Role homocysteinu a příbuzných thiolů v etiopatogenezi poruch lidské reprodukce

Súhrn

Metabolizmus homocysteinu a dalších thiolů hraje významnou roli v řadě fyziologických procesů v lidských gonádách. Jeho narušení je spojeno se zvýšeným rizikem oxidačního stresu a s ovlivněním methylačních reakcí. Nerovnováha mezi nadprodukcí volných radikálů a účinností antioxidačních systémů zárodečných buněk je považována za jeden ze základních faktorů poškození buněčné membrány a genetické informace. Hyperhomocysteinemie inhibuje methylační reakce hrající důležitou roli mimo jiné při opravách DNA a stabilizaci genomu. Cílem práce je uvést přehled současných poznatků o metabolizmu homocysteinu a ostatních thiolů v souvislosti s lidskou reprodukcí.

Klíčová slova:
homocystein – glutathion – thioly – oxidační stres – neplodnost

Úvod

Vzestupný trend v počtu neplodných párů v posledních desetiletích vede k intenzivnímu zájmu o problematiku etiopatogeneze lidské neplodnosti [1].

Řada fyziologických procesů v lidských gonádách je úzce vázána na metabolizmus základních aminokyselin. Významnou úlohu má homocystein (Hcy) a další thioly. Hyperhomocysteinemie je signifikantně spojena se zvýšeným rizikem oxidačního stresu. Nerovnováha mezi nadprodukcí volných radikálů a účinností antioxidačních systémů zárodečných buněk je považována za jeden ze základních faktorů poškození buněčné membrány a genetické informace. Cílem práce je předložit přehled současných poznatků o metabolizmu homocysteinu v souvislosti s lidskou reprodukcí.

Mužská reprodukce

Důkazů o tom, že homocystein a vitaminy související s jeho metabolizmem (kyselina listová, B₆ a B₁₂) mají velký význam pro mužskou plodnost, stále přibývá [2–5]. Byl prokázán vztah mezi hyperhomocysteinemií a narušením spermatogeneze, ke kterému může dojít kdykoli v průběhu buněčné proliferace a diferenciace, a také vztah mezi „zdravou uvědomělou“ stravou, plazmatickou hladinou homocysteinu a poškozením DNA spermií [6,7]. Koncentrace homocysteinu ve spermiích subfertilních mužů je vyšší než u mužů plodných [3]. Naproti tomu koncentrace homocysteinu (a také vitaminu B₁₂)v seminální tekutině azoospermiků je nižší než u normospermiků [8]. Homocystein zvyšuje expresi prozánětlivých cytokinů, monocytárního chemotaktického proteinu-1 a interleukinu-8, které hrají roli v procesu testikulárního zánětu, spermatogeneze, při pohybu spermií, kapacitaci, akrozomální reakci a fertilizaci a snižují dostupnost oxidu dusnatého během erekce.

Homocystein ovlivňuje mužskou reprodukci především nadměrnou tvorbou reaktivních forem kyslíku (ROS), které působí na spermie dvěma klíčovými mechanizmy – peroxidacínenasycených mastných kyselin a přímým poškozením DNA.

Oxidační stres

Ačkoli ke tvorbě ROS dochází i fyziologicky při zrání a kapacitaci spermií, nadměrná tvorba je poškozuje [9]. ROS vznikají během autooxidace homocysteinu a ke vzniku neplodnosti mužů přispívají ve 30–80 % případů. Protože během spermatohistogeneze ztrácí spermie většinu cytoplazmy, je ve zralé spermii limitována dostupnost enzymů nutných pro obranu proti ROS.

Prvním z mechanizmů patologického působení je peroxidace nenasycených mastných kyselin v membráně spermií, čímž dochází k porušení fluidity membrány, která má velký význam při splynutí spermie a vajíčka během fertilizace [10,3]. Dochází ovšem i k poškození mitochondrií, které vede ke snížení pohyblivosti spermií a narušení jejich schopnosti proniknout do vajíčka. Druhým mechanizmem je přímé poškození DNA spermií [11]. Standardně je DNA v hlavičce spermií pevně sbalena v důsledku disulfidových vazeb mezi cysteinovými zbytky v molekulách protaminů, které ji před napadením ROS chrání. Ve spermiích neplodných mužů byla prokázána nedostatečná protaminace DNA. Následkem je zvýšená citlivost DNA k oxidačnímu poškození [3,11,12]. Oxidace cysteinu na cystin je důležitá také pro ochranu DNA před fyzikálním a jiným chemickým poškozením a udržení struktury bičíku a pohyblivosti spermie [3].

Hlavními zdroji ROS ve spermatu jsou leukocyty (převládají neutrofily) a samy spermie. Rychlost produkce volných radikálů je u leukocytů 1 000krát vyšší než u spermií při kapacitaci [12], kdy dosahuje svého maxima.

Na druhé straně je produkce určitého množství ROS spermiemi nutná k zajištění jejich správné funkce. ROS mají pozitivní účinky právě při kapacitaci spermií. Peroxid vodíku stimuluje akrozomální reakci a aktivitu spermií, a napomáhá tak oplodnění vajíčka. Posiluje vazbu membrány spermií na protein ZP-3 zóny pellucida, a podporuje tím splynutí spermie s vajíčkem.

Tvorba ROS spermiemi nepřímo koreluje s jejich zráním. Během spermatohistogeneze ztrácí spermie cytoplazmu, následkem čehož dochází k silnému zhuštění DNA v hlavičce spermie. Nezralé spermie s patologickou morfologií jsou charakteristické přítomností nadměrného množství cytoplazmatických zbytků. Tyto zbytky obsahují glukóza-6-fosfátdehydrogenázu (G6PD), která katalyzuje produkci NADPH + H⁺. NADPH je využit pro tvorbu O₂^– působením NADPH-oxidázy, která je lokalizována v membráně spermií (obdoba respiračního vzplanutí ve fagocytujících buňkách). Výsledkem je zvýšená produkce ROS v porovnání s morfologicky normálními spermiemi [3,12].

Mužská reprodukce a ostatní thioly

Úlohou cysteinu a glutathionu je ochrana před oxidačním stresem způsobeným ROS. Jsou součástí enzymatických a neenzymatických antioxidačních mechanizmů v pohlavním traktu i samotných spermiích, kterými organizmus udržuje oxidační rovnováhu, a zajišťuje tak ochranu buněk před oxidačním poškozením. Glutathion je syntetizován i v samotných spermiích, nicméně tato produkce je nedostatečná pro celkový obrat glutathionu a pro jeho dostatečnou tvorbu je nezbytná mezibuněčná komunikace se Sertoliho buňkami.

Několik studií prokázalo nižší hladinu glutathionu, příp. i cysteinu, v ejakulátu či seminální tekutině subfertilních mužů ve srovnání s muži plodnými [13,3]. Hladina cysteinylglycinu je srovnatelná [3]. Zajímavé je, že ve studii je u subfertilních mužů intracelulární koncentrace všech thiolů ve spermiích významně vyšší [3], zatímco jiná práce uvádí u oligospermiků naopak nižší hodnoty než u zdravých kontrol [14]. Intramuskulární léčba glutathionem má pozitivní účinek na pohyblivost a morfologii spermií.

Při reakci thiolů s peroxidem vodíku dochází k jejich oxidaci, která je důležitá pro stabilizaci struktury bičíku spermií, jejich pohyblivost a ochranu DNA protaminací. Dalšími významnými neenzymovými antioxidanty ve spermatu jsou kyselina askorbová, α-tokoferol, aminokyseliny taurin a hypotaurin, albumin, karnitin, karotenoidy, flavonoidy, kyselina močová či pyruvát [14]. Řada studií potvrdila výrazně nízkou aktivitu neenzymatických antioxidantů u neplodných mužů ve srovnání s muži plodnými [11,12].

Nejtoxičtější účinky na spermie z ROS vykazuje peroxid vodíku [14]. Ochranu před ním poskytují enzymy kataláza a glutathionperoxidáza (GPX):

Kataláza: 2 H₂O₂  → 2 H₂O + O₂
GPX: H₂O₂ + 2 GSH → GSSG + 2 H₂O

GPX se vyskytuje ve varlatech, nadvarlatech, chámovodech, prostatě, semenných váčcích, seminální tekutině i spermiích v klesající koncentraci v průběhu spermatogeneze. Ve zralé spermii se nachází především v oblastikrčku, kde je součástí tzv. mitochondriálního pouzdra. Kromě peroxidu vodíku rozkládá i ostatní hydroperoxidy. Její aktivita je závislá na regeneraci oxidovaného glutathionu na redukovanou formu. Vysoká intracelulární hladina GSH je zajištěna NADPH dependentní glutathionreduktázou (GRX):

GSSG + NADPH + H⁺ → 2 GSH + NADP⁺

Selektivní inhibice GRX snižuje dostupnost redukovaného glutathionu, a spermie jsou tak vystaveny oxidačnímu stresu. Koordinace aktivity GPX a GRX tedy hraje klíčovou roli v ochraně spermií před oxidačním poškozením [12].

Svou úlohu v antioxidační ochraně spermií má zřejmě i další z enzymů závislých na glutathionu, a to glutathion-S-transferáza, jejíž aktivita byla stanovena v seminální tekutině [13].

Posledním z antioxidačních enzymů je superoxiddizmutáza (SOD), která rozkládá superoxidový anion radikál O₂⁻. SOD se vyskytuje v seminální tekutině i ve spermiích a byla potvrzena souvislost mezi deficitem SOD a mužskou neplodností [14].

Nadměrné vychytávání ROS má na druhou stranu negativní účinky na průběh fertilizace [3]. Potvrzuje se tak, že fyziologická hladina ROS je pro tento proces nezbytná.

Ženská reprodukce

Estrogeny a homocystein

Protektivní účinky estradiolu na cévní endotel souvisí s jeho vlivem na metabolizmus homocysteinu. Mezi hladinou estradiolu a Hcy existuje inverzní vztah [15]: podávání estrogenů signifikantně snižuje koncentraci Hcy i u postmenopauzálních žen [16]. Kromě indukce celkové enzymatické aktivity zvyšuje estradiol především aktivitu cystathionin-β-syntázy (CBS), následkem čehož dojde k převaze transsulfurační metabolické dráhy a katabolizaci homocys-teinu [3,15,17]. Dalším protektivním efektem estradiolu je zvýšení hladiny antioxidantu glutathionu.

Hladina homocysteinu se vlivem estradiolu mění také v průběhu menstruačního cyklu. Předchozí studie prokázaly, že koncentrace Hcy u premenopauzálních žen je signifikantně nižší v luteální fázi menstruačního cyklu než ve fázi folikulární [18].

Homocystein a asistovaná reprodukce

Ovariální stimulace u žen podstupujících metody asistované reprodukce snižuje koncentraci homocysteinu v krevní plazmě [17]. Podobně jako u fyziologického působení estradiolu v průběhu menstruačního cyklu se zřejmě jedná o důsledek indukce celkové enzymatické aktivity, která zahrnuje i enzymy katabolizmu homocysteinu, tedy především CBS [17]. Hyperhomocysteinemie u párů podstupujících metody asistované reprodukce je spojena s nižším podílem úspěšných nidací a klinických těhotenství a vyšším počtem potratů [19]. Hyper-homocysteinemie je spojena také s poruchami hemokoagulace, představující možnou příčinu vzniku mikro-trombů v děložních cévách, násled-kem kterých dochází k zábraně nidaceoplodněného vajíčka či může dojít k potratu.

Přítomnost homocysteinu ve folikulární tekutině byla poprvé prokázána v roce 1993 [20] a potvrzena novějšími pracemi [17,21]. Nízká koncentrace homocysteinu ve folikulární tekutině je spojena s vyšším stupněm zrání oocytu [20], zatímco vysoké hladiny homocysteinu a folátů ve folikulární tekutině mají negativní vliv na velikost a vývoj folikulu [17] a negativně korelují s úspěšností oplodnění oocytů a kvalitou embryí [3,21]. Negativní korelace s velikostí folikulu je výrazně silnější u žen, které neužívaly kyselinu listovou. Avšak u žen, které kyselinu listovou užívaly, překvapivě koncentrace folátu ve folikulární tekutině také negativně koreluje s velikostí folikulu. To naznačuje, že vysoké koncentrace jak Hcy, tak folátu mohou mít škodlivý vliv na růst folikulu a je třeba nalézt optimální dávky kyseliny listové nejen pro prevenci výskytu defektů neurální trubice, ale také pro zlepšení kvality oogeneze [17].

Zvýšená hladina Hcy také může potlačit syntézu estradiolu, a tím ovlivnit zrání oocytu a fertilizaci u žen se syndromem polycystických ovarií [17,21]. Koncentrace homocysteinu ve folikulární tekutině je u těchto žen výrazně vyšší ve srovnání se zdravými ženami a také u nich byla zjištěna negativní spojitost mezi hladinou homocysteinu a kvalitou oocytů a embryí a podílem fertilizace. Byla vyslovena hypotéza, že vyšší koncentrace homocysteinu ve folikulární tekutině může způsobovat poškození oocytu, které potom brání oplození. Homocystein může tedy u žen se syndromem polycystických ovarií, které podstoupily IVF, představovat vhodný marker pro stanovení kvality oocytů a embryí a predikci úspěšnosti fertilizace [21]. Produkce estradiolu buňkami zona granulosa u žen podstupujících metody asistované reprodukce je rovněž ovlivněna oxidačním stresem. Také zde se může jednat o souvislost s působením homocysteinu, který k rozvoji oxidačního stresu přispívá.

Protože je exprese CBS v lidském oocytu velmi nízká až nulová, remethylační metabolická dráha je v těchto případech jedinou alternativou pro odstranění nadbytečného homocysteinu. Homocystein zároveň inhibuje methylační děje, což vysvětluje jeho negativní vliv na vývoj oocytů a embryí. Tento negativní efekt na methylační reakce bychom měli mít na zřeteli zvláště s ohledem na trend kultivovat embrya v médiích postrádajících esenciální aminokyseliny včetně methioninu v době, kdy mají methylace nepostradatelný význam [22].

Gravidita a homocystein

Pro těhotenství je charakteristická řada fyziologických změn, které se týkají také hladiny homocysteinu, která je v plazmě těhotných žen o 50–60 % nižší než u ostatních žen [23].

Přesný důvod snížení Hcy během gravidity není znám. Mezi možná vysvětlení řadíme hemodiluci, zvýšenou produkci estrogenů, zvýšenou ledvinovou clearance homocysteinu nebo zvýšené požadavky rostoucího plodu na dávky methioninu [24,25].

Plazmatická hladina Hcy matky je vyšší než u plodu, přičemž mezi oběma existuje signifikantní přímá závislost [26,27]. Hladina Hcy plodu je přímo ovlivňována mateřskou koncentrací, a značný význam má proto transport homocysteinu přes placentární bariéru. V placentě dochází k přenosu homocysteinu přes plazmatickou membránu mikroklků buněk syncytio-trofoblastu třemi transportními systémy (L, A a y+L). U těhotných žen s hyperhomocysteinemií soutěží homocystein o tyto transportní systémy s ostatními endogenními aminokyselinami, což omezuje přísun daných aminokyselin vyvíjejícímu se plodu [27]. K depleci navíc může přispět i antiport Hcy/aminokyselina hlavním transportním systémem L.

V průběhu gravidity může dojít ke vzniku řady komplikací a patofyziologických stavů. U mnoha z nich hraje klíčovou roli také homocystein.

Samovolné a habituální potraty

Bylo zjištěno, že hyperhomocysteinemie zvyšuje riziko potratů až 3krát, neboť je spojena s poškozením deciduálních a chorionických cév, které může bránit nidaci oplodněného vajíčka nebo způsobit narušení cévního zásobení plodových obalů a následnou smrt plodu [28]. Možnosti terapie jsou limitovány etiologií [29].

Spontánní potrácení je ovlivněno také polymorfizmem methylentetrahydrofolát reduktázy (MTHFR) – genotyp 677TT představuje zvýšené riziko. Ačkoli mechanizmus působení není zcela objasněn, byla vyslovena hypotéza o spojitosti s hyperhomocysteinemií. Ta mimo jiné inhibuje methylační reakce hrající důležitou roli při opravách DNA a stabilizaci genomu. Polymorfizmus MTHFR je spojen se sníženou methylací DNA.

Nejen mateřská hyperhomocysteinemie zvyšuje riziko habituálního potrácení. I hyperhomocysteinemie otce, genotyp 677TT a vyšší věk jsou rizikovými faktory vzniku opakovaných potratů [30].

Vrozené vývojové vady

Hyperhomocysteinemie je spojena také s raně ontogenetickými postiženími, především defekty neurální trubice. Hlavní příčinou poruch uzavírání neurální trubice je nedostatek kyseliny listové v raných stadiích těhotenství, ale byla odhalena také souvislost s 677TT genotypem MTHFR [27]. Vyšší hladina homocysteinu byla nalezena také u matek dětí s orofaciálními malformacemi a vrozenými srdečními vadami. Prevencí všech těchto vrozených vývojových vad je podávání kyseliny listové prekoncepčně a dále v průběhu gravidity [24].

Závěr

Dnešní poznatky svědčí o významném vlivu homocysteinu na rozvoj oxidačního stresu a poškození zárodečných buněk. Přesná diagnostika může objasnit příčiny poruch plodnosti a vytvořit předpoklady pro cílenou terapii.

Práce byla podpořena grantem IGA MZ ČR NS/9661-4.

MUDr. Michaela Králíková
Biochemický ústav, LF MU, Brno
mkralik@med.muni.cz