Imunohistochemická analýza retrakční kapsy pars tensa ušního bubínku u dětí

Souhrn

Cíle:
Imunohistochemická analýza retrakční kapsy pars tensa ušního bubínku u dětí. Identifikace znaků typických pro cholesteatom a podpora retrakční teorie vzniku cholesteatomu.

Metody:
Retrakční kapsy zpracované standardním procesem pro účely imunohistochemie. K upřesnění pozorovaných nálezů byly použity protilátky CD45 LCA (společný leukocytární antigen), CD31 (marker endotelií krevních cév), D2-40 (marker endotelií lymfatických cév), MMP9 (marker degradace extracelulární matrix pojivové tkáně) a Ki67 (nukleární marker buněčné proliferace).

Výsledky:
Ve všech sledovaných parametrech kromě MMP9 jsme pozorovali signifikantně vyšší výskyt u retrakčních kapes stadia III než u stadia II dle Charachona.

Závěr:
Popsali jsme imunohistochemické znaky retrakční kapsy pars tensa ušního bubínku u dětí, které se běžně vyskytují ve struktuře matrix a perimatrix cholesteatomu. U všech sledovaných parametrů kromě MMP9 jsme prokázali signifikantně vyšší výskyt u retrakčních kapes stadia III než u stadia II. Na základě našich pozorování se domníváme, že retrakční kapsa je progresivní onemocnění a že se jedná o precholesteatomové stadium.

Klíčová slova:
retrakční kapsa, imunohistochemická analýza, cholesteatom, dětský věk

ÚVOD

Retrakční kapsa ušního bubínku (RK) je lokalizovaná oblast bubínku vpáčená směrem do bubínkové dutiny. Na rozdíl od zdravého ušního bubínku, který je popsán jako relativně tuhá, elastická membrána bez tendence ke kolapsu, je RK poddajná a s tendencí ke kolapsu do dutiny bubínkové. RK je charakterizována oslabením části bubínku, ve které dochází k vtahování bubínku nejčastěji v oblasti kostěných anatomických struktur jako je incisura Rivini, scutum nebo kladívko (1). RK se může vyskytovat ve všech kvadrantech pars tensa bubínku, stejně tak může postihovat oblast pars flaccida. Může postihovat i obě části bubínku zároveň. RK vzniká v důsledku dlouhotrvajícího nebo recidivujícího podtlaku ve středním uchu, který je způsoben především dysfunkcí Eustachovy trubice (2, 4, 8, 9, 10). Na druhé straně zde existují teorie a hypotézy, které tvrdí, že v patogenezi vzniku RK se uplatňuje přítomnost mesenchymu nebo zánětlivé reakce v návaznosti na otitidu ve středním uchu, především v zadním horním kvadrantu pars tensa a v oblasti pars flaccida, což jsou dvě místa typická pro vznik retrakční kapsy a atelektázy. Někteří autoři tvrdí, že bez zánětu retrakce nevzniká (21,26). Tyto dvě lokality jsou obecně nejvíc poddajné oblasti ušního bubínku a jsou tedy nejvíce náklonné k invaginaci v přítomnosti podtlaku ve středouší.

Existuje několik málo histologických studií, které popisují poruchu kontinuity bazální membrány u cholesteatomu a které podporují retrakční teorii vzniku cholesteatomu a ještě méně prací, které popisují histologickou a imunohistochemickou strukturu RK a případné znaky vedoucí ke vzniku cholesteatomu (21). Sadé zkoumal atelektatické ušní bubínky a pozoroval degeneraci prostřední pojivové vrstvy bubínku, ke které dle jeho názoru dochází v důsledku zánětlivého procesu zde probíhajícího (20). Sudhoff a Toss ve svých pracích popisují poruchu kontinuity bazální membrány cholesteatomu. Tyto disrupce bazální membrány jsou lokalizované v oblastech prorůstajících epitelových čepů (rete pegs) a ložisek subepiteliálního zánětlivého infiltrátu (24, 25). Na základě těchto a dalších pozorování tito autoři podporují retrakční teorii vzniku cholesteatomu na podkladě mechanismu invaginace bubínku a následné proliferace epitelu, která způsobí hyperplazii, poruchu buněčné migrace a tvorbu a hromadění keratinu, čímž vzniká základ cholesteatomu. Jejich pozorování se týkala pouze cholesteatomu a dodnes existuje velmi málo prací studujících v této souvislosti přímo retrakční kapsu jako možný prekurzor cholesteatomu.

Naše studie prezentuje imunohistochemickou analýzu retrakční kapsy pars tensa ušního bubínku (RK) u dětí. Popisuje abnormity RK ušního bubínku a znaky typické pro cholesteatom.

METODY

Prospektivní studie ve které bylo histologicky vyšetřeno 31 RK pars tensa ušního bubínku odebraných během standardních plánovaných operacích u dětských pacientů. Jednalo se o RK stadia II a III dle Charachona, bez známek progrese cholesteatomu. Indikace k operačnímu řešení RK byly: nedoslýchavost v souvislosti s RK, recidivující infekce nebo otomikroskopicky sledována progrese onemocnění. Ze studie byly vyloučeny případy RK s klinickými znaky cholesteatomu a RK, které nebylo možno odstranit vcelku. Ve všech případech následovala po odstranění RK rekonstrukce bubínku chondroperichondriovým štěpem z tragu.

Všichni pacienti podstoupili předoperační vyšetření zahrnující odebrání anamnézy, otomikroskopické vyšetření, tympanometrické výšetření a audiometrické vyšetření sluchu (tónová audiometrie).

RK byly rozděleny do 2 skupin dle klasifikace dle Charachona (II – RK kontrolovatelná, fixovaná, III – RK nekontrolovatelná, fixovaná). RK stadia I (kontrolovatelná a nefixovaná) standardně neoperujeme.  

Imunohistochemie byla prováděna na parafínových řezech o síle 2-3 µm v automatu Benchmark XT (Ventana Medical Systems, Inc.). Po zablokování endogenní peroxidázy H₂O₂ (Ventana, iVieW kit 760-091) a revitalizaci antigenu pufrem CC1 (Ventana, 950-124) byly aplikovány primární protilátky CD31 (Dako Agilent M0823, klon JC70A, 1:20, inkubace 30 minut), D2-40 (Dako Agilent M3619, klon D2-40, 1:50, inkubace 60 minut), Ki67 (Dako Agilent M7240, klon Mib-1, 1:100, inkubace 30 minut), CD45 LCA (Dako Agilent M0701, klon 2B11+PD7/26, 1:100, inkubace 30 minut) a MMP9 (DAKO Agilent A0150, polyklon, 1:100, inkubace 15 minut). Následně byl použit detekční kit iView DAB Detection Kit (Ventana,760-091), Hematoxylin (Ventana, 760-2021) a Bluing reagent (760-2037).

V optickém mikroskopu typu BX45 firmy Olympus byla kvalitativně hodnocena pozitivita cytoplazmy a buněčné membrány u protilátek D2-40 a CD31, cytoplazmatická pozitivita u protilátky MMP9 a membránová pozitivita u protilátky CD45 LCA. Jaderná exprese byla vyjádřena kvantitativně u protilátky Ki67.

Při hodnocení imunohistochemického zpracování byla použita následující metodika:

Průkaz CD45 LCA (Leukocyte common antigen) – jedná se o protein z kategorie tyrozin fosfatáz, typický pro bílé krvinky všech kategorií. V CD45 LCA hodnocených preparátech byla hodnocena absolutní přítomnost elementů s membránovou pozitivitou. Přítomnost těchto elementů byla hodnocena jak v epitelu, tak ve vazivovém stromatu bubínku. Počet elementů je absolutní v celém preparátu.

Průkaz MMP9 (Matrix metaloprotináza 9) – jedná se o metaloenzym z kategorie peptidáz nazývaný též kolagen typ IV gelatináza B. Je to enzym spolupodílející se na degradaci extracelulární matrix vazivové tkáně a jeho pozitiva jsou sledována u některých invazivních karcinomů, např. invazivního uroteliálního karcinomu močového měchýře. Spolupodílí se na degradaci epitelové bazální membrány. V zastižených preparátech byly hodnoceny všechny MMP9 cytoplazmaticky pozitivní elementy. Počet elementů ve vazivovém stromatu je absolutní v celém preparátu, významné hotspoty nebyly sledovány.

Průkaz CD31 (Platelet endothelial cell adhesion molecule - PECAM1) – CD31 je v histopatologické praxi díky své vysoké senzitivitě a specifitě užívaný jako marker endotelií krevních cév. V zastižených preparátech byly hodnoceny jako pozitivní všechny cévní struktury s výstelkou s jednoznačnou silnou pozitivitou buněčné membrány i cytoplazmy. Počet krevních cév je absolutní v celém preparátu.

Průkaz D2-40 (Podoplanin) – jedná se o membránový mukoprotein v histopatologické praxi používaný jako marker endotelií lymfatických cév. V zastižených preparátech byly hodnoceny jako pozitivní všechny lymfatické cévní struktury s výstelkou s jednoznačnou silnou pozitivitou buněčné membrány i cytoplazmy. Počet lymfatických cév je absolutní v celém preparátu.

Průkaz Ki67 – jedná se o nukleární marker buněčné proliferace exprimovaný v jádře buňky pouze v pozdní G1 fázi, S fázi a G2 fázi buněčného cyklu. V zastižených preparátech byly hodnoceny jako pozitivní všechny epitelie s výraznou nukleární pozitivitou. Klasifikace pozitivních epitelií byla dále rozdělena do dvou kategorií. První hodnocenou kategorií byla bazální vrstva skvamózního epitelu, kdy byly hodnoceny pouze buňky nad bazální membránou, ve druhé hodnocené kategorii byly všechny elementy dlaždicového epitelu suprabazálně ve vyšších etážích. Pro nerovnoměrnost a nesymetrii tloušťky skvamózního epitelu v jednotlivých vzorcích byly počítány všechny nukleárně pozitivní epitelie suprabazálně. Počet takto hodnocených pozitivních vzorků je absolutní.

Za účelem statistického vyhodnocení imunohistochemických dat byla použita metoda Principal Component Analysis (PCA). PCA umožňuje určit a prozkoumat hlavní zdroje rozptylu v datech, stejně jako korelace mezi nimi a původními proměnnými a mezi původními proměnnými v multidimenzionálním prostoru. Tuto metodu jsme zvolili jako nejoptimálnější vzhledem k tomu, že jsme hodnotili absolutní počty sledovaných znaků vždy v celém preparátu, délka a tloušťka jednotlivých retrakčních kapes nebyly vždy stejné.

VÝSLEDKY

V oblasti zevní vrstvy bubínku (epidermis) jsme popsali výskyt Ki67 v buňkách bazální i suprabazálních vrstev (obr. 1). Toto pozorování svědčí o zvýšené proliferační aktivitě skvamózního epitelu. Prokázali jsme signifikantně vyšší výskyt Ki67 v suprabazální vrstvě epidermis než v bazální vrstvě epidermis (p-value < 0,0000005, Mann - Whitney U test). Dále jsme prokázali signifikantně vyšší výskyt Ki67 u RK stadia III než u stadia II (p-value = 0.00438).

V oblasti prostřední vrstvy bubínku (pojivová tkáň) jsme popsali pozitivitu CD31, která je typická pro endotel cév (obr. 2). Prokázali jsme signifikantně vyšší výskyt CD31 u RK stadia III než u stadia II (p-value = 0.02052).

V oblasti zevní epitelové i prostřední pojivové vrstvy bubínku jsme popsali výskyt CD45 LCA, který je typický pro bílé krvinky všech kategorií (obr. 3). Prokázali jsme signifikantně vyšší výskyt CD45 LCA u RK stadia III než u stadia II (p-value = 0.00338).

V oblasti prostřední vrstvy bubínku jsme pozorovali pozitivitu D2-40, který je typický pro lymfatické cévy (obr. 4). Prokázali jsme signifikantně vyšší výskyt D2-40 u RK stadia III než u stadia II (p-value = 0.0286).

V oblasti prostřední vrstvy bubínku jsme pozorovali pozitivitu MMP9, co svědčí o přítomnosti degeneračních procesů v extracelulární matrix pojivové tkáně (obr. 5). Neprokázali jsme signifikantně vyšší výskyt MMP9 u RK stadia III než u stadia II (p-value = 0.1419). Uvedené statistické vyhodnocení ukazuje graf 1. Absolutní počty sledovaných imunohistochemických znaků u stadia II a III RK popisuje tabulka 1.

DISKUSE

Tato práce zkoumá imunohistohcemickou strukturu retrakční kapsy pars tensa ušního bubínku u dětí. Prokazuje abnormity v retrakční kapse, které se vyskytují ve struktuře cholesteatomu. Některé z těchto znaků se vyskytují s vyšší frekvencí a ve větším rozsahu u vyššího stupně retrakční kapsy, což podporuje tvrzení, že retrakční kapsa je precholesteatomové stadium. Imunohistochemické nálezy v našem souboru zkoumaných retrakčních kapes představují zvýšený výskyt CD45 LCA (společná leukocytární antigen), CD31 (marker endotelií krevních cév), D2-40 (marker endotelií lymfatických cév), MMP9 (marker degradace extracelulární matrix pojivové tkáně) a Ki67 (nukleární marker buněčné proliferace).

Ve většině prací je za hlavní etiologický faktor vzniku retrakční kapsy považován dlouhodobý podtlak ve středním uchu způsobený dysfunkcí sluchové trubice (2, 4, 8, 9, 10). Několik málo studií poukazuje na fakt, že ke vzniku retrakce nestačí pouze samotná přítomnost podtlaku (6, 12). Někteří autoři považují za důležitý faktor vedoucí ke vzniku retrakce bubínku poškození prostřední kolagenové vrstvy, ke kterému dochází působením zánětu (9, 21).

Cholesteatom středního ucha je charakterizován hyperproliferací keratinocytů a známkami chronického zánětu. Je schopen invazivního růstu s destrukcí okolní kosti a středoušních struktur. Několik studií prokázalo, že za invazivní a hyperproliferativní chování cholesteatomu jsou zodpovědné autokrinní a parakrinní faktory. Ki67 je jaderný protein exprimovaný ve všech aktivních fázích buněčného cyklu (tj. ve všech vyjma G0 fáze). Indikuje růst a dělení buňky. Je používán jako nejdůležitější marker proliferační aktivity, zejména u nádorů. Bylo prokázáno, že exprese Ki67 je u cholesteatomu významně vyšší v porovnání s normální zdravou kůží a že je tedy zodpovědný za hyperproloferativní chování (5, 13). Byla prokázána signifikantně vyšší exprese Ki67 u cholesteatomu v porovnání s jinými formami chronické otitidy bez cholesteatomu (27).Tato exprese byla vyšší ve vrchních (suprabazálních) než v bazálních vrstvách matrix cholesteatomu (5). Naopak nebyl prokázán rozdíl v expresi Ki67 mezi dětským a dospělým cholesteatomem, Ki67 tedy není pravděpodobně zodpovědný za větší agresivitu dětského cholesteatomu (23). My jsme prokázali, že aktivita Ki67 je signifikantně vyšší u RK stadia III než u stadia II. Toto pozorování je v souladu s literárními údaji, které potvrzují, že zvýšená exprese Ki67 je odpovědná za hyperproliferativní aktivitu cholesteatomu. Na základě našeho pozorování se domníváme, že zvýšená exprese Ki67 u retrakční kapsy může hrát roli v její progresi v cholesteatom.

CD31 je jednoduchý transmembránový protein. Je exprimován na povrchu souvislého endotelu (arterie, arterioly, vény, venuly), ne však v endotelu nesouvislém (červená pulpa sleziny). Dále se nachází na povrchu megakaryocytů a krevních destiček, myeloidních buněk, NK buněk a některých B a T prekurzorů. Používá se k detekci krevních cév. CD31 se s vysokou četností vyskytuje především v pojivové tkání perimatrix cholesteatomu (11). Studie porovnávající mikrovaskulární denzitu cholesteatomu a kůže zvukovodu prokázaly signifikantně vyšší četnost CD31 ve struktuře cholesteatomu (5). Signifikantně větší mikrovaskulární denzitu má cholesteatom u dětí než u dospělých (3). My jsme prokázali, že výskyt CD31 je signifikantně vyšší u RK stadia III než u stadia II. Na základě našeho pozorování se domníváme, že zvýšená mikrovaskulární denzita v retrakční kapse může hrát roli v její progresi v cholesteatom.

Společný leukocytární antigen (LCA). CD45 je transmembránový glykoprotein exprimovaný na většině jaderných krvetvorných buněk. Je používán k diagnostice hematopoetických buněk a nádorů z nich odvozených. Byla prokázána signifikantně vyšší exprese CD45 u cholesteatomu v porovnání s jinými formami chronické otitidy bez cholesteatomu (27). Bylo prokázáno, že ve struktuře cholesteatomu převažuje významně počet aktivovaných T - lymfocytů a makrofágů, naopak malá zastoupení mají B - lymfocyty (22, 24). My jsme prokázali, že výskyt CD45 je signifikantně vyšší u RK stadia III než u stadia II. Na základě našeho pozorování se domníváme, že zvýšený výskyt zánětlivých elementů v retrakční kapse může hrát významnou roli v její progresi v cholesteatom.

Podoplanin (D2-40) je sialoglykoprotein přítomný v různých tkáních. Byla zjištěna reakce s endotelem lymfatických cév, endotel krevních cév je naopak negativní. Je užitečným markerem při zjišťování nádorové lymfangioinvaze. Bylo prokázáno, že v matrix cholesteatomu dochází k degeneraci lymfatických cév. Imunohistochemická studie, která mapovala výskyt a rozložení lymfatických cév ve struktuře normálního ušního bubínku prokázala, že za normálních okolností se lymfatické cévy vyskytují pouze v okolí manubria kladívka a v pars flaccida bubínku. Pokud dojde k perforaci ušního bubínku, dochází v průběhu několika dní k rychlé regeneraci a prorůstání lymfatických cév i do oblasti pars tensa, a to především z oblasti manubria. Lymfatické cévy tak pravděpodobně hrají důležitou roli ve spontánním hojení perforace (15). Lymfatické cévy byly popsány jen málo v edematózní části perimatrix cholesteatomu. Lymfatické cévy obsahovaly hlen a sestávaly z degenerovaných endoteliálních buněk. Edém perimatrix vzniká degenerací lymfatických cév. Normální lymfatické cévy byly nalezeny ve fibrózní perimatrix. Degenerace pojivové tkáně v důsledku lymfatického edému byla přítomna v perimatrix (16, 17). My jsme prokázali, že výskyt D2-40 je signifikantně vyšší u RK stadia III než u stadia II. Zároveň jsme pozorovali narušení dvojité kolagenní vrstvy bubínku s degenerativními změnami (26). Na základě našeho pozorování se domníváme, že zvýšený počet lymfatických cév v retrakční kapse může hrát roli v její progresi v cholesteatom, a to tak, že se jejich degenerace podílí na narušení kolagenní vrstvy bubínku.

MMP9 – matrixmetaloproteináza 9, známá též jako gelatináza, patří do rodiny enzymů metaloproteináz závislých na zinku. Podílí se na degradačních procesech extracelulární matrix během fyziologických procesů, jako jsou angiogeneze, reprodukce, embryonální vývoj, vývoj a růst kosti, hojení ran a další. Způsobuje degradaci kolagenu typu IV a hraje klíčovou roli v migraci buněk v prostředí zánětu. Bylo prokázáno, že MMP9 se vyskytuje se signifikantně větší četností ve struktuře matrix cholesteatomu než ve struktuře zdravé epidermis, a že se významně uplatňuje v patogenezi cholestaetomu (18). Byla prokázána signifikantně větší aktivita MMP9 u dětského cholesteatomu než u cholesteatomu dospělých, podílí se tak pravděpodobně na větší agresivitě dětského cholesteatomu (3). My jsme prokázali, že výskyt MMP9 není signifikantně větší u RK stadia III než u stadia II. Výskyt MMP9 jsme ale pozorovali u obou stadií RK s vysokou četností a je domníváme se, že je to další ze znaků, který může hrát roli v progresi retrakční kapsy v cholesteatom.

Tato práce podporuje retrakční teorii vzniku cholesteatomu v dětském věku. Poskytuje důkazy o tom, že na vzniku retrakční kapsy se podílí nejenom podtlak ve středním uchu, ale že klíčovou roli sehrává působení zánětu, oslabení a destrukce prostřední vrstvy bubínku, čímž se bubínek stává k podtlaku náchylnější, co prokázala i předchozí studie (26). Jsme si vědomi nedostatku studie v tom, že nemáme kontrolní skupinu, kterou by měly tvořit zdravé dětské ušní bubínky. Získání takového materiálu je v našich podmínkách nereálné.

ZÁVĚR

V současnosti existuje omezený počet prací zabývajících se histologickou analýzou retrakční kapsy pars tensa ušního bubínku a jejího vztahu k cholesteatomu v dětském věku. Tato práce navazuje a podporuje některé práce předešlé. Popsali jsme změny na úrovni imunohistochemie, kdy jsme prokázali, že u retrakčních kapes stadia III je signifikantně vyšší výskyt Ki67 (hyperproliferace), CD31 (novotvorba cév), CD45 (zánět) a D2-40 (lymfatické cévy) než u stadia II. Naopak jsme na rozdíl od některých autorů nepozorovali poruchu kontinuity bazální membrány. U obou stadií retrakční kapsy jsme s vysokou četností pozorovali výskyt MMP9 (degenerace pojivové tkáně). Na základě našich pozorování se domníváme, že v případě retrakční kapsy se jedná o progresivní onemocnění, které může vést ke vzniku cholesteatomu.

Práce byla podpořena projekty: MUNI/A/0814/2016 a SuP9/16.

Adresa ke korespondenci:

MUDr. Milan Urík, Ph.D.

Klinika dětské ORL LF MU a FN

Černopolní 9

613 00 Brno

e-mail: docttor.urik@gmail.com