáciu hypoxických oblastí v nádorových tkanivách pacientov. V porovnaní s novoobjavenými nosičmi však vykazuje suboptimálne vlastnosti. Do popredia sa preto dostáva Cu- ATSM nosič, ktorý je účinnejšie vychytávaný bunkami a poskytuje lepšie zobrazovacie možnosti [48]. Navyše kým v prípade nitroimidazolových nosičov značených s izotopom [¹⁸F] je polčas rozpadu necelé 2 hod, tak vzhľadom na skutočnosť, že nosič Cu- ATSM môže byť značený aj s izotopmi s dlhším polčasom rozpadu (12,7 hod pri [⁶⁴Cu] alebo 61,9 hod pri [⁶⁷Cu]), je jeho použitie vhodné tiež na predĺžené merania [49].

Alternatívou k PET je magnetická rezonancia (MRI), predovšetkým BOLD MRI (blood oxygen level dependance MRI). Princíp tejto metódy spočíva v existencii deoxyhemoglobínu v hypoxických podmienkach, ktorý vytvára lokálny magnetický gradient a dokáže interagovať v externom magnetickom poli [50]. Nevýhoda spočíva v negatívnom vplyve distribúcie krvi ako aj celkového objemu krvi v organizme na získané údaje. Metóda ako taká neposkytuje absolútne hodnoty koncentrácie kyslíka v tkanive, ale zachytáva len zmeny v oxygenácii krvi. Okrem BOLD MRI sa najnovšie objavuje aj DCE MRI (dynamic contrast- enhanced MRI) stratégia založená na nízkomolekulovom gadolíniovom nosiči.

Doposiaľ spomínané prístupy zamerané na detekciu nádorovej hypoxie prinášajú množstvo výhod, ale aj mnohé nevýhody. Okrem toho, že niektoré z nich majú invazívny charakter, sú pomerne dosť zaťažené nádorovou heterogenitou a dajú sa uplatniť len prospektívne. Naproti tomu detekcia tzv. endogénneho bunkového markera charakteristického pre hypoxiu umožňuje jeho aplikáciu aj v retrospektívnych štúdiách.

Prostredníctvom špecifickej protilátky je možné prítomnosť markera stanoviť imunohistochemicky, rutinným spôsobom, prospektívne aj retrospektívne na archivovaných vzorkách. Na základe získaných výsledkov je možné konfrontovať expresiu endogénneho hypoxického markera s histopatologickými parametrami, progresiou a rekurenciou ochorenia, výsledkom liečby a pod. Okrem možnosti detekcie samotného realizátora bunkovej odpovede na hypoxiu –  proteínu HIF- 1, ponúka sa aj možnosť detekcie jeho cieľových génov (v podobe proteínov), ako napr. GLUT1 a VEGF. Na základe mnohých doposiaľ publikovaných štúdií sa za najrelevantnejší marker nádorovej hypoxie označuje proteín CA IX.

Karbonická anhydráza IX

Karbonická anhydráza IX (CA IX) patrí do rodiny karbonických anhydráz –  zinok-viažúcich metaloenzýmov, ktoré katalyzujú reverzibilnú hydratáciu oxidu uhličitého na bikarbonátový ión a protón a prostredníctvom tejto aktivity sa zúčastňujú na rôznorodých biologických procesoch.

Prvotné informácie týkajúce sa identifikácie, charakterizácie a distribúcie CA IX boli získané prostredníctvom špecifickej monoklonovej protilátky M75 [51– 53]. Na základe imunohistochemických analýz ľudských tkanív je potvrdená expresia proteínu CA IX v prirodzených podmienkach predovšetkým v tkanivách tráviaceho traktu, hlavne v bunkách sliznice žalúdka [54]. Proteín CA IX sa tiež nachádza v epiteli tenkého čreva a jeho expresia klesá smerom ku konečníku. Na druhej strane v porovnaní s obmedzenou expresiou CA IX v normálnych tkanivách je k dnešnému dňu identifikované a popísané celé spektrum najrozličnejších typov nádorových tkanív derivovaných z obličiek, pažeráka, hrubého čreva, pankreasu, pečene, pľúc, maternice, vaječníkov, mozgu, prsníka a štítnej žľazy [55– 67].

Hypoxická regulácia génu CA9 sa uskutočňuje prostredníctvom väzby transkripčného faktora HIF- 1 do oblasti HRE lokalizovanej v pozícii – 10/ – 3 vzhľadom na transkripčný počiatok [68]. V prípade svetlobunkových obličkových nádorov, u ktorých v dôsledku mutácií génu VHL dochádza k stabilizácii proteínu HIF- 1 aj v normoxických podmienkach, pozorujeme vysokú hladinu CA IX a tzv. difúzny profil jej expresie v tkanive [69]. Na druhej strane v prípade nádorov s funkčným proteínom VHL je expresia proteínu CA IX viazaná do perinekrotických oblastí a vykazuje tzv. fokálny profil [68].

CA IX predstavuje vysoko  aktívny transmembránový enzým, ktorého hlavná funkcia spočíva v ochrane hypoxických nádorových buniek pred intracelulárnou acidózou [70]. V kooperácii s bikarbonátovými transportérmi umožňuje efektívnejší prenos bikarbonátových iónov do bunky, čím neutralizuje vnútrobunkové pH. Navyše akumulácia protónov vo vonkajšom prostredí vedie k acidifikácii nádorového mikroprostredia. Okrem toho proteín CA IX predstavuje aktívny komponent bunkového migračného aparátu, v ktorom sa podieľa na regulácii bunkovej adhézie ako aj pH regulácie na okraji migrujúcich buniek [71]. Vzhľadom na spomínané skutočnosti môžeme konštatovať, že proteín CA IX zohráva kľúčovú úlohu pri vzniku proinvazívneho nádorového mikroprostredia a súčasne predstavuje relevantnú molekulu metastatickej kaskády.

CA IX –  marker nádorovej hypoxie

Na základe mnohých štúdií bolo potvrdené, že expresia CA IX stanovená prostredníctvom imunohistochémie, alebo PCR- amplifikácie je úzko spojená s agresívnejším fenotypom a so zlou prognózou nádorového ochorenia, s mnohými histopatologickými parametrami, s rezistenciou na terapiu a prežívaním pacientov. Okrem toho vo vzťahu k iným metódam detekcie hypoxie v nádorovom tkanive bola dokázaná korelácia medzi CA IX a meraniami s mikroelektródou, resp. medzi CA IX a exogénnym markerom hypoxie –  pimonidazolom [72– 75]. K detekcii CA IX dochádza v relatívne rozsiahlych perinekrotických oblastiach, ktoré sú tvorené aj mierne hypoxickými a/ alebo reoxygenovanými bunkami. Je teda zrejmé, že v porovnaní s imunohistochemickým značením proteínu HIF- 1 ako aj jeho cieľových génov (VEGF, GLUT1) dochádza k miernym diskrepanciám oproti proteínu CA IX. Vysvetlenie spočíva najmä v rôznej senzitivite analyzovaných proteínov na hladinu kyslíka, v rôznych spôsoboch regulácie expresie hypoxických génov, resp. v rôznej stabilite proteínov (polčas rozpadu CA IX v okysličených bunkách je až 38 hod) [76– 79]. Navyše Olive et al dokázali, že CA IX  exprimujúce bunky z perinekrotických oblastí sú viabilné, klonogénne a rezistentné voči ionizujúcemu žiareniu [73].

S príchodom moderných prístupov založených na multianalýzach bol identifikovaný set hypoxických génov (tzv. hypoxic signature), ktorého súčasťou je aj CA IX a ktorého význam bol potvrdený z pohľadu prognózy ochorenia ako aj predikcie terapie [80– 82].

Vzhľadom na unikátny profil expresie proteínu CA IX v nádorových tkanivách (v porovnaní so zdravými tkanivami) ako aj jeho významnú funkciu vo vzťahu k pH regulácii, adhézii a migrácii nádorových buniek nie je prekvapivé, že patrí k pomerne často študovaným nádorovým biomarkerom. Významná je však nielen pozícia CA IX ako endogénneho markera hypoxie a prognostického indikátora, ale aj potenciál proteínu CA IX slúžiť ako terapeutický terč buď pre špecifické protilátky alebo inhibítory jeho enzymatickej aktivity [83].

Záver

Nádorová hypoxia je klinicky významný fenomén so značným vplyvom na selekciu agresívnych nádorových subpopulácií a progresiu nádorovej choroby. Poznatky získané pri štúdiu tohto javu značne prispeli k pochopeniu príčin rezistencie hypoxických nádorov voči konvenčnej protinádorovej liečbe. Podnietili tiež rozvoj nových, cielených diagnostických a terapeutických stratégií, ktoré pri racionálnom uplatnení v onkologickej praxi môžu podstatne zlepšiť klinický manažment pacientov s rakovinou.

Práca bola podporená Evropským fondem pro regionální rozvoj a státním rozpočtem České republiky OP VaVpI – RECAMO (CZ.1.05/2.1.00/03.0101), projektom MŠMT – NPU I – LO1413, Európskym fondom pre regionálny rozvoj a štátnym rozpočtom Slovenskej republiky (ITMS 26240220087) a Vedeckou grantovou agentúrou Ministerstva školstva SR a Slovenskej akadémie vied VEGA 2/0152/12.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Obdržané: 27. 3. 2015

Prijaté: 13. 4. 2015

prof. RNDr. Silvia Pastoreková, DrSc.

Oddelenie molekulárnej medicíny

Virologický ústav

Slovenská akadémia vied

Dúbravská cesta 9

845 05 Bratislava

Slovenská republika

e-mail: silvia.pastorekova@savba.sk