Nanočásticemi modifikovaný apoferritinový nanotransportér pro cílený transport cytostatik

Súhrn

Východiska: Ferritin je globulární vnitrobuněčný protein, který slouží jako hlavní zásobárna železa. U nádorových onemocnění je plazmatická koncentrace ferritinu zvýšená. V řadě studií bylo zjištěno, že nádorové buňky exprimují ve zvýšené míře transferinové receptory (TfR). Zvýšená exprese TfR byla pozorována i u karcinomu prostaty. Apoferritin (APO) lze využít jako proteinový nanotransportér, do kterého je možné enkapsulovat vhodnou léčivou látku. Bylo zjištěno, že nanočástice zvyšují prostupnost nanotransportérů do nádorové buňky a vykazují fototermální efekt. Cílem projektu bylo enkapsulovat doxorubicin (DOX) do APO a vytvořený APO/DOX modifikovat zlatými (gold nanoparticles – AuNPs) a stříbrnými (silver nanoparticles prepared by green synthesis – AgNPsGS) nanočásticemi.

Metody: Pro charakterizaci APO byla použita 10% gelová elektroforéza (sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis – SDS-PAGE) – 120 V, 60 min, 24 mM Tris, 0,2 M glycin, 3 mM SDS. Fluorescence DOX (Ex 480 nm, Em 650 nm) s typickým absorpčním maximem v 560 nm. Elektrochemické měření bylo provedeno v Brdičkově roztoku (tříelektrodové zapojení). AgNPsGS byly připraveny zelenou syntézou z jetele lučního (Trifolium pratense L.).

Výsledky: Byla provedena elektroforetická studie APO a APO/DOX (5–100 μg/ml). Bylo sledováno chování APO a APO/DOX (10 μM) v závislosti na pH. APO v kyselém prostředí tvoří subjednotky o velikosti asi 20 kDa a v neutrálním a zásaditém prostředí se zformuje na globulární protein o velikosti asi 450 kDa. U APO/DOX byla pozorována změna mobility (asi o 10 %). Na povrchu APO/DOX byl vytvořen film z AuNPs. APO/DOX/AuNPs byl následně promyt ultračistou vodou. Bylo sledováno uvolnění DOX v závislosti na pH. Množství analyzovaného DOX se zvýšilo až o 50 %. Dále byl navržen a připraven komplex AgNPsGS-DOX (1 mg AgNPsGS/100 μM DOX). Takto připravený komplex AgNPsGS-DOX byl uzavřen do APO. Pro další zlepšení terapeutické účinnosti byl připravený komplex APO/AgNPsGS-DOX pokryt vrstvou AuNPs. Vytvořený APO/AgNPsGS-DOX/AuNPs prokázal svoji stabilitu a při změně fyzikálních parametrů byl z komplexu uvolněn DOX.

Závěr: Byly připraveny a modifikovány nanokomplexy APO pro zvýšení terapeutické účinnosti protinádorové léčby. Zacílení k nádorové buňce bylo na TfR nebo efektem zvýšené propustnosti a retence. Uvolnění léčiva bylo možné změnou pH nebo fototermální aktivací, která bude nyní testována.

Klíčová slova:

apoferritinový nanotransportér – transferinové receptory – cílená terapie – nádory prostaty – nanomedicína – stříbrné nanočástice – zlaté nanočástice

Úvod

Ferritin je globulární protein, který tvoří dutinu pro fyziologické a bezpečné uchovávání železa v organizmu. V buňkách ho lze využít jako proteinový tělu vlastní nanotransportér, do kterého je možné enkapsulovat místo železa vhodné terapeutikum [1–3]. Apoferritin (APO) – tedy ferritin, jehož dutina je prázdná – v závislosti na pH mění svoji strukturu, při nízkém pH se otevírá a rozpadá na jednotlivé podjednotky, při vyšším pH se samoorganizuje (obr. 1) [2,4,5]. S výhodou je tak možné použití APO jako nanotransportéru u buněk karcinomu prostaty. Nejen u těchto nádorových buněk je známá a potvrzená výrazně zvýšená exprese transferinových receptorů (TfR) oproti buňkám nenádorovým [4,6,7]. Vedle aktivního cílení na TfR (obr. 2) umožňuje modifikovaný apoferritinový nanotransportér vzhledem ke své velikosti využití i pasivního cílení díky tzv. efektu zvýšené propustnosti a retence (enhanced permeability and retention effect – EPR efekt). Tento efekt obecně popisuje jev, kdy nádorová tkáň umožňuje snadnější prostup makromolekulárních látek a zároveň jich významně více zadržuje [8,9]. Díky těmto faktům se APO stává ideálním nanotransportérem pro možnou cílenou terapii karcinomu prostaty.

Stříbrné nanočástice připravené zelenou syntézou (silver nanoparticles prepared by green synthesis – AgNPsGS) vykazují protinádorový potenciál díky povrchové modifikaci biomolekulami z rostlinného extraktu. K zelené syntéze byl zvolen extrakt z jetele lučního (Trifolium pratense L.). Očekávaným benefitem bylo vytvoření povrchové vrstvy z obsahových látek, kterými jsou zejména flavonoidy a isoflavonoidy. Mezi takové látky řadíme genistein, který je znám pro svůj účinek jako inhibitor angiogeneze [10].

Modifikace enkapsulovaného léčiva by měla synergicky potencovat účinek samotného protinádorového léčiva, a navíc rozšířit možnosti mechanizmů účinku pro co nejúčinnější a nejcílenější cytotoxický efekt u nádorových buněk karcinomu prostaty [11].

Vedle enkapsulace vhodné léčivé látky do „apoferritinové klece“ bylo dalším cílem provést modifikaci takovéto klece pomocí zlatých nanočástic (gold nanoparticles – AuNPs). Díky modifikaci zlatými nanočásticemi je možné získat nanokomplex s léčivem, který lépe reaguje na vnější fototermální stimul, a navíc AuNPs pozitivně ovlivňují prostoupení komplexu do nádorové buňky [12].

Mechanizmus účinku celého plně modifikovaného apoferritinového nanokonstruktu je mnohaúrovňový. Spočívá v účincích, které můžeme rozdělit na účinky zvoleného protinádorového terapeutika, které je enkapsulováno v APO, účinky AgNPsGS a případnou synergii těchto účinků. Vedle toho nesmíme opomenout působení přírodních látek, které se při zelené syntéze navážou a vytvoří obal AgNPsGS. AgNPsGS mají ověřený cytotoxický účinek [11,13]. Je potvrzeno, že AgNPs se na buněčné úrovni hromadí v mitochondriích a buněčném jádře [11]. Za hlavní cytotoxický mechanizmus je považována tvorba reaktivních forem kyslíku (reactive oxygen species – ROS), narušení buněčného dýchacího řetězce, indukce mitochondriálních apoptotických mechanizmů a poškození DNA buněk [11,13,14]. Jako cytotoxické terapeutikum byl zvolen doxorubicin (DOX), který je účinným a užívaným cytotoxickým léčivem [15].

Materiál a metody

Příprava apoferritinového konstruktu a následná enkapsulace DOX byla provedena obměnou přístupů Ruozi et al [16] a Li et al [12]. K zelené syntéze AgNPsGS byl použit Trifolium pratense L. Rostlina byla sušena (24 hod, 60 °C) a homogenizována mletím na částice o přibližné velikosti 1–2 mm. Směs byla míchána ve vodě (60 min, 80 °C). K připravenému extraktu byl přidán 0,1 M AgNO₃ (1: 1) a vše bylo mícháno (24 hod). Vzniklý roztok AgNPsGS byl vysrážen metanolem a vysušen. Pro základní charakterizační analýzu byla použita metoda gelové elektroforézy (sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis – SDS-PAGE) ve vertikálním systému Shirogel (VWR, ČR). Pro separaci byly použity 10% polyakrylamidové gely. Podmínky pro elektroforézu byly 120 V, 1 hod v pufru (24 mM Tris, 0,2 M glycin, 3 mM SDS). Po dokončení elektroforézy byl gel obarven pomocí stříbra. Pro důkaz enkapsulace a úspěšného otevírání a zavírání „apoferritinové klece“ s ohledem na pH prostředí byla použita metoda měření fluorescence DOX. Do mikrotitrační destičky bylo napipetováno 100 µl vzorku s koncentrací 10 μM DOX. Byla měřena fluorescence DOX s typickým emisním maximem při 650 nm. Elektrochemická měření byla provedena pomocí analyzátoru AUTOLAB Analyzer připojeného k VA-Stand 663 (Metrohm, Švýcarsko) za použití standardního uspořádání se třemi elektrodami. Byl použit Brdičkův podpůrný elektrolyt obsahující 1 mM [Co (NH₃) 6]Cl₃ a 1 M amoniakální pufr.

Výsledky

Celý konstrukt byl úspěšně připraven i povrchově modifikován pomocí AuNPs. Rovněž byl úspěšně enkapsulován DOX, který byl modifikován pomocí předem připravených AgNPsGS. Jako důkaz, že samotný nanotransportér byl plně funkční, byla provedena elektroforetická studie pomocí SDS-PAGE. Výsledkem elektroforézy bylo formování APO v závislosti na pH. Samotný APO v kyselém prostředí tvoří subjednotky o velikosti asi 20 kDa a v zásaditém prostředí se zformuje globulární protein o velikosti asi 450 kDa. Výsledkem byly charakteristické „pruhy“, které dokládaly chování APO v závislosti na acidobazických podmínkách prostředí. Stejné chování bylo pozorováno i u APO s uzavřeným DOX, což potvrzuje funkčnost základního konceptu nanotransportéru.

Pro ověření úspěšnosti enkapsulace a mechanizmu otevírání konstruktu byla zvolena metoda fluorescenční analýzy, ve které bylo využito výrazných fluorescenčních vlastností DOX. Otevírání a zavírání „apoferritinové klece“ v závislosti na acidobazických podmínkách bylo znovu potvrzeno. Touto analýzou spolu s metodou kalibrační křivky bylo zjištěno, že úspěšnost enkapsulace DOX do APO se pohybovala okolo 14 % aplikované koncentrace. Výsledkem elektrochemické studie bylo potvrzení úspěšnosti povrchové modifikace APO pomocí AuNPs.

Závěr

Úspěšně byl připraven (obr. 3) a charakterizován apoferritinový nanotransportér, do jehož dutiny bylo enkapsulováno vhodné modelové terapeutikum pro cílený transport do nádorových buněk karcinomu prostaty. Charakterizace konceptu byla provedena elektroforetickou a elektrochemickou studií, funkčnost byla ověřena fluorescenčně. Nyní je testována fototermická aktivace. Povrch „apoferritinové klece“ byl modifikován AuNPs a enkapsulovaný DOX byl modifikován pomocí AgNPsGS, čímž vznikl komplexní nanotransportér APO/AgNPsGS-DOX/AuNPs. Modifikace povrchu APO i cytostatika pomocí nanočástic je možné kombinovat a event. tak zajistit účinný a mnohostranný nanotechnologický nástroj pro cílenou terapii karcinomu prostaty.

Práce je realizována v rámci COST European Cholangiocarcinoma Network CA18122 and International Collaboration Project of The European Technology Platform for Nanomedicine.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Obdrženo: 21. 3. 2019

Přijato: 14. 5. 2019

prof. Ing. René Kizek, DrSc.

Ústav humánní farmakologie a toxikologie

Farmaceutická fakulta

Veterinární a farmaceutická

univerzita Brno

Palackého třída 1/1946

612 42 Brno

e-mail: kizek@sci.muni.cz