Kryokonzervace buněk a tkání v asistované reprodukci

Souhrn

Práce podává přehled o vývoji a možnostech kryokonzervace zárodečných buněk, embryí a tkání v asistované reprodukci. Uvádí indikace k mrazení a skladování spermií, oocytů, embryí, testikulární a ovariální tkáně. Popisuje dva zmrazovací a rozmrazovací postupy (pomalé počítačem řízené mrazení, vitrifikace) včetně použití kryoprotektiv (glycerol, DMSO, PROH). Před skladováním je nutné provést sérologické vyšetření na HIV1, 2, hepatitis a syfilis, aby se zabránilo křížové kontaminaci biologického materiálu v prostředí skladovacího kontejneru.

Klíčová slova:
kryokonzervace – vitrifikace – kryoprotektivum – rozmrazení – spermie – oocyt – embryo – ovariální tkáň

Úvod

Experimenty s dopadem nízkých teplot na živé organizmy byly popsány již v 17. století, kdy byla v roce 1665 publikována monografie Roberta Boyla „New Experiments and Observations Touching Cold“. Experimentálními pracemi ve vztahu ke kryobiologii se zabývali v 18. a 19. století Leeuwenhoek v Holandsku, Needham v Anglii, Spallanzini v Itálii a Reamur a Claude-Bernard ve Francii.

Éra moderní kryobiologie začala v roce 1940, kdy Basile J. Luyet zveřejnil práci „Life and Death at Low Temperatures“. Popsal možnost mrazení bez tvorby ledových krystalů, tzv. vitrifikaci, která se používá ke kryokonzervaci i v dnešní době.

Mrazením v oblasti reprodukční biologie se v Anglii začali zabývat A. Polge, Ch. Smith a A. Parkes, kteří se pokoušeli zmrazit spermie kohouta. Při svých experimentech objevili v roce 1949 protektivní účinek glycerolu. Testovali pohyblivost spermií po rozmrazení a různě modifikovali kryoprezervační média, která se skládala ze solného roztoku syceného mléčným práškem, vaječným žloutkem, cukrem a glycerolem [1,2]. Postupně vedlo použití glycerolu i k mrazení lidských spermií a dodnes zůstává běžně používaným médiem při mrazení spermatu.

Historie mrazení humánního spermatu začala po druhé světové válce. Myšlenka založení spermabank a skladování zmrazeného spermatu vznikla, když se zjistilo, že se azoospermie a těžká oligospermie nedaří vyléčit. Technika kryokonzervace spermatu je v dnešní době dobře propracována a zachovává fertilizační potenciál spermií v průběhu dlouhodobého skladování v tekutém dusíku. Bezpečnost použití zmrazeného spermatu byla prokázána experimentálně nejprve ve veterinární praxi a později narozením řady zdravých dětí po inseminaci spermatem dárce.

Mrazení lidských embryí se vyvinulo rovněž z aplikace kryokonzervačních technik používaných dříve u zvířat. V roce 1972 dosáhl Whittingham úspěchu v podobě narození myši z transferu moruly zamrazené pomalým zmrazovacím protokolem s DMSO [3]. Stejný protokol vedl k prvnímu těhotenství u člověka za použití zamrazeného osmibuněčného embrya v Austrálii v roce 1983 [4]. Následoval porod dvojčat v Nizozemsku v roce 1984 [5].

V dnešní době je kryokonzervace technikou, která se provádí na všech pracovištích asistované reprodukce. Aplikuje se pro uchování a budoucí použití lidských zárodečných buněk a tkání, které jsou uskladněny v kontejnerech s tekutým dusíkem při teplotě -196 °C.

Kryokonzervují se spermie, oocyty (nezralé oocyty, oocyty v metafázi II), embrya ve všech vývojových stadiích (zygoty, několikabuněčná embrya, moruly a blastocysty), zpracovaná tkáň varlat a ovariální tkáň.

Celý proces zahrnuje několik na sebe navazujících kroků: počáteční vystavení buněk vlivu kryoprotektiv, zmrazení pod bod mrazu, skladování, rozmrazení, naředění a odmytí kryoprotektiv a návrat buněk do fyziologického prostředí, které umožní jejich další vývoj.

Zmrazování

Aby se zabránilo poškození nebo zničení buněk během kryokonzervace, byly vyvinuty dva základní zmrazovací a rozmrazovací postupy: postup pomalého počítačem řízeného mrazení a postup pro rychlé mrazení, vitrifikaci.

Nejčastěji používaným zařízením pro pomalé řízené zmrazování je Planer Kryo F10 (obr. 1), který sestává z řídicí počítačové jednotky, zmrazovacího prostoru, sondy a zásobníku tekutého dusíku. Proces mrazení trvá 2,5–3 hod.

Vitrifikace je rychlejší, trvá pouze několika minut, a provádí se bez použití přístroje. Ke zmrazení slouží ná­doba s tekutým dusíkem. Buňky jsou na nosiči zmrazeny ponořením do sterilního dusíku, poté je nosič se zmrazeným materiálem umístěn do vnějšího označeného obalu. Tento způsob se nazývá „otevřený systém“. Dochází-li k vitrifikaci bez přímého kontaktu buněk s dusíkem, kdy jsou buňky na nosiči nejprve umístěny do označeného obalu, uzavřeny a teprve poté zmrazeny, hovoříme o „uzavřeném systému“. Vitrifikace vyžaduje větší zručnost a zkušenost pracovníka laboratoře než pomalé mrazení.

Pro úspěšné použití obou metod je nezbytné vystavit buňky nebo tkáně působení ochranných látek – kryoprotektiv. Mezi nejčastěji používaná penetrující kryoprotektiva patří glycerol, DMSO (dimethylsulfoxid), EG (etylenglykol) a PROH (1,2-propandiol). Kryoprotektiva nepenetrující – cukry, mají osmoticky dehydratační účinek. Patří mezi ně sacharóza, manitol, sorbitol a trehalóza. Při mrazení chrání proteiny a buněčnou membránu.

Při pomalém mrazení se používají kryoprotektiva v nízké koncentraci (10–15%), buňky se dehydratují v průběhu mrazení, teplota se snižuje pomalu a tvorba ledových krystalů je řízena. Při vitrifikaci se používá vysoká koncentrace kryoprotektiv (40–60%), buňky se dehydratují před mrazením a rychlost snižování teploty je více než 1 000 °C/min. Při vitrifikaci dochází k solidifikaci roztoku pří nízké teplotě bez tvorby krystalů.

Média pro přípravu gamet, embryí a tkání před mrazením a na proces jejich rozmrazování jsou v různých modifikacích vyráběna řadou firem (Vitrolife, Origio, COOK, SAGE). Firmy si přesné složení chrání a jednotlivé roztoky v setu nazývají jako ekvilibrační, omývací, zmrazovací, vitrifikační apod. [6,7]. Úspěšný proces zmrazení a rozmrazení musí zaručit zachování integrity buněčné struktury i jejich funkčních parametrů. Pro každý typ buněk je proto používán specifický zmrazovací a rozmrazovací postup.

Kryokonzervace spermií

V době mikromanipulačních technik, kdy kvalita spermatu již není limitujícím faktorem pro kryokonzervaci, má tato technika široké využití a mohou se mrazit i jednotlivé spermie.

1. Kryokonzervace spermatu dárců je nejstarší důvod mrazení spermatu [8]. Mrazení nabylo na důležitosti se vznikem nebezpečí přenosu AIDS. Čerstvé sperma nemůže být použito dříve než po zopakování sérologických testů za 180 dní od zamrazení a potvrzení jejich negativity.
2. Dalším častým důvodem je pojistka pro případ selhání v den odběru vajíček nebo pro případy, kdy se partneři pacientek programu asistované reprodukce nemohou dostavit v určenou dobu.
3. Uchování spermií získaných při invazivních mikrochirurgických metodách z nadvarlete (MESA) nebo varlete (TESE) má zásadní význam pro další použití spermií bez nutnosti opakovaného chirurgického vstupu.
4. V programu darovaných oocytů zajistí dopředu zmrazené sperma partnera příjemkyně možnost oplození tehdy, když jsou získány dárcovské oocyty.
5. Poškození reprodukčních funkcí je vedlejší efekt spojený s léčbou malignit. Zvyšující se úspěšnost onkologické léčby (zvláště při Hodgkinově lymfomu a tumoru varlat) vedla k zavedení kryokonzervace spermatu před zahájením chirurgické, chemické nebo radiologické léčby a jeho uskladnění pro pozdější po­užití [9,10]. Významným faktorem při poškození spermie je oxidační stres a nedostatečná funkce systémů, které kyslíkové radikály eliminují. Zajímavé výsledky přináší výzkum homocysteinu a kyseliny listové v souvislosti se spermatogenezí[11].
6. Kryokonzervaci spermatu také často využívají mladí muži kvůli obavám o kvalitu svého spermatu v době, až budou chtít počít potomstvo. Zájem projevují především mladí muži z řad vojáků, kteří odjíždějí na zahraniční mise.

Mrazení a rozmrazení spermií

Mrazí se buď ejakulát, nebo již zpracované proprané spermie. Některé práce uvádějí, že neproprané spermie jsou lépe chráněny před poškozením v průběhu mrazení/rozmrazení a vykazují lepší pohyblivost a DNA integritu po rozmrazení [12]. Může se mrazit i testikulární tkáň získaná při TESE (Testicular Sperm Extraction). Výhodnější je však testikulární tkáň přímo po odběru zpracovat a zamrazit již získané spermie. Význam to má hlavně proto, že je po zpracování známo, zda se nějaké spermie z tkáně získaly, případně v jakém množství a jak kvalitní. Spermie se mrazí a skladují v kryotubách, např. firmy Nunc (obr. 2). Rozmrazení se provádí pozvolným táním při pokojové teplotě. Poté se provede odmytí kryoprotektiva centrifugací s promývacím médiem.

Je známo, že kryokonzervace způsobuje změny v morfologii spermií – dochází ke snížení počtu normálních morfologií. Dále dochází k poškození integrity membrán, mitochondriální aktivity, akrozomu a bičíku. Zvláště ovlivněna je pohyblivost spermií a je všeobecně akceptováno, že po proceduře zmrazení/rozmrazení je redukována o 20–50% [13].

Kryokonzervace oocytů

Po řadu let od prvně publikované práce [14] nebyla kryokonzervace oocytů příliš používanou metodou, a to kvůli nízkému procentu přežívání oocytů po rozmražení, procentu oplozených a vyvíjejících se embryí a jejich špatné kvalitě. Technika vyšla z kryokonzervačních protokolů užívaných pro embrya. Bylo nutno provést řadu experimentů zabývajících se nejrůznějšími modifikacemi těchto laboratorních postupů, aby vedly ke spolehlivému použití pro oocyty. Úspěšnost metody zvýšilo zvláště zavedení ICSI, a umožnilo tak zahájení kryokonzervace oocytů v rutinní praxi.

V současné době je kryokonzervace oocytů využívána v následujících případech:

1. Umožní uchování oocytů pro pacientky s rizikem předčasného ovariálního selhání.
2. Skladování zmrazených darovaných oocytů v programu dárcovství odbourá nutnost synchronizace cyklů dárkyně a příjemkyně.
3. Řešení v případě neočekávané absence partnerových spermií v den odběru oocytů (překážka zdravotní, dopravní, pracovní nebo i v podobě momentálního psychického rozpoložení). Dříve by byly tyto oocyty po 18–20 hod odsouzeny k zániku.
4. Pomáhá ženám s onkologickým onemocněním, u kterých nemohou být zamrazena embrya. Tyto ženy nemají vhodného partnera a odmítají dárcovské sperma.
5. Možnosti skladování oocytů se nově jeví jako příležitost pro ženy, které neplánují bezprostředně otě­hotnět a chtěly by si uschovat „mladé oocyty“ pro vlastní použití v budoucnu.
6. Kryokonzervace oocytů minimalizuje etické a právní komplikace spojené se skladováním embryí. V některých zemích je mrazení embryí dokonce zakázáno (Německo, Rakousko, Švýcarsko, Dánsko, Švédsko).

Mrazení a rozmrazení oocytů

Oocyty by měly být mrazeny nejdříve 5 hod po odběru. Roztoky pro mrazení a rozmrazení obsahují jako kryoprotektivum nejčastěji 1,2-propandiol (PROH) a sacharózu. Může být použit i DMSO. Poté, co projdou řadou příslušných ekvilibračních a kryokonzervačnách roztoků, se mohou mrazit jak pomalým způsobem, tak vitrifikací.

Pro rozmrazení se volí protokol odpovídající způsobu zamrazení (pomalé, rychlé). Rozmrazené oocyty se po odmytí v řadě roztoků, kdy se zbavují kryoprotektiva a optimalizují se osmotické podmínky, umístí do kultivačního média. Vloží se do CO₂ inkubátoru s teplotou nastavenou na 37 °C a zde se ponechají 2–4 hod, než se přistoupí k oplozování [15].

Kryokonzervace embryí

Při asistované reprodukci vzniká stimulací ovarií více oocytů, a následně embryí, než je vhodné použít k transferu. V současné době je z důvodu minimalizace rizika vícečetného těhotenství doporučeno transferovat maximálně dvě embrya.

1. Kryokonzervace embryí byla tedy původně vyvinuta proto, aby zachránila nadpočetná embrya.
2. Využití technologie bylo dále rozšířeno na případy středně závažného až závažného ovariálního hyper­stimulačního syndromu, kdy není vhodné provádět embryotransfer.
3. Dalším důvodem kryokonzervace je jakákoliv překážka při provádění transferu čerstvých embryí (akutní nemoc, děložní polyp, nízká sliznice, krvácení, technický problém).
4. Aplikuje se v programu dárcovství embryí.
5. Stále častěji je kryokonzervace využívána pro uchování embryí onkologicky nemocných žen před radio- nebo chemoterapií.

Mrazení a rozmrazení embryí

Embrya jsou úspěšně mrazena za použití PROH, DMSO nebo glycerolu. Každé kryoprotektivum je vhodné pro jiné vývojové stadium – PROH nebo DMSO je vhodnější pro zygoty a dělící se embrya, zatímco glycerol je vhodnější pro blastocysty. Embrya se mrazí v pejetách po dvou až třech (obr. 3).

Pro mrazení embryí lze využít vitrifikaci nebo pomalý postupu pomocí Planer Kryo 10. Při pomalém mrazení je teplota z počáteční hodnoty odpovídající pokojové teplotě snižována rychlostí -2 °C/min do -7 °C, dále se snižuje rychlostí -0,3 °C/min do -30 °C a rychlostí -50 °C/min do -150 °C, kdy se pejety s embryi vyjmou a přenesou do kontejneru s kapalným dusíkem k uskladnění (obr. 4).

Rozmrazení probíhá dle adekvátního zmrazovacímu protokolu. Přesný postup pro každé médium je uveden na příbalovém letáku k rozmrazovacím médiím.

Úspěšnost kryokonzervace embryí a výsledku po embryotransferu závisí na kvalitě časného embrya (neměla by se mrazit embrya s více než 30% fragmentů), na věku ženy, příčině infertility, způsobu mrazení, na výsledku předchozího čerstvého transferu, na morfologické kvalitě rozmrazeného embrya a dalších faktorech.

Kryokonzervace ovariální tkáně

Chemoterapie zanechává, jako jedna ze základních modalit onkologické léčby, často trvalé následky. Mezi nejčastější patří neplodnost na základě ireverzibilního poškození gonád. Jednou z metod zachování fertility u žen s nádorovým onemocněním je, vedle možnosti zamrazit oocyty nebo embrya, kryokonzervace ovariální tkáně [16,17].

1. 1. Kryokonzervace ovariální tkáně je vhodná pro mladé dívky, u kterých je zřejmé, že jim plánovaná chemoterapie zničí pohlavní buňky, a které nemají zatím partnera, aby podstoupily stimulaci ovarií, oplození oocytů a zamrazení embryí.
2. 2. Dále se hodí pro ženy, u kterých na hyperstimulaci ovarií již není čas, neboť by celá procedura odsunula léčbu nejméně o 14 dní až 3 týdny.
3. 3. Je přijatelná i pro ženy, které z důvodu rizika zhoršení nemoci nemohou hyperstimulaci ovarií podstoupit vůbec.

Odběr a mrazení tkáně

Odběr ovariální tkáně se provádí laparoskopicky. Množství ovariální tkáně odebírané pro účely kryokonzervace je část ovariální kúry o rozměrech cca 10 × 20mm a tloušťce 1–2mm, nejlépe z obou ovarií. Tkáň ovariálního kortexu je vložena do kultivačního média a transportována do embryologické laboratoře ke zpracování. V laminárním boxu je tkáň vyjmuta na Petriho misku, přelita médiem a nařezána skalpelem na úzké proužky o rozměrech zhruba 2 × 4 × 1mm (obr. 5). Poté jsou proužky umístěny do ekvilibračního média (fosfátový pufr, PROH a sacharóza). Po inkubaci jsou vloženy po čtyřech až šesti do označených kryotub (Nunc) naplněných kryokonzervačním médiem. Vlastní kryokonzervace může být provedena jak technikou pomalého zmrazování za použití automatického mrazicího zařízení, tak metodou vitrifikace. Tkáň je potom uložena do kontejnerů ke skladování. Po úspěšném vyléčení onkologických pacientek může být tkáň rozmrazena a použita k ortotopické nebo heterotopické transplantaci.

Délka skladování buněk a tkání

Doba skladování není pro žádný typ buněk a tkání striktně určena. Měla by však být na pracovišti stanovena, aby nevznikaly organizační, etické a právní problémy. Teoreticky je ne­omezená, protože při skladování neprobíhají žádné biologické aktivity. Prakticky není známo, jak dlouho mohou buňky zůstat v těchto podmínkách životaschopné. Literární údaje o doposud úspěšně rozmrazených oocytech, embryích a spermiích uvádějí, že prokázaná doba skladování, během níž si reprodukční buňky uchovávají schopnost vývoje, je pro oocyty 4 roky [18], pro embrya až 12 let [19] a pro spermie 28 let [20].

Kryokonzervace a legislativa

Zákon 296/2008 Sb., o zajištění jakosti a bezpečnosti lidských tkání a buněk určených k použití u člověka (zákon o lidských tkáních a buňkách), a vyhláška 422/2008 Sb., o stanovení bližších požadavků pro zajištění jakosti a bezpečnosti lidských tkání a buněk určených k použití u člověka, ukládá povinnost provést vždy před zmrazením biologického materiálu sérologické vyšetření z důvodu zhodnocení rizika křížové kontaminace. Před uložením buněk a tkání do kryobanky je nutno vyšetřit HIV 1 a 2 (anti-HIV-1, 2), hepatitidu B (HBsAg, anti HBc), hepatitidu C (anti-HCV-Ab) a syfilis.

Zamrazený materiál je do doby získání negativních výsledků umístěn v karanténě. Po prokázání seronegativity je přemístěn do skladovacího kontejneru. V případě pozitivity na některou infekci je materiál skladován odděleně v infekčním kontejneru. O všech krocích je veden písemný záznam.

Závěr

Kryokonzervace buněk a tkání má široké a nezastupitelné využití pro páry podstupující léčbu metodami asistované reprodukce, ať už se jedná o jejich vlastní, nebo darovaný biologický materiál. Nabízí také šanci na zachování reprodukčních funkcí pro onkologicky nemocné, kteří mohou využít zamrazení spermií, oocytů, embryí nebo ovariální tkáně před zahájením onkologické léčby.

Práce byla podpořena grantem IGA MZ ČR NS/9661-4.

as. RNDr. Jana Žáková, Ph.D.
Gynekologicko-porodnická klinika
LF UK a FN Brno
jzakova@fnbrno.cz