MikroRNA v mozkomíšním moku jako biomarkery u pacientů s nádory mozku

Súhrn

Východiska: Ačkoli nádory centrální nervové soustavy (CNS) nepatří mezi nejčastější nádorová onemocnění, jejich incidence v posledních letech stále roste. Naneštěstí se tato skupina vyznačuje velmi špatnou prognózou. Výběr správné terapie záleží na včasné a přesné diagnóze. Diagnostické postupy v případě nádorů mozku jsou však často limitovány jejich lokalizací a značnou heterogenitou nádoru. Proto je věnováno velké úsilí hledání nových diagnostických přístupů a biomarkerů, které by byly dostatečně robustní, senzitivní a specifické, a jejichž analýza by ve vztahu k pacientovi eliminovala nutnost biopsie. Mozkomíšní mok (cerebrospinal fluid – CSF) přichází do přímého kontaktu s CNS a představuje proto vhodný biologický materiál, který by mohl prostřednictvím biomarkerů reflektovat její aktuální stav. Vhodnými molekulami se v tomto případě zdají být mikroRNA (miRNA), krátké nekódující RNA, které byly již několikrát detekovány v CSF a jejichž deregulované hladiny jsou asociované s různými typy nádorů CNS.

Cíl: Bohužel metodické přístupy používané pro analýzy miRNA v CSF nebyly prozatím dostatečně standardizovány. Z těchto důvodů se v předkládaném přehledovém článku snažíme shrnout a zhodnotit doposud používané metodické přístupy k analýze miRNA z CSF s cílem nalézt ty nejvhodnější. Dále zde sumarizujeme výsledky studií popisující miRNA, které by mohly v budoucnu představovat biomarkery různých nádorových onemocnění CNS.

Klíčová slova:

mikroRNA – mozkomíšní mok – nádory mozku – biomarkery

Úvod

Primární nádory mozku a mozkové metastázy postihují ve světovém měřítku kolem 40 pacientů ze 100 000 osob ročně a tato incidence stále roste [1,2]. Včasná a přesná diagnostika hraje klíčovou roli v určování prognózy a volby nejvhodnější terapie. V současné době je diagnostika mozkových nádorů nejčastěji prováděna na základě zobrazovacích metod jako jsou výpočetní tomografie (computed tomography – CT), magnetická rezonance (magnetic resonance imaging – MRI) a pozitronová emisní tomografie (PET) s následným histologickým posouzením nádorové tkáně. Nicméně i přes značné pokroky a modifikace již zmiňovaných metod je přesná a včasná diagnostika u některých nádorů značně limitována lokalizací a buněčnou heterogenitou nádoru [3]. Vzhledem k výše uvedeným skutečnostem je důležité vyvinout nové diagnostické postupy, které společně s existujícími metodami zvýší přesnost diagnostiky nádorů mozku, a tím i přežívání pacientů. Stejně jako u jiných typů nádorů se „tekuté biopsie“ a jejich analýza zdají být slibným diagnostickým přístupem. V případě mozkových nádorů je pozornost, především z důvodu existence hematoencefalické bariéry, zaměřena na mozkomíšní mok a jeho možné diagnostické využití [4]. Vhodnými molekulami s potenciálem sloužit jako málo invazivní, dostatečně senzitivní a specifické biomarkery se v tomto ohledu jeví být krátké nekódující RNA, především pak mikroRNA (miRNA), jejichž deregulované hladiny byly detekovány u řady nádorových onemocnění a jsou asociovány s biologickými procesy zapojenými do maligní transformace.

Mozkomíšní mok

Mozkomíšní mok (cerebrospinal fluid – CSF), likvor, je bezbarvá, čirá tělní tekutina připomínající krevní plazmu, která cirkuluje v mozkových komorách a subarachnoidálních prostorech obklopujících mozek a míchu. Ve srovnání s krevní plazmou však obsahuje méně proteinů, což činí přibližně 15–45 mg/dl, dále pak 50–80 mg/dl glukózy a 0–5 bílých krvinek/ml. Rychlost produkce CSF je 0,3–0,4 ml/min, celkový objem CSF dospělého jedince představuje 90–150 ml a u dětí 65–150 ml. Hlavní funkce CSF je zejména mechanická, chrání mozek před nárazy, dále přispívá k udržování stálého nitrolebního tlaku a slouží jako prostředek k transportu biomolekul a odvádění metabolitů. Vzhledem k tomu, že CSF omývá celou centrální nervovou soustavu (CNS), a dostává se tedy do blízkého kontaktu s jakoukoli možnou patologickou tkání, je považován za ideální zdroj biologického materiálu pro následné diagnostické účely [5–7].

CSF je nejčastěji získáván tzv. lumbální punkcí, je odebírán v oblasti L3–L5 bederních obratlů za použití spinální jehly. Jinou možností odběru CSF je komorová punkce či komorová drenáž, pak získáváme komorový mok. Třetí variantou je odběr tzv. cisternálního moku, který se odebírá subokcipitální nebo laterocervikální punkcí. Při odběru CSF je v určitých případech také možné změřit likvorový tlak. Dále lze posoudit jeho vzhled, a to barvu či přítomnost krve. Další analýzy CSF jsou ihned po odběru prováděny na speciálních pracovištích. V klinické praxi se běžně stanovuje zejména základní cytologie, při které se hodnotí monocytární, lymfatické, myeloidní a nádorové buňky. Také se provádí měření koncentrace celkového proteinu s možnou analýzou diagnostických proteinů, jako je třeba albumin, imunoglobuliny, zánětlivé markery atd. Dále se provádí biochemické vyšetření, při němž je měřena zejména koncentrace různých iontů, laktátu a glukózy, popř. je možné spektrofotometrické vyšetření CSF, jež dokáže zjistit přibližnou dobu krvácení do mozku [8–10].

Jak již bylo řečeno, CSF je považován za tzv. rezervoár látek, které vylučuje ať už zdravá, či patologická tkáň CNS, proto se analýza likvoru jeví jako vhodný prostředek pro diagnostiku nádorů CNS. V poslední době se v onkologické praxi mezi nejčastěji prováděná vyšetření řadí cytologie, která je vysoce specifická při detekci nádorových buněk. Na druhou stranu se jedná pouze o kvalitativní test, jenž postrádá normalizaci a např. jeho senzitivita pro diagnostiku glioblastomu (GBM) se pohybuje pouze okolo 10 % [11]. Další nevýhodou je, že rychlost a uvolňování maligních buněk do CSF je intermitentní proces, což může vést k vysoké míře chybovosti této metody [5,6,11].

Cirkulující miRNA

Cirkulující mikroRNA (c-miRNA) by mohly představovat perspektivní biomarkery CSF. MiRNA tvoří skupinu jednořetězcových nekódujících RNA s délkou přibližně 18–25 nukleotidů, které posttranskripčně regulují genovou expresi, a hrají tudíž klíčovou roli v regulaci všech buněčných procesů. Tyto molekuly jsou obvykle tkáňově specifické a podílejí se na patogenezi mnoha onemocnění vč. nádorů mozku [12]. Cirkulující miRNA byly detekovány téměř ve všech tělních tekutinách, jako je krevní plazma a sérum, moč, sliny, slzy nebo CSF [13]. Zajímavé je, že c-miRNA jsou vysoce stabilní a odolávají extrémním podmínkám, jako je aktivita ribonukleáz, opakované zmrazování, var, nízké a vysoké pH nebo i skladování při pokojové teplotě [13]. Deregulované hladiny miRNA v CSF jsou podle nedávných studií také asociovány s maligními nádory CNS [14–20]. Například hladina miR-21 u pacientů s gliomy dokázala rozlišit nádorové vzorky CSF s vyšší citlivostí a specificitou než hladiny miR-21 detekované v krevní plazmě [21]. Analýza c-miRNA v CSF proto představuje slibný nástroj potenciálně vedoucí ke zdokonalení současné diagnostiky nádorů mozku [5,6].

Původ cirkulujících miRNA v CSF

O původu c-miRNA v CSF je toho prozatím známo málo. Preanalytické a analytické faktory, které by mohly ovlivňovat stanovení jejich hladin, bohužel nejsou dostatečně popsány. Stabilita c-miRNA v tělních tekutinách naznačuje jejich efektivní ochranu před působením ribonukleáz [22]. V současné době bylo popsáno více hypotéz navrhujících možný původ a formy výskytu c-miRNA v CSF. MiRNA vázané na proteinové komplexy (proteiny argonautové rodiny, lipoproteiny o vysoké hustotě) a miRNA umístěné v extracelulárních vezikulech (EV) mohou být aktivně uvolňovány nádorovými buňkami. EV lze dále dělit na exozómy (50–200 nm) a na mikrovezikuly (> 200 nm). Za druhé, nekrotické a apoptotické buňky by mohly pasivně vylučovat volně cirkulující tzv. nahé miRNA nebo opět miRNA vázáné v proteinových komplexech. Dalším možným zdrojem c-miRNA jsou miRNA pocházející z cirkulujících nádorových buněk (schéma 1). Bohužel analýza cirkulujících miRNA v lidských tělních tekutinách vč. CSF není prozatím dostatečně standardizována [5,23].

Metodické přístupy analýzy miRNA v CSF

Detekce miRNA v CSF zahrnuje následující kroky – zpracování odebraného CSF a jeho uchování, izolaci a expresní analýzy miRNA a na závěr normalizaci a interpretaci finálních dat (schéma 2).

Již samotný odběr CSF může do analýz vnést jisté zkreslení v důsledku preanalytických faktorů, proto by měl být stanoven standardizovaný protokol pro sběr vzorků a jejich zpracování. Takový protokol byl navržen již ve studii Teunissena et al v letech 2009 a 2011 [24,25], v níž byly zdůrazněny tři zásadní body pro správné fungování protokolu. Za prvé, jelikož objem odebraného CSF může ovlivnit koncentraci přítomných biomarkerů, doporučuje se odebírat alespoň 12 ml CSF. Za druhé, lumbální punkce by měla být vždy provedena mezi L3 a L5 obratlem. A za třetí, vzorky CSF obsahující krevní, či dokonce kožní buňky musí být vyloučeny. Doba od odběru CSF až po laboratorní zpracování je také důležitá a neměla by přesáhnout 60 min. Rovněž by měl být zaveden protokol samotného laboratorního zpracování CSF, jako jsou podmínky centrifugace a skladování alikvotovaných vzorků. CSF je nejčastěji zpracováván při 500 g, 10 min, za laboratorní teploty. Navzdory tomu, že se miRNA zdají být stabilní v širokém rozmezí teplot, měly by být alikvoty skladovány při −80 °C [4].

Několik studií již porovnalo účinnost komerčně dostupných kitů určených pro izolaci krátkých RNA z CSF i s různými modifikacemi protokolů. Nicméně tento proces stále postrádá standardizaci, a proto není snadné zvolit nejúčinnější metodu izolace. V souvislosti se zmiňovanými studiemi a dle našich zkušeností byly nejúčinnější následné modifikace v protokolu:

1. zvyšování vstupního objemu CSF, doporučuje se min. 200 μl;
2. přidání čistého glykogenu pro lepší přenos RNA ke kolonce;
3. inkubace elučního roztoku na kolonce (alespoň 15 min) a na závěr snižování elučního objemu při konečné eluci [4,26–28].

Vzhledem k nízké koncentraci celkové RNA a krátkých RNA se výrazně snižuje přesnost standardních metod používaných pro kvantifikaci a kontrolu kvality RNA, jako jsou technologie Nanodrop a Qubit. Vhodnou alternativou by mohla být např. automatizovaná kapilární elektroforéza Bioanalyzer (Agilent). Pro analýzu krátkých RNA lze dokonce použít speciální čip schopný detekovat RNA při nízké koncentraci 50 pg/μl. Limitující je ovšem v těchto případech poměr ceny a získaných výstupů za jeden vzorek.

Metody detekce hladin miRNA se dělí do dvou hlavních skupin – analýza jednotlivých miRNA a globální profilování miRNA. V současné době je množství jednotlivých miRNA v CSF měřeno výhradně pomocí modifikovaných real-time PCR (polymerase chain reaction) technologií. Nejčastější metodou je specifická reverzní transkripce s použitím tzv. stem loop primerů a následnou real-time PCR pomocí detekčního systému TaqMan^® (Thermo Fisher Scientific) [14–16]. Baraniskin et al [14] potvrdili reprodukovatelnost této metody. Není to však jediný přístup k detekci miRNA. Další studie používala digitální PCR podle protokolu TaqMan. Obdržené výsledky korelovaly s daty ze sekvenování nové generace (next-generation sequencing – NGS), což potvrzuje relevantnost použití digitální PCR pro analýzu hladin miRNA v CSF [29]. Navíc se tato PCR technologie zdá být vhodná právě pro vzorky s nízkou koncentrací RNA a s těžce definovatelnými normalizačními molekulami, jako je právě CSF.

Pro globální profilování miRNA jsou v současné době nejčastěji používány čtyři vysokokapacitní platformy, jmenovitě hybridizační arraye, technologie založené na real-time PCR, platforma nCounter a NGS. Tyto platformy se liší v počtu detekovatelných miRNA, v citlivosti, specificitě, dynamickém rozsahu, množství vstupního materiálu a celkových nákladech potřebných na analýzu. Proto je třeba zohlednit všechny okolnosti profilování před výběrem vhodné vysokokapacitní technologie [4].

Uspokojivý způsob normalizace získaných dat u c-miRNA v CSF není prozatím znám, zejména z toho důvodu, že analýza miRNA v tělních tekutinách je ovlivněna mnoha technologickými a biologickými faktory. U vzorků CSF bylo navrženo několik metod, vč. použití exogenních miRNA (tzv. spike-in metoda) či referenčních endogenních krátkých RNA. Všechny tyto metody však mají své limitace. Spike-in miRNA neodráží biologické faktory ovlivňující hladiny c-miRNA. Endogenní krátké RNA, které jsou stabilně exprimovány v buňkách (RNU44, RNU48 a RNU6B), vykazují nízké a nestabilní hladiny ve vzorcích CSF. Kromě toho neodrážejí zcela věrně biogenezi cirkulujících miRNA [20]. Nedávné studie naznačují, že vhodnými referenčními c-miRNA by mohly být také vybrané miRNA, např. miR-24, miR-125, let-7c, miR-21, miR-24, miR-99b, miR-328 a miR-1274B, miR-15a-5p, miR-23p-3p, miR-23b-3p, miR-99a-5p, miR-125b-5p, miR-145-5p, miR-204-5p a miR-320a [15,16,22,23]. Na druhou stranu nezávislá studie již některé miRNA z této skupiny vyvrátila [19].

MiRNA v CSF jako diagnostické biomarkery

Během posledního desetiletí několik studií ukázalo, že deregulové hladiny miRNA v CSF mohou být asociovány s nádory CNS a mohly by tak představovat novou skupinu možných diagnostických biomarkerů.

V roce 2012 Baraniskin et al publikovali studii, ve které hladiny miR-15b a miR-21 v CSF byly vyšší u vzorků pacientů s gliomem než u kontrolních pacientů. Při rozsáhlejším porovnávání pak vzorky od pacientů s gliomem vykazovaly vyšší hladiny miR-15b a nižší hladiny miR-21 než vzorky od pacientů s primárním lymfomem CNS (primary central nervous system lymphoma – PCNSL). Na základě těchto výsledků autoři studie navrhují miR-15b a miR-21 jako možné diagnostické biomarkery [14,15].

V další studii Teplyuka et al byla detekována miR-10b téměř ve všech vzorcích CSF pacientů s GBM, tato miRNA byla také přítomna u většiny vzorků CSF pacientů s mozkovými a leptomeningeálními metastázami nádoru prsu a plic. Dokonce u některých vzorků CSF od pacientů s detekovanou miR-10b bylo negativní cytologické vyšetření a také u žádného kontrolního vzorku nebyla potvrzena přítomnost této miRNA. Proto by miR-10b mohla představovat slibný biomarker gliomů vyššího stupně malignity a metastatických nádorů mozku. Dále v této studii byly detekovány miR-200a, miR-200b, miR-200c a miR-141, kdy se tyto miRNA vyskytovaly vysoce specificky u mozkových metastáz ve srovnání se vzorky GBM. Následně bylo ve studii zjištěno, že miR-200a a miR-200b se častěji objevuje v CSF u metastatických pacientů s primárním nádorem prsu než u pacientů s primárním nádorem plic. Tyto výsledky ukazují, že rodina miR-200 by mohla být slibným biomarkerem schopným klasifikovat mozkové metastázy a místo vzniku primárního nádoru [16].

Drusco et al hledali pomocí metody NanoString nCounter možné diagnostické biomarkery nádorů CNS v CSF, kdy do studie bylo zařazeno 34 neoplastických pacientů a 14 zdravých kontrol. Vzorky byly dále rozděleny do sedmi skupin podle různých nádorových onemocnění – GBM, meduloblastom, plicní metastázy, metastázy prsu, PCNSL benigní a normální. Výsledky byly dále validovány za použití qRT-PCR (quantitative reverse transcription PCR) a hybridizace in situ. Hladiny miR-125b, miR-223, miR-451, miR-711 a miR-935 vykazovaly rozdíly mezi zkoumanými skupinami, což naznačuje, že tyto miRNA mohou být účinnými diagnostickými biomarkery malignit CNS [17].

Grotzer et al analyzovali miRNA v CSF u pacientů s meduloblastomem ve srovnání s kontrolními pacienty. Bylo detekováno 1 254 miRNA v nádorových vzorcích CSF a 86 z těchto miRNA vykazovalo rozdílné hladiny mezi porovnávanými skupinami. Autoři také použili kultivační médium k analýze miRNA vylučovaných buňkami meduloblastomu. Padesát sedm detekovaných miRNA bylo specifických pro buněčné linie související s metastázami, které představují nejagresivnější subtypy meduloblastomu. Je zajímavé, že tři miRNA asociované s metastázami (miR-125a, miR-125b a miR-1290y), které byly nadměrně zastoupeny v kultivačním médiu buněčných linií, byly rovněž detekovány ve vzorcích CSF od pacientů s meduloblastomem [18].

V další studii Akers et al analyzovali hladiny miR-21 v EV extrahovaných z CSF od 13 pacientů s GBM a 14 zdravých kontrol. Výsledky ukázaly, že hladiny EV miR-21 byly průměrně 5krát vyšší u GBM pacientů než u kontrol. Tato miRNA dokázala rozlišit mezi GBM a kontrolními vzorky s 87% senzitivitou a 93% specificitou. Autoři také změřili hladiny miR-21 v buněčných liniích GBM, přičemž tyto hladiny korelovaly s předešlými výsledky, což naznačuje, že buňky GBM nejspíše aktivně vypouštějí EV obsahující miR-21 [19]. Následně Akers et al publikovali další studii, která naznačuje, že profil miRNA v CSF u pacientů s GBM koreluje s profilem miRNA analyzovaným v nádorové tkáni. Porovnáním GBM a nenádorových vzorků CSF odhalili 9 miRNA s rozdílnými hladinami. Autoři zde také uvedli zajímavé zjištění, jež bylo pozorováno již v předchozích studiích, týkající se významné variability mezi profily miRNA detekovanými v CSF od pacientů s GBM. Toto pozorování zaznamenali i ve vlastních výsledcích, kdy byl pozorován signifikantní rozdíl mezi profily miRNA mezi vzorky od tří různých kohort pacientů [20]. Tato variabilita, vezmeme-li v potaz dosud publikovanou literaturu, naznačuje, že profily miRNA v CSF jsou pravděpodobně ovlivněny fyziologickými faktory (např. cirkadiánní rytmus, únava, příjem léků atd.), které lékaři většinou pro výzkumné účely nezaznamenávají. Tudíž, jak již bylo řečeno v kapitole o zpracování CSF, větší objemy odebraného likvoru by mohly snížit tuto variabilitu. Dalším důležitým zjištěním byl poměrně značný rozdíl v profilu miRNA mezi cisternálním a lumbálním mokem. MiRNA detekované v cisternálním moku byly schopné odlišit nádorové vzorky se 67% senzitivitou a 80% specificitou oproti miRNA v lumbálním moku, kde tyto hodnoty činily 28 a 95 %. V této studii bylo také zjištěno, že > 95 % miRNA nalezených v EV bylo zastoupeno v celém objemu CSF. Běžně zpracovaný CSF by tedy měl stačit pro profilování miRNA [20]. Tab. 1 shrnuje studie porovnávající hladiny miRNA mezi různými nádory CNS.

Závěr

Cirkulující miRNA v CSF se zdají být slibnými biomarkery, které by mohly pomoci zlepšit současnou diagnostiku nádorů mozku. Analýza těchto krátkých nekódujících RNA v CSF však stále není zcela standardizována a existuje mnoho faktorů, které by mohly ovlivnit výsledky. Optimalizace a standardizace jednotlivých kroků celého analytického procesu by tak mohla přiblížit miRNA detekované v CSF ke klinickému využití.

Tato studie byla vypracována s grantovou podporou Ministerství zdravotnictví České republiky, granty č. 15-34553A a 15-33158A.

Všechna práva vyhrazena.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

prof. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D.

CEITEC – Středoevropský

technologický institut

Masarykova univerzita

Kamenice 753/5

625 00 Brno

e-mail: on.slaby@gmail.com

Obdrženo: 3. 1. 2019

Přijato: 3. 1. 2019