Hyaluronát – nejen pasivní pozorovatel, nýbrž aktivní modulátor imunitních reakcí

Článek již byl publikován v New EU Magazine of Medicine 2009; 1–2: 75–79.

Hyaluronát (též hyaluronová kyselina či hyaluronan, HA) je nesulfatovaný glykosaminoglykan, který je nejdůležitější složkou mezibuněčné hmoty (ponejvíce se vyskytuje ve vazbě se sodíkem jako hyaluronát sodný). Lidské tělo o hmotnosti 70 kg obsahuje přibližně 15 g této látky, která je neustále obnovována. Vedle všeobecně známé skutečnosti, že pro okolní buňky vytváří jakési lešení, bývá zmiňován rovněž v kontextu své schopnosti vázat na sebe vodu, a přispívat tak k optimální hydrataci tkáně. Pro své vynikající viskoelastické vlastnosti je hojně využíván v oční chirurgii, při artroskopických operacích, jako výplň vrásek v plastické chirurgii, při terapii močové inkontinence, intraartikulárně při osteoartróze, při endoskopických operacích k prevenci jizvení, k intravezikální instilaci při cystitidách a v očních či nosních kapkách.

Podle recentních zjištění však HA není jen „pasivním pozorovatelem“, nýbrž se aktivně účastní imunologických procesů jako signální molekula a ovlivňuje mobilitu a adhezivitu buněk v rámci jejich proliferace a diferenciace. Tyto jeho imunomodulační vlastnosti se již nyní využívají při urychlení hojení a epitelizace poranění a zánětů na kůži, v ústní dutině a nově i ve formě poševních čípků Cicatridina^® také na vaginální sliznici a epitelu děložního čípku.

Fyzikálně‑chemické vlastnosti

Chemická struktura hyaluronátu byla popsána v 50. letech minulého století. Po chemické stránce se jedná o nevětvený mukopolysacharid složený z b(1,3)-D-glukuronové kyseliny a b(1,4)-N-acetyl-D-glukosaminu v poměru 1 : 1 (obr. 1). Na rozdíl od jiných glykosaminoglykanů zastoupených v mezibuněčné hmotě (např. heparin či chondroitin) není sulfatován. Velikost jeho řetězců se pohybuje v rozmezí od 0,2 do 10 MDa, přičemž nejčastější je velikost 2–5 MDa.

Hyaluronát se rozpouští ve vodě za vzniku viskoelastického roztoku – obsah 10 mg/ml zvyšuje viskozitu vody přibližně 5 000násobně. Při aplikaci střižných sil však viskozita významně klesá a přetrvávají především elastické vlastnosti.

Význam hyaluronátu v lidském těle

HA jako stavební jednotka

Ačkoliv o přítomnosti hyaluronátu slýcháme ponejvíce v souvislosti s těly obratlovců, lze jej nalézt rovněž u některých prokaryot (Streptococcus či Pasteurella aj.), kde bývá součástí buněčné stěny.

V lidském těle je však hyaluronát základní stavební jednotkou mezibuněčné matrix. Je tvořen řadou buněk, přičemž nejvýznamněji se na jeho syntéze podílejí především fibroblasty, keratinocyty a chondrocyty. Jeho zvýšená tvorba je ovlivněna celou řadou faktorů a vlivů, mezi jinými např. i transformujícím růstovým faktorem TGF beta1, který podporuje expresivitu mRNA pro HA syntázu [1]. Ještě výraznější účinek je možné pozorovat při podání PDGF (platelet derived growth factor) [22] a v menší míře i EGF (endothelial growth factor) [2]. Patologické hromadění hyaluronátu v lidském těle se označuje jako tzv. hyaluronóza. Biodegradace probíhá především prostřednictvím specifických enzymů označovaných jako hyaluronidázy (popsány byly i další biodegradační pochody – viz níže). Nejvýznamnější lokalizace hyaluronátu v lidském těle je zachycena v tab. 1. Pouze pro úplnost doplňme jeho odhadované množství v kůži (0,5 g/l) a sklivci (0,2 g/l).

HA jako signální molekula imunitních reakcí

Pro molekulu hyaluronátu bylo na povrchu různých typů buněk identifikováno šest specifických struktur, které můžeme označit jako receptory [3]:

• CD44
• RHAMM (receptor for hyaluronan mediated motility)
• LYVE-1 (lymphatic vessel endothelial HA receptor-1)
• HARE (hyaluronan receptor for endocytosis)
• Layilin
• Toll like receptor 4 (TLR4)

Mezi nejlépe popsané a nejlépe charakterizované dnes patří první dva zmíněné podtypy, a sice CD44 a RHAMM. Předpokládá se, že oba zasahují do procesu migrace zánětlivých a nádorových buněk, ovlivňují jejich invazivitu, adhezivitu a proliferaci.

CD44

CD44 je transmembránový glykoprotein, na který se kompetitivně vážou polymery HA. Nachází se na leukocytech, na endotelu, na parenchymových a epiteliálních buňkách. CD44 má nejméně 17 různých izoforem a kromě funkce receptoru pro HA slouží také jako mediátor vyzrávání, adheze a přestupu aktivovaných T lymfocytů z krevního řečiště do místa zánětu. Rovněž koordinuje signály pro buněčné přežívání a smrt.

Ačkoliv je HA především extracelulární glykosaminoglykan, působením prozánětlivých cytokinů (např. IL 15) uvolněných v místě infekce, poranění anebo zánětu (včetně autoimunitního) se exprese HA indukuje také na povrchu endoteliálních buněk přilehlých cév, ke kterým je HA přichycen pomocí CD44.

RHAMM (CD168)

RHAMM není na rozdíl od CD44 transmembránovým proteinem. Na buněčnou membránu je napojen zvenčí, a může tak snadno interagovat s přítomnými glykosaminoglykany. Vedle buněčné migrace urychluje G₂ a M fázi buněčného cyklu a podporuje novotvorbu cév.

HA ovlivňuje zánětlivé a autoimunitní reakce

U onemocnění s převažující složkou zánětu je možné pozorovat zvýšenou vaznost monocytů periferní krve k hyaluronátu. Ukázalo se, že aktivita těchto buněk přímo koreluje s aktivací receptorů pro hyaluronát na jejich povrchu, a sice CD44 a TLR4. Navíc zatímco nízké frakce hyaluronátu vedly ke zvýšené tvorbě prozánětlivě působícího interleukinu IL 6 a pro monocyty chemoatrakčně působícího proteinu MCP-1, v případě vysokomolekulárního hyaluronátu nebyl analogický výsledek pozorován [10]. Právě výše popsaná interakce s receptory CD44 vede k aktivaci leukocytů, zejména pak chemoatrakci makrofágů [11].

V in vitro studii byl prokázán příznivý vliv nízkomolekulárního hyaluronátu na aktivaci a maturaci dendritických buněk za přítomnosti zánětu [12].

Kromě účinků HA zprostředkovaných CD44 byl nedávno popsán i imunomodulační účinek samotného HA bez účasti CD44. Jedná se o velmi důležitý mechanizmus již při samotném zahájení imunitní reakce. V minulosti se totiž soudilo, že CD44 na T lymfocytech se váže s exogenním HA, a tím aktivuje jejich proliferaci. Nicméně podle novějších dat je HA syntetizován endogenně samotnými T lymfocyty a hraje klíčovou roli při stimulaci proliferace T lymfocytů zprostředkované IL 2. Indukce proliferace bez účasti CD44 dále podtrhuje význam imunomodulačních vlastností samotné molekuly HA v imunitních mechanizmech [23].

HA urychluje regeneraci tkání a reepitelizaci

Při hojení a obnově tkání v akutních ranách i v nehojících se chronických defektech, např. v souvislosti s diabetem či revmatoidní artritidou, je nezbytným předpokladem zhojení invaze zánětlivých buněk. Regulace těchto mechanizmů se účastní také glykosaminoglykany.

HA a invaze zánětlivých buněk

Skupinu glykosaminoglykanů tvoří zejména hyaluronát, heparan sulfát, chondroitin sulfát a dermatan sulfát. Zatímco se HA zúčastňuje shromažďování leukocytů v místě zánětu prostřednictvím CD44, heparan sulfát ovlivňuje růstové faktory a funkce enzymů, jako např. antitrombin III a heparinový kofaktor II. Zúčastňuje se také navázání leukocytů na selektiny, a tím urychluje jejich shromažďování. Chondroitin a dermatan sulfát regulují aktivitu růstových faktorů a slouží jako alternativní modulátor heparinového kofaktoru II. Dermatan sulfát navíc indukuje expresi ICAM 1 na povrchu endotelu.

HA a tvorba granulační tkáně

HA je induktorem proliferace fibroblastů a novotvorby kolagenu, zejména typu I a III. Dochází tak k tvorbě granulační tkáně a k rychlejšímu vyplnění chybějící tkáně v místě poranění. V recentní studii se potvrdilo, že PDGF-BB (platelet derived growth factor) má mitogenní účinek na dermální fibroblasty pouze za přítomnosti HA navázaného na CD44 na povrchu těchto buněk.

HA ovlivňuje reepitelizace

Při poranění kůže a slizničních epitelů dochází k masivnímu navýšení lokální produkce a depozice hyaluronátu do extracelulární matrix epiteliálními buňkami, a to pod vlivem růstových faktorů pro keratinocyty (gd T cell-derived keratinocyte growth factors), což také pravděpodobně přispívá k migraci, proliferaci a diferenciaci keratinocytů a buněk ve stratum germinativum [13,14]. Dochází tak k reepitelizaci defektů migrací dlaždicových buněk z okolí.

V poslední době se objevuje stále více studií zaměřených na využití hyaluronátu u porušené slizniční integrity. Obvykle vycházejí z dřívějšího pozorování u zvířat, kdy HA výrazně usnadňoval hojení a omezoval jizvení [15].

V randomizované klinické studii s pacienty podstoupivšími chirurgický zákrok na nose vedl krém obsahující HA k menší formaci krust a rychlejšímu zhojení nežli H.E.C. (složení: tanninum, pectinum, balsamum peruvianum a extractum hamamelidis; vehikulem bylo ovčí sádlo); n = 56. Po šestitýdenní aplikaci bylo zlepšení ve prospěch HA zaregistrováno jak pacienty (p = 0,0041), tak i lékaři (p = 0,0023). Pacienti navíc oceňovali nepřítomnost zápachu a příjemný chladivý pocit, kromě toho tři pacienti s H.E.C. museli léčbu přerušit z důvodu bolesti či pálení v krku [16].

Hyaluronová kyselina rovněž napomáhala epitelizaci v jiné studii u pacientů po chirurgickém zákroku v oblasti paranazálních dutin – zlepšení ve 3. měsíci: 93,75 % vs 87,5 % u placeba; průměrná doba ke kompletní reepitelizaci: 3,4 vs 8,3 týdne [17]. V jiné, avšak podobně designované studii je navíc kladen důraz na schopnost zabránění vzniku synechií [18].

HA aplikovaný ve formě krému výrazně urychloval hojení ran, popálenin či odřenin (n = 43). Zajímavým zjištěním byla nízká tvorba fibrinových náletů a minimalizace exsudátu [19].

Přínosné je i zjištění mezinárodní studie, ve které byl HA aplikovaný pacientům podstupujícím abdominální chirurgický zákrok s cílem omezit vznik srůstů výrazně účinnější než roztok Ringer laktátu (n = 281) [20].

HA ovlivňuje embryogenezi

Vzhledem ke schopnostem hyaluronátu vázat na sebe vodu nás pravděpodobně nepřekvapí, že jeho přítomnost je velmi důležitá v přípravě endometria na případnou nidaci oplodněného vajíčka.

Hyaluronát současně hraje zcela nezastupitelnou úlohu v embryogenezi a do jisté míry i následně v  celém nitroděložním vývoji plodu. Pro nově vzniklé a diferencované buňky vytváří společně s dalšími molekulami (laminin, fibronektin, heparan sulfát či kolagen IV) opěrnou síť a současně participuje na udržování stálosti prostředí.

Buněčnými studiemi bylo zjištěno, že embryonální kmenové buňky (hESCs; linie H1, H9 a H13) na svém povrchu vykazují přítomnost HA receptorů CD44 a RHAMM [4]. Zajímavým zjištěním byla skutečnost pozorovaná in vitro, kdy tyto buňky zaobalené výhradně do hyaluronátu ustaly ve své diferenciaci, avšak po 15 dnech kultivace a následném odstranění hyaluronátu se v přítomnosti VEGF (vaskulární endoteliální růstový faktor) diferencovaly v buňky endotelu [4]. Velmi podobných výsledků bylo dosaženo i při čtyřtýdenní kultivaci hepatoblastů, které mj. na svém povrchu zvýšeně exprimovaly CD44 [5].

HA moduluje kancerogenezi

Přesný význam hyaluronátu v kancerogenezi je v současné době předmětem intenzivního bádání. Dnes je známo nejméně 14 typů karcinomů, u kterých byla zjištěna zvýšená koncentrace hyaluronátu, a to jak přímo v buňkách samotných, tak i v mezibuněčném stromatu [6]. Není však jasné, zda-li jsou tato zjištěná množství hyaluronátu vlastní příčinou, anebo spíše až důsledkem některého jiného patologického pochodu. U ovariálního karcinomu je dokonce jeho množství dáváno na roveň určitého prognostického ukazatele. Ukázalo se, že zatímco nízkomolekulární hyaluronát je schopen buněčnou migraci stimulovat, v případě vysokomolekulárního hyaluronátu tato vlastnost prokázána nebyla. V preklinickém experimentu bylo dále zjištěno, že inhibice endogenní tvorby hyaluronátu vede k výraznému poklesu růstové aktivity buněk karcinomu prostaty aplikovaných podkožně imunokompromitovaným myším. V případě jejich růstu bylo možné navíc pozorovat výrazně nižší stupeň vaskularizace. O důkazu významu hyaluronátu svědčí skutečnost, že exogenním podáním hyaluronátu se růst nádoru obnovil [6].

Popsán byl rovněž možný vliv hyaluronátu na některé signální cesty, které podporují růst nádorových buněk a podmiňují jejich přežití (Erb2, Ras, MAPK a PI3 kináza/Akt) [6]. Neméně zajímavé zjištění se týká i malých fragmentů hyaluronátu indukované transkripce metaloproteáz (zejména MMP-9) zprostředkované aktivací nukleárního faktoru NF-kB, čímž je de facto velmi podpořena invazivita tumoru [7].

Relativně nedávno bylo rovněž zjištěno, že nižší syntéza hyaluronátu v nádorově změněných buňkách je provázena dediferenciací nádoru, a tedy i jeho horší prognózou [8].

Při vzniku intraepiteliálních dysplazií a karcinomu v dlaždicovém epitelu děložního čípku je infekce HPV považována za klíčový faktor, avšak samotná infekce bez dalších alterací imunitní reakce není dostatečná k vyvolání zhoubného bujení [21]. V epitelu děložního čípku se nacházejí Langerhansovy buňky – antigen prezentující buňky, které se při infekci jako jedny z prvních setkají s viriony. Jsou to vlastně nezralé dendritické buňky myeloidní řady, které po navázání antigenu tento prezentují T lymfocytům v regionálních mízních uzlinách. Experimentální studie prokázaly, že heparan sulfát je nezbytný pro účinné navázání virus like particles (VLP) HPV 16 na dendritické buňky. VLP jsou antigeny HPV 16 používané ve vakcínách určených k prevenci karcinomu děložního čípku či karcinomu v anogenitální oblasti. Heparan sulfát, podobně jako HA, patří do skupiny glykosaminoglykanů.

HA ovlivňuje angiogenezi

Jak již bylo zmíněno výše, hyaluronát zasahuje do procesu angiogeneze. Zatímco nízkomolekulární HA ji povzbuzuje, vysokomolekulární HA ji naopak inhibuje, a to jak na úrovni ovlivnění migrace, tak i proliferace samotných endoteliálních buněk [9].

Biotransformace HA

Enzymatická cesta

HA se v organizmu odbourává především enzymaticky za pomoci hyaluronidázy, a to ve dvou krocích:

1. Internalizace a degradace v lysozomech buněk
   Hyaluronidáza Hyal-1 je odpovědná za katabolizmus intracelulárního HA a je přítomná především v lysozomech. Hyal-1 štěpí HA na tetrasacharidy, které jsou následně odbourány b-glukuronidázou a b-N-acetyl-glukozaminidázou. Konečnými degradačními produkty jsou GlcNAc a GlcA, jež se buď recyklují, anebo katabolizují v pentózovém cyklu.
2. Uvolnění do extracelulární matrix a transport lymfatickými cestami do jater a ledvin
   Hyaluronidáza Hyal-2 je odpovědná za katabolizmus extracelulárního HA. Po rozštěpení se HA transportuje lymfatickým systémem do krve; vyloučen je buď játry (80 %), anebo ledvinami (10 %).

Známy jsou tři druhy hyaluronidázy:

1. savčí
2. z pijavic a parazitů
3. bakteriální

Savčích hyaluronidáz je pět typů: Hyal-1 až 4 a PH-20 (sperm adhesion molecule 1 – SPAM-1).

1. Hyal-1 se nachází ve většině tkání a nalézáme ji také v plazmě a moči. In vivo vyžaduje ke své aktivitě přítomnost CD44. U pacientů s karcinomem močového měchýře a prostaty dochází k její up-regulaci.
2. Hyal-2 se také nachází ve většině tkání kromě mozku. In vivo ke své aktivaci rovněž vyžaduje přítomnost CD44. Patří ke klíčovým extracelulárním enzymům při remodelaci tkání a buněčné migraci.
3. Hyal-3 nacházíme především v mozku. Její funkce zatím nebyla objasněna.
4. Hyal-4 je specifická pro chondroitin sulfát.
5. PH-20 se nachází ve spermatu. Narušuje ochranný obal zralého oocytu, jenž je bohatý na HA, a tím umožňuje průnik nejrychlejší spermie k vajíčku a jeho oplodnění.

Chemická cesta

Hyaluronát může být odbouráván navíc i neenzymatickou cestou, a to obvykle v podobě postupného zkracování délky svého řetězce podmíněného řadou zevních podnětů. Jedná se především o změny v pH (acidóza či alkalóza), vysokou fyzickou zátěž, aplikaci ultrazvuku či působení volných hydroxylových radikálů.

Závěr

Podle nedávných pozorování není hyaluronát pouze „pasivním pozorovatelem“, nýbrž se aktivně účastní imunologických procesů jako signální molekula a ovlivňuje mobilitu a adhezivitu buněk v rámci jejich proliferace a diferenciace. Tyto jeho imunomodulační vlastnosti se již nyní využívají při urychlení hojení a epitelizace poranění a zánětů na kůži, v ústní dutině a nově i ve formě poševních čípků Cicatridina^® také na vaginální sliznici a na epitelu děložního čípku.

MUDr. Jiří Slíva¹
MUDr. Juraj Minárik^2
1 Ústavy farmakologie 2. a 3. LF UK, Praha
² Odborný redaktor, New EU Magazine of Medicine