Moderní nanomedicína v léčbě karcinomů plic

Souhrn

Východiska:
I přes rychlý vývoj nových, efektivnějších cytostatik a cílené terapie není úspěšnost léčby karcinomů plic stále dostačující. Systémově aplikované léčivo je k nádorovým buňkám často dopraveno v neefektivních koncentracích, a to především kvůli specifickému extracelulárnímu prostředí plic. Nanotransportéry mohou ochránit léčivo před těmito nežádoucími vlivy, zvýšit jeho účinnost a snížit jeho nežádoucí účinky. Nanotechnologie mají navíc potenciál zvýšit diagnostickou úspěšnost nádorů plic, a tím přispět ke zlepšení přežití onkologických pacientů.

Cíl:
Cílem této práce je ilustrovat možnosti, které nanotechnologie nabízejí na poli léčby a diagnostiky nádorů plic, a diskutovat překážky, které brání jejich zavedení do klinické praxe.

Klíčová slova:
cílený transport –  lipozomy –  nanočástice –  nemalobuněčný karcinom plic –  malobuněčný karcinom plic

Úvod

Karcinom plic je celosvětově nejčastější příčinou smrti spojené s nádorovým onemocněním u mužů a druhou nejčastější u žen. Ročně je tomuto onemocnění přičítáno přes 1,38 milionu úmrtí [1]. Léčebné postupy dvou základních typů nádorů plic –  malobuněčný (small‑cell lung cancer –  SCLC) a nemalobuněčný (non‑small‑cell lung cancer –  NSCLC) –  se podstatně liší [2].

I přes značné pokroky ve vývoji cytostatik jsou současné léčebné možnosti nedostatečné (u NSCLC je pětileté přežití ve stadiu IA a IB < 50 %; avšak s pokročilostí stadia nádoru míra přežití výrazně klesá, kdy ve stadiu IV je míra pětiletého přežití < 1 %) [3]. Systémová aplikace léčiv je často neúspěšná kvůli nízkým koncentracím léčiv v místě primárního nádoru a/ nebo metastáz a zvyšování dávek je spojeno s nežádoucími účinky [4]. Mimo to jsou léčiva vystavena intracelulární enzymové degradaci či endozomální translokaci. Cílený transport léčiv pomocí nanotransportérů přímo k nádorovým buňkám proto může výrazně zvýšit efektivitu léčby a míru přežití pacientů s karcinomem plic. Nanotransportéry mohou využívat jak aktivního cílení, kdy jsou využívány cílící molekuly, jako jsou např. protilátky, peptidy či aptamery [5], tak cílení pasivního díky efektu zvýšené permeability a retence (permeability and retention –  EPR) [6], který je výsledkem patologické novotvořené vaskulatury v nádorech [7].

Efekt zvýšené permeability a retence a pasivní cílení

EPR efekt poprvé popsala skupina dr. Hiroshiho Maedy v roce 1984 [8]. Základní podstatou patofyziologie tohoto jevu je zvýšená permeabilita nádorové vaskulatury, což umožňuje lepší průnik relativně velkých částic (10– 300 nm) [9], jako jsou lipozomy, nanočástice, micely či proteiny, do intersticiálního prostoru nádoru (schematicky znázorněno na obr. 1). V kombinaci s alterovanou lymfodrenáží se v nádoru mění dynamika transportu molekul a tekutin, což snižuje schopnost přítomné nanočástice odstranit [10,11]. Ačkoliv je EPR odvozený od rychlého tempa růstu nádoru a kolapsu cévní a lymfatické tkáně v místě jeho růstu, je tento jev v ně­kte­rých případech značně zjednodušován, a stal se tak pro mnohé „zlatou bránou“ pasivního vstupu léčiva do locus in quo v nádorové tkáni. Bližší pohled na dostupná data ale odhaluje, že příjem léčiva je komplikován vysokým intersticiálním tlakem v mikroprostředí nádoru a také nepravidelnou distribucí cév [12]. Ačkoliv bylo navrženo mnoho léčiv využívajících EPR efektu, jen velmi málo z nich je nyní užíváno v klinické praxi (např. Myocet^TM, Daunoxom^®, Abraxan^®) [13]. I přesto je ale jisté, že EPR efekt je důležitým fenoménem u řady solidních tumorů, včetně karcinomů plic. Klinické využití léčebných postupů založených na tomto efektu musí být nicméně vždy zvažováno dle konkrétní situace.

Využití nanotechnologií v medicíně karcinomů plic

Jak již bylo zmíněno výše, nanotechnologie nabízejí široké spektrum aplikací nejen v léčbě či cíleném zobrazování přítomnosti nádorových tkání in vivo, ale i v diagnostice využívající širokého spektra bio­markerů pro včasnou detekci nádorových onemocnění [14– 16]. Ačkoliv je vývoj zařízení pro diagnostiku „bed‑ side“ velmi důležitý a perspektivní, přičemž nanotechnologie umožňují zvýšit jejich efektivitu, v další části textu budou diskutovány pouze aplikace rozličných typů nanometrických struktur pro cílený transport cytostatických léčiv a imaging in vivo. Cílem práce je představit a diskutovat možnosti, které nanotechnologie nabízejí na poli léčby a diagnostiky karcinomů plic.

Nanočástice na bázi kovů

Nanočástice kovů fascinují vědeckou komunitu již více než 100 let. Obecně jsou pro nanomedicínské aplikace využívány nanočástice kovů o velikosti 10– 500 nm [17], což je výhodné pro jejich internalizaci prostřednictvím EPR efektu. Další výhodou kovových nanočástic je možnost modifikace povrchu aktivně cílící strukturou, což zvyšuje nejen specifitu, ale i jejich stabilitu a biokompatibilitu. Nanočástice kovů lze využít nejen pro transport léčiv, fotosenzitizérů či nukleových kyselin, ale i jako kontrastní agens pro zobrazovací techniky, jako jsou MRI, CT či PET [18– 21]. Další perspektivní možností je rovněž kombinace s jinými nanomateriály a využití v teranostice, která je definována jako kombinace diagnostických a terapeutických funkcí nanotransportérů (obr. 2) [22]. Takovým způsobem mohou být superparamagnetické oxidy železa (magnetit, maghemit) konjugovány s léčivem, přičemž další modifikací cílícím ligandem vzniká struktura schopná cíleného transportu, ale i zobrazování, jak bylo demonstrováno in vitro na příkladu micel s doxorubicinem, superparamagnetickým oxidem železa a LCP (lung cancer‑ targeting peptid afinitní k integrinu α_vβ₆, jehož exprese je často zvýšená v NSCLC) [23].

Z kovových nanočástic jsou ve vývoji nových terapeutických agens pro nanomedicínu nádorů plic nejčastěji používány zlaté nanočástice (AuNPs). AuNPs lze využít nejen pro cílený transport léčiv [24], ale i pro fotodynamickou terapii nádorů. Ta využívá fotosenzitizérů, které po expozici laserem produkují volné kyslíkové radikály efektivně ničící okolní tkáň [25]. Tento postup se stále více využívá především v paliativní léčbě NSCLC, které nejsou diseminovány mimo plicní tkáň. Osvícení ložisek se provádí bronchoskopicky laserem. Konjugace AuNPs s cetuximabem významně zvýšila účinek této protilátky u EGFR pozitivních nádorů plic v experimentu na zvířatech [26]. Díky své univerzálnosti, zahrnující široký modifikační potenciál, jednoduchou syntézu, biokompatibilitu a možnost fotosenzitivizace jsou tak AuNPs jedny z nejslibnějších nástrojů teranostiky nádorů plic, což dokazuje i množství publikací, které se této problematice věnují [27– 29]. Ačkoliv bylo na tomto poli experimentálně dosaženo mnoha výjimečných výsledků, je využití AuNPs stále ještě v počátcích a bude zapotřebí další pečlivé práce, která povede k posouzení imunogenity, závislosti tvaru AuNPs na jejich toxicitě či k optimalizaci dávkování.

Kovů, které mohou být využity pro syntézu dalších typů nanočástic, je celá řada. Využití většiny z nich ale naráží na překážky, jako je nízká bio­kompatibilita, genotoxicita či vysoká produkční cena. Velmi slibnými se zdají být nanočástice ruthenia (Ru), které se in vitro ukazují být efektivnější proti různým nádorům, včetně NSCLC v porovnání s konven­čními platinovými cytostatiky [30]. I z toho důvodu jsou již některá léčiva na bázi nanočástic Ru ve fázi klinických studií.

Uhlíkové nanomateriály

Uhlíkové nanomateriály vynikají především vysokou aktivní internalizační schopností závislou na různých mechanizmech (receptorem zprostředkovanou endocytózou, kaveolární endocytózou, pinocytózou) [31]. Velkou výhodou je také velká celková plocha nanočástic a jednoduchá modifikace povrchu nanomateriálů léčivem či kontrastní látkou. Zajímavou ukázkou teranostiky nádoru plic s využitím uhlíkových nanočástic je jejich modifikace metotrexátem (MTX), asparaginázou a fluorescein isothiokyanátem (FITC). Výsledný konjugát využívá specifity analogu kyseliny listové –  MTX vůči folátovým receptorům „over‑exprimovaným“ v buňkách nádorů plic, takže slouží současně jako směrující struktura i jako cytostatikum a cytostatické aktivity asparaginázy a FITC umožňující jeho fluorescenční sledování. Tento konjugát vykazuje dobrou hemo‑  a biokompatibilitu in vitro [32].

Kromě špatné rozpustnosti je největší překážkou uhlíkových nanomateriálů potenciální toxicita při dlouhodobé expozici, která však může být eliminována vhodnou modifikací povrchu, což bylo ověřeno na experimentálním modelu hlodavců [33– 35]. Vhodná data na fyziologicky bližším modelu ale aktuálně nejsou k dispozici.

Polymerní nanočástice

Biodegradabilita a biokompatibilita jsou základní podmínkou pro klinickou použitelnost každého nanotransportéru. V terapii nádorů plic využívající polymerní nanomateriály je tato problematika obzvlášť zkoumána, protože degradované polymery interagují s povrchově aktivními látkami v alveolech, což vyvolává nežádoucí účinky, které mohou končit závažnými dýchacími potížemi, a dokonce až smrtí. Dnes je již vyvinuta poměrně pestrá škála polymerů (polymer kyseliny mléčné, kopolymer kyseliny mléčné s kyselinou glykolovou, chitosan, polyalkylkyanoakryláty, polyethylenglykol (PEG) či želatina), které umožňují řízené a prodloužené uvolňování léčiva a jsou bio­kompatibilní (struktury ně­kte­rých těchto polymerů jsou znázorněné na obr. 3A– E).

Kopolymer kyseliny mléčné s kyselinou glykolovou (poly(lactic-co-glycolic) acid – PLGA) je schválen pro vývoj přípravy inhalačních léků na bázi polymerních nanotransportérů a může sloužit pro transport nejen konvenčních léčiv, ale také RNA, DNA nebo terapeutických peptidů [36]. Jednoduchou konjugací PLGA s doxorubicinem a enkapsulací fosfolipidem s combretastatinem byl připraven nanotransportér s cytotoxickými a antiangiogenními vlastnostmi, který byl úspěšně testován in vivo u NSCLC [37]. Využití PLGA je limitováno rychlou „clearance“ z oběhového systému, což lze řešit jejich modifikací PEG za vzniku kopolymerního systému PLGA‑ PEG. Stejný problém se týká i ostatních polymerních látek a vyplývá především z požadavků na vysokou biokompatibilitu. Nové poznatky nicméně ukazují, že kopolymerací s jinými látkami lze splnit všechny požadavky pro ideální nanotransportér, a proto lze předpokládat, že polymerní nanočástice budou mít velký potenciál pro využití v klinické praxi.

Dendrimery jsou samostatnou skupinou polymerních nanočástic, vyznačujících se velkým vnitřním prostorem a velkým počtem funkčních skupin na povrchu, což umožňuje navázání léčiva do vnitřní kavity nanočástice a cílícího ligandu či kontrastní látky na povrchu struktury [38]. Využití dendrimerů je komplikováno poměrně složitou výrobou a polykationickým charakterem, čímž se dendrimery stávají toxickými pro negativně nabité buněčné membrány.

Bio‑ nanočástice –  proteinové a lipidové nanočástice

S cílem překonat toxicitu a nízkou biologickou kompatibilitu některých kovových nanotransportérů je pozornost zaměřena také na biologické materiály. Lipozomy jsou dvouvrstvé fosfolipidové nosiče běžně využívané k transportu hydrofobních i hydrofilních léčiv, a to buď jejich začleněním do lipidové dvojvrstvy, či enkapsulací ve vnitřní dutině [39,40]. Za posledních 10 let zažil výzkum na poli lipozomálních nanočástic rozmach, který vedl ke schválení několika přípravků na bázi lipozomů, nicméně žádný z nich nebyl zatím registrován pro využití v léčbě nádorů plic.

V roce 2004 byla vyvinuta lipozomální cisplatina (Lipoplatina) s nižší toxicitou včetně nefrotoxicity, které často použití cisplatiny limitují [41]. Lipoplatina byla v kombinaci s gemcitabinem testována u pacientů s pokročilými (IIIB/ IV), inoperabilními NSCLC v rámci klinické studie fáze II. Výsledky ukazují snížení nežádoucí toxicity (především nefrotoxicity) a zvýšení účinnosti léčiva [42]. Nedávné preklinické studie využívající xenotransplantátů chemosenzitivních i chemorezistentních buněk plicního adenokarcinomu ukázaly, že lipozomální forma paclitaxelu může být snadno modifikována pro aktivní cílení buněk nádorů plic, čímž lze překonat rezistenci buněk vůči léčivu [43].

Lipozomy byly také testovány pro transport antigenu MUC1, asociovaného s nádory plic, přičemž studie terapeutické lipozomální vakcíny BLP25 ukazují nadějné výsledky v léčbě pokročilých NSCLC [44]. Tato vakcína nyní prochází fází III. klinického testování [45].

V neposlední řadě je také nutné zmínit možnost využití lipozomálních nosičů v genové terapii karcinomů plic. Ačkoliv je možnost využití genové terapie v léčbě nádorů plic stále čistě experimentální, bylo již dosaženo několika unikátních výsledků. Lipozomy mohou nést geny kódující tumor supresorové proteiny a jak bylo již demonstrováno v klinické studii s nanopartikulemi obsahujícími plasmid nesoucí tumor supresorový gen TUSC2/ FUS1 (TUSC2), jehož produkt je redukován u plicních karcinomů, na rozdíl od zdravé bronchiální a alveolární tkáně [46], lze jeho aplikací u některých pacientů s NSCLC prodloužit přežití [47]. Výsledky z klinických studií navíc ukazují, že intravenózní aplikace jsou velmi dobře tolerovány, bez pozorované toxicity.

Pomocí lipozomů mohou být do buňky rovněž vkládány malé interferující RNA (siRNA), které jsou schopny selektivně inhibovat expresi nežádoucího proteinu interakcí s mRNA jejich kódujících genů [48]. Mezi takové proteiny lze zařadit i Cyklin D1, jehož inhibicí in vitro lze v buňkách NSCLC a mezoteliomu docílit rapidního poklesu proliferační aktivity a indukce apoptózy [49].

Nativní transportní proteiny tvoří další skupinu bio‑ nanotransportérů, která se vyznačuje vhodným „bezpečnostním profilem“, další výhodou je také jejich uniformní velikost. Albuminové nanočástice umožňují díky svému náboji vazbu jak negativně, tak pozitivně nabitých molekul a také pozvolnější uvolňování léčiva než lipozomy [50]. V roce 2012 rozšířila FDA povolení k použití albuminových nanočástic s vázaným paclitaxelem (Abraxan^®) pro léčbu ně­kte­rých nádorů včetně NSCLC. Vzhledem k ochotě albuminu vytvářet konjugáty i po navázání paclitaxelu lze i tento přístup využít pro teranostické účely, a to jejich další modifikací zobrazovacími látkami [51].

Neméně zajímavým proteinem je transportér železa apoferitin. Díky jeho přirozené vlastnosti –  rozkladu na podjednotky –  lze vlivem prostředí docílit efektivní enkapsulace cytostatik [52]. Apoferitin vyniká svou stabilitou a přirozenou afinitou k transferinovým receptorům (TfR1), jejichž množství je u většiny nádorů plic zvýšené [53]. Do proteinové „klece“ mohou být enkapsulovány také kontrastní látky či fotosenzitizéry (sumarizováno v [54]). Ačkoliv bylo s použitím apoferitinu experimentálně dosaženo mnoha zajímavých výsledků, vzhledem k nedostatku údajů z klinických testování nelze posoudit, zdali je jeho aplikace v humánní medicíně skutečně relevantní.

Výhledy do budoucnosti

Navzdory rozvoji širokého spektra léčebných strategií a vývoji nových typů léčiv zůstávají karcinomy plic stále nejčastější příčinou úmrtí spojených s nádorovým onemocněním. Přístupy využívající nanočástice mají potenciál řešit některé problémy konvenčních cytostatik, jako je jejich malá specifita, nízký terapeutický index, nežádoucí účinky či vznik sekundární chemorezistence. Obecně lze říci, že nanotransportéry umožňují velkou konstrukční flexibilitu, čímž lze řešit špatnou rozpustnost léčiv ve vodě či jejich sníženou schopnost překonávat biologické bariéry a selektivně cílit do konkrétního místa.

I přes tyto výhody je zde stále velké množství překážek, které je potřeba překonat před širším klinickým zavedením nanomateriálů v léčbě a diagnostice karcinomů plic. Je známo, že farmakokinetika nanomateriálů úzce vychází z jejich trojrozměrného uspořádání [55], a tak i malé změny v procesu syntézy mohou mít za následek fyzikálně‑chemické změny, které mohou v organizmu způsobovat různé komplikace. Další složitou otázkou je vylučování nanomateriálů z těla. Je nutné detailně porozumět chování nanotransportérů a bio­logické odezvě organizmu na jejich přítomnost. Jen tak lze zajistit reprodukovatelnost v průběhu léčby a minimalizovat farmakologické a imunologické komplikace. Snadnější uchopení této problematiky může vést k rychlejšímu převodu do klinické praxe a zvýšení efektivity léčby nádorů plic.

Práce byla podpořena Ligou proti rakovině Praha (projekt 18257/2014-981) a MZ ČR – RVO, FN v Motole 00064203.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Obdrženo: 21. 3. 2015

Přijato: 11. 5. 2015

prof. Ing. René Kizek, Ph.D.

Laboratoř metalomiky a nanotechnologií

Ústav chemie a biochemie

Mendelova univerzita v Brně

Zemědělská 1

613 00 Brno

e-mail: kizek@sci.muni.cz