Sledování prognózy HPV pozitivních a negativních orofaryngeálních karcinomů v závislosti na léčebné modalitě

Súhrn

Východiska: Asociace lidského papilomaviru (human papillomavirus – HPV) s karcinomy orofaryngu jsou velmi aktuální otázkou. Důvodem je především jejich prudce stoupající incidence v posledních letech. Jedná se o skupinu nádorů etiopatogeneticky, epidemiologicky i klinicky odlišnou od ostatních karcinomů této lokality. Jejich pozitivním aspektem je lepší prognóza, vyšší chemo-a radiosenzitivita. Tato skutečnost byla ověřena mnoha rozsáhlými retrospektivními i prospektivními studiemi a akceptována natolik, že HPV status je považován za nedílnou součást standardního histopatologického vyšetření a byl zařazen jako další, biologický parametr do TNM klasifikace nádorů.

Materiál a metody: V prezentovaném souboru bylo retrospektivně hodnoceno 77 pacientů léčených na jednom klinickém pracovišti nechirurgickým postupem pro lokálně pokročilý karcinom orofaryngu.

Výsledky: Celkové i specifické přežití bylo statisticky signifikantně lepší u pacientů s HPV pozitivními (HPV+) nádory ve srovnání s pacienty s nádory HPV negativními (HPV−). HPV se ukazuje jako nejsilnější prediktor lokální kontroly, celkového i specifického přežívání, a to bez ohledu na typ léčby. Pro celkové přežívání je v našem souboru dalším významným negativním prediktivním faktorem pokročilost nádoru a kouření. Pacienti s HPV asociovanými karcinomy orofaryngu mají významně lepší prognózu bez ohledu na typ léčby. Rozdíl mezi jednotlivými léčebnými modalitami se potvrdil v celém souboru. Při dalším dělení dle HPV statusu již nikoliv, pravděpodobně na vrub malých počtů pacientů.

Závěr: Získané výsledky jsou součástí výzkumu, jehož koncepčním záměrem je deeskalace léčby HPV asociovaných nádorů. K té bude možné přistoupit až na základě výsledků rozsáhlých, v současnosti probíhajících randomizovaných studií. Volba léčebné modality, pro kterou je rozdílnost léčebných výsledků nejvýraznější, resp. specifikace konkrétního optimálního schématu deintenzifikace terapie, nebyla prozatím jednoznačně objektivizována.

Klíčová slova:

orofarynx – karcinom – HPV

Úvod

Spinocelulární karcinomy hlavy a krku představují ve světě šestou nejrozšířenější skupinu zhoubných nádorů; orální a orofaryngeální karcinomy (OFK) se podílejí na 3–5 % malignit v Evropě [1]. Výskyt nádorů hlavy a krku má všeobecně mírně klesající charakter, pravděpodobně díky klesající prevalenci kouření. Tento trend ale neplatí pro OFK, jejichž incidence naopak významně vzrůstá. V ČR počet nově diagnostikovaných nádorů orofaryngu během posledních 30 let narostl trojnásobně, v posledních letech dosáhla incidence tohoto onemocnění u nás 5–7 případů/100 000 obyvatel za rok [2].

Vedle skupiny OFK nádorů souvisejících etiopatogeneticky se známými tradičními faktory, jako je expozice tabáku a alkoholu, se vyčleňuje skupina nádorů asociovaných s lidskými papilomaviry (human papillomavirus – HPV) [3]. Tato se v současnosti považuje za zcela samostatnou jednotku s odlišnou etiopatogenezí, epidemiologií i biologickým chováním [4]. Odlišnost obou skupin je natolik klinicky významná, že HPV se v současné době akceptuje jako první prognostický nádorový marker u nádorů hlavy a krku, resp. OFK. Přestože současné léčebné standardy v ČR zatím HPV status nezohledňují ve smyslu deeskalace léčby, je tento parametr zařazen do oficiální klasifikace nádorů v poslední revizi TNM [5].

Soubor pacientů

Do retrospektivní analýzy bylo zařazeno celkem 77 nemocných s pokročilou formou OFK (stadium III + IV), kteří byli léčeni nechirurgicky v letech 2007–2013 (v Masarykově onkologickém ústavu) a následně sledováni na jednom pracovišti (Klinika otorinolaryngologie a chirurgie hlavy a krku FN u sv. Anny v Brně) dle protokolu pracoviště (tab. 1). Aplikovány byly tři léčebné modality ve vícero schématech – konkomitantní chemoradioterapie (CHRT), radioterapie s biologickou léčbou a samostatná radioterapie (RT). Aplikovaná dávka RT na oblast primárního tumoru a spádových lymfatických uzlin byla v kurativní dávce 70 Gy nebo biologicky ekvivalentní (dávka nižší než 68 Gy byla aplikována z důvodu toxicity u 15 pacientů). Při konkomitantní CHRT byla současně s RT aplikovaná chemoterapie (cisplatina 40 mg/m² týdně, s mediánem 3 série) nebo ve skupině s biologickou léčbou byla RT potencována monoklonální protilátkou cetuximabem (v nasycovací dávce 400 mg/m² a poté v týdenním podání 250 mg/m²). V prv-ních sledovaných letech byla u tří pacientů dle aktuálních protokolů aplikovaná i neoadjuvantní chemoterapie před vlastní RT nebo CHRT u tří pacientů. Indikace monomodální RT léčby se pro pokročilé tumory OFK jeví podle všeobecně akceptovaných léčebných protokolů (National Comprehensive Cancer Network, European Society for Medical Oncology) jako nedostačující, byla ale aplikována pouze v případech, kdy nebyla z důvodu špatného performance statusu pacientů přijatelná možnost vícemodalitní léčby. Pro účely naší retrospektivní analýzy srovnávající efekt jednotlivých léčebných modalit bylo ale zařazení tohoto typu léčby přínosné.

Analýza vzorků OFK od všech pacientů proběhla retrospektivně, ze vzorků získaných při verifikaci z biopsie nádoru před zahájením léčby. Pacienti byli sledováni dle protokolu našeho pracoviště – pravidelná otorinolaryngologická (ORL) vyšetření v 1. roce po ukončení léčby v měsíčních intervalech, ve 2. roce ve dvouměsíčních, ve 3. roce v tříměsíčních intervalech, následně v půlročních odstupech. Počítačová tomografie (computed tomography – CT) nebo pozitronová emisní tomografie/počítačová tomografie (PET/CT) byla provedena v intervalu 2–3 měsíců od ukončení léčby a dále dle klinické indikace. Kompletní remise byla hodnocena jako negativní nález při ORL vyšetření s negativním nálezem na CT nebo PET/CT. Všechny ostatní případy byly hodnoceny jako perzistence nemoci po léčbě. V případě kompletní remise byla rekurence nemoci charakterizována přítomností známek onemocnění při ORL vyšetření s histologickou verifikací, příp. při zobrazovací metodě, byla-li indikována.

Metody

Imunohistochemické vyšetření p16 a p53

Tkáně byly fixovány v 10% pufrovaném formalinu, konvenčním způsobem zpracovány a zality do parafínu. Tkáňové řezy tloušťky 3 µm byly umístěny na podložní sklo a nechány schnout v termostatu při teplotě 56 °C přes noc. Poté byly deparafinizovány xylenem a rehydratovány alkoholem.

Revitalizace antigenů byla provedena pomocí tlakové komory Pascal (Dako, Dánsko) v pufru pH9 po dobu 40 min při teplotě 117 °C. Aktivita endogenní peroxidázy byla blokována pomocí 3% vodného roztoku peroxidu vodíku 15 min.

Pro hodnocení p16 byla jako primární použita myší monoklonální protilátka CINtec® p16 Histology, klon E6H4 (Ventana Medical Systems, Inc., USA), detekce byla prováděna detekčním kitem Envision™ Detection Systems Peroxidase/DAB Mouse (Dako, Dánsko). Imunoreakce byla vizualizována pomocí diaminobenzidinu (DAB) (Dako, Dánsko). Jako pozitivní kontrola byl užit metaplastický dlaždicový epitel děložního hrdla s těžkou dysplazií. Jako pozitivní bylo hodnoceno hnědé zbarvení jader, popř. jader a cytoplazmy nádorových buněk, byla posuzována intenzita zbarvení ve škále +, ++ a +++ pro nejintenzivnější zbarvení a semikvantitativně bylo odhadnuto procento pozitivních buněk. Jako p16 pozitivní dlaždicový karcinom byl klasifikován nádor s více než 70% zastoupením pozitivních jader, popř. jader a cytoplazmy.

Pro hodnocení p53 byla jako primární použita myší monoklonální protilátka p53 Protein, klon DO-7 (Leica Biosystems Newcastle Ltd, Newcastle Upon Tyne, UK), v ředění 1: 2 000, a detekce byla provedena detekčním kitem Vectastain Elite ABC Kit (Mouse IgG), (Vector Laboratories Ltd., UK). Imunoreakce byla vizualizována pomocí DAB (Dako, Dánsko). Jako pozitivní kontrola byl užit dlaždicový karcinom se známou expresí p53. Jako pozitivní bylo hodnoceno hnědé zbarvení jader nádorových buněk, byla posuzována intenzita zbarvení ve škále +, ++ a +++ pro nejintenzivnější zbarvení a semikvantitativně odhadnuto procento pozitivních buněk. Jako p53 pozitivní dlaždicový karcinom byl klasifikován nádor s více než 10% zastoupením pozitivních jader.

Statistická analýza

Data byla analyzována pomocí Kaplanovy-Meierovy metody, která poskytla odhad funkce přežití. Pro ověření shody přežití v různých skupinách pacientů byly použity tyto testy: log-rank test, Gehanův-Wilcoxonův test a chí-kvadrát test. Dále byl pomocí zpětné krokové metody vybudován Coxův regresní model proporcionálních rizik, který mj. poskytl odhad poměru rizik společně s 95% intervaly spolehlivosti.

Hladina významnosti pro všechny testy byla zvolena α = 0,05. S touto hladinou byla vždy porovnávána vypočtená p-hodnota příslušného testu. Pokud bylo p ≤ α, nulová hypotéza byla zamítnuta na hladině významnosti α = 0,05.

Tabulkové a grafické zpracování dat bylo provedeno pomocí statistického softwaru StatSoft, Inc. (2013), STATISTICA (data analysis software system, version 12, www.statsoft.com).

Výsledky

Hlavním cílem bylo sledování prognózy OFK v závislosti na HPV statusu s přihlédnutím k závislosti na léčebné modalitě. V nechirurgicky léčené skupině jsme hodnotili léčebnou odezvu. Kompletní remise dosáhlo nejvíce pacientů léčených CHRT (91 %), dále RT v kombinaci s biologickou léčbou (RT + BIO) (60 %) a RT (66 %). Celkové 5leté přežití (overall survival – OS) souboru činilo 38 %. Srovnání pacientů dle pohlaví ukázalo lepší prognózu pro ženy (p = 0,0169). OS i interval bez recidivy byly statisticky signifikantně lepší u pacientů s HPV pozitivními (HPV+) nádory ve srovnání s pacienty s nádory HPV negativními (HPV−) (z = 2,92; p = 0,0035) (graf 1, 2). HPV se ukazuje jako nejsilnější prediktor OS při hodnocení Coxovou regresní analýzou (poměr rizik 2,99; p = 0,0115).

V našem souboru se potvrdil i význam prognostického parametru p53, jehož zvýšenou expresi jsme zaznamenali významně vyšší u HPV− OFK. Ve srovnání p53+ proti p53− je patrný trend rozdílné prognózy onemocnění, asociace p53 s horší lokální kontrolou onemocnění i OS, ovšem nikoliv statisticky významné (p = 0,147; p = 0,146) (graf 3, 4).

Při srovnání léčebných modalit je zjevný, ovšem statisticky nesignifikantní rozdíl OS a délky remise onemocnění, ve srovnání CHRT, RT a biologická léčba (p = 0,147; p = 0,123) hovořící ve prospěch CHRT v obou parametrech (graf 5, 6).

Při srovnání jednotlivých terapeutických skupin v rámci HPV+ a HPV− byla potvrzena větší průkaznost tohoto trendu, i když skupina léčená biologickou léčbou je málo početná (p = 0,062 pro skupinu CHRT a p = 0,064 pro léčbu RT, p = 0,606 pro biologickou léčbu) (graf 7, 8).

Při hodnocení negativního dopadu abúzu kouření a alkoholu, při vzájemném srovnání skupin kuřáků proti nekuřákům a abstinentů, resp. příležitostných konzumentů alkoholu proti pravidelným konzumentům (denně) byl patrný významný rozdíl OS pro celý soubor pacientů bez ohledu na p16 status. Hodnoceno bylo 57 pacientů, u 20 údaj o kouření nebyl zjistitelný (p = 0,0530 pro kouření a p = 0,0151 pro alkohol) (graf 9, 10).

Vliv kouření byl patrný u souboru p16− nádorů (p = 0,0485) (graf 11). Signifikantní rozdíl jsme zaznamenali při rozdělení skupin s ohledem na p16 status i kouření, kdy se bere v potaz samostatná prognosticky odlišná skupina p16+ kuřáků, tj. srovnání p16−, p16+ kuřáci, p16+ nekuřáci, kdy byla staticky významně potvrzena prognostická odlišnost skupin (p = 0,0185) (graf 12). Pomocí logistické Coxovy analýzy byl vyhodnocen status p16, pokročilost nádoru T a kouření jako faktory významně ovlivňující přežívání pacientů (poměr rizik 2,99; 2,18; 1,74; p = 0,0115; 0,0604; 0,135) (tab. 2).

Tab 2. Coxův regresní model proporcionálních rizik.

Diskuze

Lidský papilomavirus byl poprvé identifikován v roce 1949 [6], v etiopatogenezi OFK se uplatňují především typy 16 a 33, nejrozšířenější je jednoznačně HPV 16. Perzistence HPV infekce představuje významně vyšší riziko vzniku karcinomu. Změny regulačních proteinů buněčného cyklu p53 a Rb proteinu vedou ke zvýšené expresi p16 proteinu, jehož imunohistochemickou detekci tak lze využít jako nepřímý marker infekce vysoce rizikovými kmeny HPV.

Retrospektivní analýzy potvrzují tento trend vzestupné incidence HPV asociace s OFK i prevalence HPV perzistující infekce orofaryngu jako rizikového faktoru [7].

V posledních desetiletích současně s incidencí OFK narůstá podobným způsobem i prevalence HPV v OFK; jejich asociace s HPV je udávána u OFK v širokém rozmezí asi 45–95 % OFK [8,9]. V našem souboru 77 pacientů byla necelá polovina nádorů (39 %) asociovaná s infekcí HPV.

Jednou z nejrozšířenějších metod ke stanovení HPV u pacientů s OFK je imunohistochemická detekce proteinu p16, jenž je za normálních podmínek detekovatelný jen v nevýznamné míře [10]. Protein p16 je vysoce senzitivním, ale nikoliv zcela specifickým ukazatelem aktivní replikace HR HPV. I když je p16 exprese zařazena do poslední verze TNM klasifikace pro OFK nádory jako dostatečný marker, pro účely studií je stále vhodné používat detekci HPV RNA či pozitivitu na expresi p16 a zároveň přítomnost HPV DNA [5].

Pro zvýšení specificity se toto vyšetření v praxi často kombinuje s průkazem dalších markerů, např. p53 [11].

Dostatečnosti imunohistochemického stanovení p16 jako orientačního markeru diagnostiky se věnovalo vícero autorů a bylo potvrzeno i na prospektivní analýze souboru více než 400 pacientů [12]. Přestože nelze stavět imunohistochemické vyšetření p16 na úroveň samotné detekce HPV DNA a nesmí se opomíjet existence malé skupiny pacientů p16 pozitivních a HPV negativních, je přesto toto vyšetření považováno v klinické praxi za vhodné, rutinně aplikovatelné, kompromisní a cenově dostupné [13]. Vyšetření p16 jsme využili i při hodnocení našeho souboru pacientů.

Podskupina HPV+ nemocných je odlišná nejen etiopatogeneticky, epidemiologicky, ale i klinicky od HPV−. Nemocní jsou většinou v lepším celkovém zdravotním stavu [14], histopatologicky bývají HPV+ OFK nízce diferencované, nekeretinizující, typický je bazaloidní typ [15]. Nádory se typicky diagnostikují až ve stadiu pokročilého onemocnění, zejm. kvůli charakteristické přítomnosti krčních uzlinových metastáz, často cystických, v době diagnostiky i při poměrně malém primárním nádoru (T1–T2) [16]. I v našem souboru je patrná odlišnost pacientů, vyšší podíl nekuřáků, poměrně vyšší zastoupení žen i vyšší výskyt uzlinových metastáz. Prognosticky, jak bylo výše zmíněno, HPV+ OFK převyšují HPV− nádory nezávisle na věku, pohlaví, stadiu, diferenciaci [3]. U těchto nádorů je menší prognostický význam uzlinových metastáz, který je jinak považován za jeden z nejvýznamnějších negativních prognostických faktorů zhoršující OS [17]. Někteří tuto skutečnost přičítají statisticky významně nižší expozici tabáku, alkoholu a kouření a lepšímu celkovému stavu s relativně vyšším performance statusem ve skupině HPV asociovaných tumorů. Na našem souboru byl rozdíl 5letého OS pro HPV+ 60 vs. 32 % u HPV– OFK. Většinou se ale spojuje s vyšší radio-a chemosenzitivitou těchto tumorů, která je vysvětlována alespoň částečně funkčním p53 zajišťujícím apoptózu a minimalizující chromozomální aberace [18], resp. imunologickými faktory souvisejícími s HPV infekcí [19].

I v našem souboru se jednoznačně potvrdil prognostický rozdíl ve sledovaných parametrech celkového přežití i lokální kontroly, jak jsme předpokládali, s jednoznačně lepšími výsledky pro HPV+ nádory.

I když je stále nejasné, zda je kouření rizikovým faktorem pro indukci HPV+ OFK [20,21], má pro ně negativní prognostický význam [22], což bylo potvrzeno i v našem souboru, kde se i v rámci skupiny HPV asociovaných nádorů jednoznačně projevil vliv abúzu tabáku na negativní prognózu. Význam HPV převyšuje vliv kouření, ale signifikantně horší je prognóza kuřáků v rámci skupiny HPV+ pacientů proti nekuřákům. Stratifikovat pacienty s OFK lze do 3 skupin podle rizika – nízké (HPV+ nekuřáci), střední (HPV+ kuřáci) a vysoké (HPV−) [22,23].

Při popsané prognostické výhodě HPV+ OFK se nabízí možnost deeskalace terapie u HPV asociovaných prognosticky příznivějších nádorů s cílem snížit toxicitu při zachování výsledků léčby a lokální kontroly. Prospektivně se testují ve studiích různé cesty deeskalace léčby (redukce dávky RT či ozařovaného objemu, redukce chemoterapeutika nebo adjuvantní RT) [24,25]. Jednoznačnou prognostickou výhodu HPV+ OFK napříč terapeutickými modalitami potvrdila rozsáhlá metaanalýza zahrnující přes 5 600 pacientů [26].

V recentní retrospektivní studii z jednoho pracoviště hodnotícího efektivitu léčby se pro HPV asociované OFK potvrdil, v souladu s podobnými studiemi, i rozdíl v odpovědi na podávanou systémovou léčbu, se signifikantně horšími výsledky cetuximabu proti tradiční chemoterapii na bázi platiny. Ani v našem souboru se benefit z navýšení RT o biologickou léčbu nepotvrdil.

V rámci našeho souboru se sice potvrdil signifikantní vliv HPV asociace na prognózu, stejně jako vyšší účinnosti multimodalitní terapie, optimálně CHRT, proti pouhé RT, ovšem zásadní rozdíl se v rámci souborů HPV+ a HPV− samostatně nepotvrdil; vysvětlením může být nízká četnost pacientů v jednotlivých skupinách při relativní heterogenitě aplikované léčby (RT, CHRT, RT + BIO).

Popsána je p53 overexprese, která koreluje s jeho mutací, hojná u spinocelulárních karcinomů hlavy a krku; i když výsledky jednotlivých studií nejsou zcela jednoznačné vzhledem k heterogenitě souborů. Proto je z tohoto parametru jen obtížné vyvozovat klinické dopady jakožto využitelný biologický parametr nádoru [27].

Většinou se potvrdila záporná korelace mutace p53 s HPV asociací, tj. mutace u HPV+ nádorů je považována za vzácnou, na rozdíl od HPV− nádorů [28].

I v našem souboru se potvrdila záporná korelace exprese p53 s HPV statusem a prognostický rozdíl mezi skupinami p53+ a p53−.

Snaha o implementaci získaných poznatků a projekci do běžné praxe v budoucnu by měla navazovat na změnu klasifikace systému. Aspekt HPV etiologie se zařadil vedle morfologických charakteristik nádoru jako další faktor rozhodující o jeho klasifikaci. Tento fakt reflektuje 8. edice American Joint Committee on Cancer TNM, jejíž česká verze vyšla v roce 2017 [5,29,30].

Masivní nárůst výskytu OFK indukovaných HPV infekcí v posledních dvou dekádách je alarmující. Vzhledem k tomu, že HPV 16 je odpovědná až za 94 % HPV+ OFK, dá se předpokládat, že je vakcinace vysoce účinná i v prevenci OFK, při vakcinaci jak dívek, tak chlapců.

Závěr

V současnosti se již jednoznačně považují HPV asociované nádory za svébytnou, etiopatogeneticky, epidemiologicky i klinicky odlišnou jednotku v souboru všech OFK s prudce stoupající incidencí v posledních desetiletích. HPV asociace je jednoznačně považována za prognosticky pozitivní parametr.

Rutinní testování všech vzorků OFK na HPV při verifikaci nádorového onemocnění by mělo být v dnešní době již standardem. V aktuální verzi TNM 8 je HPV status již součástí kompletní rutinní histopatologické diagnostiky. Kromě morfologicko-anatomických parametrů je zásadním faktorem určujícím prognózu onemocnění a v budoucnu nejspíše i faktorem důležitým při léčebné stratifikaci. Ke zvažované deeskalaci léčby HPV+ pacientů bude možné přistoupit až na základě výsledků rozsáhlých randomizovaných studií, které v současnosti probíhají. Specifikaci konkrétního schématu deeskalace, resp. výběr modality léčby, pro kterou je rozdílnost léčebných výsledků nejvýraznější a která by naznačila optimální cestu deeskalace, se dosud nepodařilo jednoznačně objektivizovat.

Tato práce byla podpořena granty IGA MZ ČR NT12483-4/2011 a AZV MZ ČR 15-31627A.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Obdrženo: 21. 9. 2018

Přijato: 14. 5. 2019

MUDr. Binková Hana, Ph.D.

Klinika otorinolaryngologie a chirurgie hlavy a krku

LF MU a FN u svaté Anny v Brně

Pekařská 664/53

656 91 Brno

e-mail: binkova.ha@seznam.cz