Stanovení minimální zbytkové nemoci u B-buněčné chronické lymfocytární leukemie: možnosti a vývoj metodických přístupů založených na PCR a RQ-PCR

Souhrn

Stanovení minimální zbytkové nemoci (MRD) poskytuje důležitou informaci o léčebné odpovědi u hematologických malignit včetně chronické lymfocytární leukemie (CLL). Pro kontrolu dosažení remise onemocnění probíhá vývoj dostatečně citlivých kvantitativních metod detekce MRD na molekulární úrovni. Vedle mezinárodního protokolu na detekci minimální zbytkové nemoci u CLL pomocí čtyřbarevné průtokové cytometrie představuje jednu z nejcitlivějších kvantitativních metod metoda polymerázové řetězové reakce v reálném čase (RQ-PCR). Identifikace maligního klonu je založena na unikátní V_H-D-J_H přestavbě variabilní části genu těžkého imunoglobulinového řetězce (IgV_H) a kvantitativní alelově specifické (ASO – allele specific oligonucleotide) PCR, která umožňuje příznivý posun detekčního limitu MRD o jeden až dva řády. Metoda detekce MRD je založena na využití kombinace pacient specifických primerů a dvou TaqMan sond rozeznávajících sekvence J_H subgenů 1, 4, 5, 6 a lze ji použít u 90 % pacientů s diagnózou CLL. Aktualizovaný přístup využívá LNA (Locked Nucleic Acid) TaqMan sondy rozeznávající V_H subgeny. Kombinace LNA modifikované sondy a pacient specifických primerů představuje dostatečně specifický a sensitivní přístup ke stanovení MRD u pacientů.

Klíčová slova:
chronická lymfocytární leukemie (CLL), gen pro těžký imunoglobulinový řetězec (IgV_H), minimální reziduální nemoc (MRD), PCR v reálném čase (RQ-PCR)

Úvod

Chronická lymfocytární leukemie (CLL) zůstává nejčastějším typem hematologické malignity diagnostikované u dospělých jedinců v západní populaci. U pacientů dochází v krvi a lymfoidních orgánech ke kumulaci malých zralých lymfocytů s typickým imunofenotypem. CLL buňky exprimují povrchové antigeny CD5, CD19 a CD23 a současně jsou negativní pro povrchové markery CD22 a FCM7 (1). Onemocnění je charakteristické proměnlivým klinickým průběhem s celkovým přežitím v rozpětí měsíců až desítek let (2).

Po zavedení moderních léčebných režimů, které zahrnují léčbu monoklonálními protilátkami i alogenní transplantaci kostní dřeně nebo periferních kmenových buněk krvetvorby, je možné u významné části pacientů dosáhnout kompletní klinické remise (CR) (3). Přesto mnoho z těchto pacientů časem relabuje, což znamená, že dosažení CR nevylučuje přežívání zbytkové populace maligních buněk, které se stávají příčinou opakovaného nástupu onemocnění.

Kritériem pro minimální zbytkovou nemoc je počet maligních buněk, které jsou po terapii detekovatelné nejcitlivějšími dostupnými metodami (4). V současnosti je vypracován a standardizován mezinárodní protokol detekce MRD pomocí čtyřbarevné průtokové cytometrie (5) a zároveň citlivější přístup pomocí alelově specifické (ASO) polymerázové řetězové reakce v reálném čase (RQ-PCR). MRD negativita je definována jako přítomnost méně než jedné CLL buňky na 10 000 leukocytů v krvi nebo kostní dřeni a tato hodnota je spolehlivě detekovatelná oběma uvedenými metodami (4, 6).

Nové detekční technologie vícebarevné průtokové cytometrie a RQ-PCR prokázaly, že mnoho pacientů, kteří dosáhli CR podle doporučení 1996 NCI-WG, mělo detekovatelnou MRD. Ačkoli eradikace MRD může zlepšit prognózu, je třeba provést další klinické studie k upřesnění, zda by další léčba zaměřená výhradně na eliminaci MRD poskytovala zásadní přínos pro klinický stav pacienta (6).

Detekce MRD po léčbě je důležitou součástí sledování pacientů. Kvantifikace klonální reziduální populace leukemických buněk poskytuje cennou informaci o průběhu onemocnění v delším časovém horizontu, zvláště u pacientů, kteří dosáhli kompletní klinické remise. Umožňuje včasný záchyt nárůstu nádorové buněčné populace a upozornění na riziko možného relapsu.

V předkládaném článku uvádíme přehled metodik stanovení MRD založených na PCR včetně vlastních zkušeností: PCR s využitím konsensuálních primerů a alelově specifické ASO RQ-PCR pro monitorování reziduální nemoci po léčbě.

Detekční metody MRD založené na PCR a RQ-PCR

Pro sledování zbytkové populace maligních buněk je nutné mít k dispozici vhodný molekulární marker příp. sadu markerů jednoznačně odlišujících maligní buňku od zdravých buněk organismu. Flow-cytometrické stanovení MRD využívá typický imunofenotyp nádorových buněk, u některých leukemií je možné použít typické genomové aberace vedoucí ke vzniku fúzních genů (např. BCR/ABL u CML). U CLL je vhodným markerem sekvence těžkého řetězce imunoglobulinu (7), která je navíc běžně určována při vyšetření významného prognostického markeru CLL – mutačního stavu IgV_H.

Geny pro těžké a lehké řetězce imunoglobulinů (IgL, IgK) a TCR (T-cell receptor) jsou v rámci lidského genomu unikátní. Funkční gen vzniká až úspěšnou přestavbou jednotlivých subgenů na úrovni DNA. Každý z těchto genů (IgH, IgK, IgL, TRA, TRB, TRG a TRD) je složen z desítek subgenů čtyř kategorií – V (variable), D (diversity), J (joining) a C (constant), přičemž geny pro lehké řetězce imunoglobulinů IgK a IgL a pro podjednotky TCR TRA a TRG jsou složeny pouze ze subgenů V, J a C. Během vyzrávání lymfocytů dochází k procesu rekombinace, kterým vzniká výsledný gen. Při rekombinaci je spojen jeden V subgen s jedním D subgenem, J subgenem a C subgenem (obr. 1). Velké množství především V subgenů dovoluje vytvoření tisíců různých kombinací. Tento mechanismus umožňuje zakódovat do poměrně krátkého úseku DNA informaci pro produkci širokého spektra různých specifických antigeních receptorů (protilátek).

Gen pro těžký řetězec imunoglobulinu (IgH) je složen z V, D, J a C subgenů. Na přeskupeném genu je rozlišováno několik oblastí – FR1-3 a CDR1-3. Pro využití IGH jako cíle při stanovení MRD je nejvýznamnější oblast CDR3 (obr. 2). Jde o oblast spoje V-D a D-J subgenů. Při rekombinaci dochází k náhodné inzerci nebo deleci různého počtu nukleotidů právě v místech spojů jednotlivých subgenů a tak pro konkrétní lymfocyt i z něj vycházející klon vzniká charakteristická nukleotidová sekvence velmi dobře využitelná pro návrh specifických oligonukleotidů – PCR primerů nebo hybridizačních sond.

Protilátková diverzita je ještě zvětšena dalším pro lymfocyty specifickým procesem somatické hypermutace, kdy jsou do DNA sekvence imunoglobulinových genů záměrně vnášeny mutace. Přítomnost či nepřítomnost somatických hypermutací – tzv. mutační status IgV_H – je významným prognostickým markerem CLL (1, 8-12).

Výběr vstupního materiálu významně ovlivňuje interpretaci výsledků monitorování MRD. Detekce MRD ze vzorku periferní krve je obecně ekvivalentní stanovení z kostní dřeně. Výjimkou jsou pacienti léčení monoklonálními protilátkami, u nich dochází k výrazné redukci počtu leukemických buněk především v periferní krvi. Detekce MRD z periferní krve u těchto pacientů není zcela spolehlivá v průběhu prvních tří měsíců po terapii, kdy kostní dřeň může zůstávat vysoce MRD pozitivní, přestože výsledky vyšetření periferní krve jsou negativní (13). Dosažení MRD negativity v kostní dřeni je jedním z nejdůležitějších faktorů pro predikci trvání remise (14).

Technika detekce MRD pomocí konsensuálních primerů

Metoda konsensuální (konzervativní) PCR je kvalitativní metoda s poměrně variabilní senzitivitou (1 CLL buňka na 10²-10⁴ leukocytů) (10, 15, 16) a dnes se považuje za překonanou. Analýza je limitována přítomností zdravých polyklonálních B-lymfocytů. Detekce buněk CLL je rovněž omezena, pokud představují méně než 2 % z celkového počtu B-lymfocytů (17, 18). Technika konsensuální PCR je založena na amplifikaci CDR3 klonotypové oblasti za použití FR1-IgH sady primerů nebo konsensuálního FR3 primeru a jednoho konsensuálního fluorescenčně značeného J_H primeru (19, 20). Klonální PCR produkt je detekován kapilární elektroforézou nebo elektroforézou v polyakrylamidovém gelu. Sledované vzorky jsou označené jako pozitivní, jestliže jsou detekovány PCR produkty identických délek ve srovnání se vzorky před zahájením léčby (10). Tato metoda může být uplatněna pouze u 70– 80 % pacientů, protože přítomnost mutací v IgV_H genu narušuje vazbu konsensuálních (konzervativních) primerů (16). Aubin a kol. (17) publikoval práci o detekci klonality u B-buněčných malignit založenou na PCR amplifikaci IgH a srovnání citlivosti metody při použití různých kombinací FR a J_H primerů. Je také možné použít dvoukolovou klonotypovou PCR s vnitřními pro pacienta specifickými primery a konsensuálními J_Hprimery pro specifickou amplifikaci maligního klonu (21). Další varianty dvoukolové PCR popsali Voena a kol. (22) a Schulze a kol. (23).

Alelově specifická RQ-PCR

Kvantitativní detekce klonální přestavby IgV_H je založena na PCR v reálném čase (RQ-PCR) za použití alelově specifických primerů a TaqMan sondy. TaqMan sonda, která specificky hybridizuje se sekvencí mezi primery, je na 5ę konci značena kovalentně navázaným fluorescenčním barvivem (reporter, „R“), jehož emise světla je zhášena druhým fluorescenčním barvivem (zhášedlo, quencher, “Q”) navázaným na 3ę konec sondy. Sonda je rovněž na 3ę konci modifikována fosfátem, který zabraňuje extenzi sondy během PCR. Technologie je založena na měření fluorescenčního signálu reporteru. Při PCR dochází vlivem 5ęexonukleázové aktivity DNA polymerázy k odštěpení reportérového barviva a jeho uvolnění z blízkosti zhášedla, což vede k nárůstu fluorescence. Cyklus, ve kterém dojde k nárůstu fluorescence na stanovenou úroveň, se nazývá Ct (treshold cycle) a je nepřímo úměrný koncentraci vzorku DNA. Příprava alelově specifické (ASO) RQ-PCR zahrnuje návrh pro pacienta specifických primerů a sondy, a přípravu plazmidu s IgV_H sekvencí daného pacienta pro kalibraci. Standardní křivku je možné také získat postupným ředěním vzorku DNA odebraného v době diagnózy (odpovídajícího 100 % buněk CLL) do směsi polyklonální DNA v rozmezí 10–10^-6 (24). Jako referenční gen je možné zvolit např. gen pro albumin nebo ß-aktin. Pro každou reakci je nutné nejprve otestovat limit senzitivity a na směsi alespoň 5 polyklonálních DNA ověřit specifitu každé PCR. Senzitivita individuální ASO IgH RQ-PCR je definována jako poslední ředění standardu poskytující specifický fluorescenční signál. V případě nespecifické amplifikace, jako poslední ředění standardu s Ct hodnotou o více než jeden cyklus nižší než Ct hodnota polyklonální směsi DNA. Specifitu a následně senzitivitu reakce ovlivňuje CDR3 oblast klonu (délka vložených N, Nęnukleotidů).

Návrh klonově specifické TaqMan sondy pro každého pacienta je finančně a časově velmi nákladný a v současnosti se obecně využívá modifikovaná strategie RQ-PCR. Metodika používá pouze dvě J_H hybridizační sondy (J_HQ1/4/5 a J_H6) a čtyři reverzní J_H primery homologní k zárodečným J_H genovým segmentům. Sondy jsou komplementární ke konzervativní oblasti J_H genových segmentů čtyř nejčastěji využívaných J_H rodin v rámci IgH přestavby (obr. 3). Kombinací ASO (Nę - D - N) primerů, konsensuálních J_H sond a primerů je možné detekovat přibližně 90 % možných IgH klonálních přestaveb (24). Uvedený přístup nelze použít pro klonální přestavby IgV_H s J_H2 a J_H3 segmentem. Důležitý je návrh pro pacienta specifického primeru do klonotypové CDR3 oblasti a optimalizace reakčních teplot. Nicméně J_H sondy mohou detekovat nepříbuzné přestavby IgH a specifita reakce některých analýz je nízká. Maximální dosažená senzitivita metody je 10^-5 (1 leukemická buňka mezi 100 000 zdravými) (24, 25).

Další modifikaci detekce MRD popsal Gribben (26). Navržená analýza využívá omezenou sadu sond navrženou do konzervativní FR3 oblasti V_H genových rodin a aplikace je možná u většiny pacientů.

Principiálně podobné metodě využívající TaqMan sondy je použití dvojic značených sond pro LightCycler (Roche). Shodný přístup se sadou šesti sond umístěných do FR3 oblati V_H rodin popsal Pfitzner a kol. (27, 28).

Flexibilnější přístup ke stanovení MRD u pacientů s diagnózou CLL umožňují TaqMan LNA (Locked Nucleic Acid) sondy. LNA je nový typ analogu nukleových kyselin, který obsahuje 2ęO, 4ęC metylenový můstek. Ten omezuje flexibilitu ribofuranosového kruhu a uzavírá strukturu v rigidní konformaci. Tento systém zaručuje biologickou stabilitu LNA monomeru a zvýšenou stabilitu a specifitu hybridizace. Jde o krátké sondy s vysokou teplotou tání (Tm), zvýšenou diskriminační schopností a vazebnou afinitou (29). TaqMan sondy mohou obsahovat až 6 LNA monomerů a teplota tání (Tm) duplexu je o několik ľC vyšší na každý zařazený LNA nukleotid. To umožňuje návrh kratších sond pro problematické cílové sekvence, v případě IgH kratší sondy dovolují snadnější návrh konsensuálních oligonukleotidů a snižují riziko poklesu hybridizace vyplývající z procesu hypermutace.

Ke sledování MRD se ve většině laboratoří používá jako templát DNA. Výhodou je větší stabilita a přímé použití na rozdíl od přípravy cDNA reverzní transkripcí z RNA a také menší nároky na rychlost transportu odběru a jeho zpracování. Dosahovaná senzitivita detekce MRD při použití DNA a klasických i LNA TaqMan sond je obecně 10^-5. Použitím cDNA jako templátu lze dosáhnout zvýšení senzitivity vyšetření až o tři řády (30). Nicméně počet transkriptů IgV_Hnemusí reálně odpovídat počtu buněk CLL.

Alternativní princip kvantitativní RQ-PCR je založen na využití fluorescenčního barviva SYBRGreenII interkalujícího se do dvouřetězcové DNA a detekci vzniklé fluorescence. Tento přístup neodstraňuje problémy spojené s nespecifickou amplifikací, protože je detekována každá dvouřetězcová DNA (primerové dimery, nespecifické produkty) a může docházet ke zkreslení vlastní kvantifikace (falešné zvýšení měřené fluorescence). Specifita reakce je zajištěna pro pacienta specifickými primery (ASO), jeden vždy navržen do hypervariabilní CDR3 oblasti (30). Výhodou aplikace SYBRGreenu je nízká cena ve srovnání s náklady na syntézu značených sond a univerzální použití.

RQ-PCR – naše zkušenosti

Pro monitorování MRD u pacientů s diagnózou CLL jsme nejprve používali kvantitativní metodu RQ-PCR se SYBRGreenII fluorescenční značkou. Při nízkých finančních nákladech metoda umožňovala sledování MRD u všech pacientů bez omezení. Pro každého pacienta byl navržen specifický pár primerů, jeden oligonukleotid vždy lokalizován do CDR3 oblasti expandovaného maligního klonu. Pro přesnou kalibraci byl připraven plazmid s IgV_H sekvencí daného pacienta. Jako referenční gen standardně používáme fragment albuminového genu. Výsledky jsou vyjádřeny jako poměr klonálního IgV_H a referenčního albuminového genu.

Vzhledem k problémům s nedostatečnou specifitou reakce jsme nejprve převzali metodiku RQ-PCR založenou na kombinaci dvou J_H-genově specifických TaqMan sond (JHQ1/4/5, JHQ6) a čtyř J_H primerů homologních k zárodečným J_H genovým segmentům (24). Pro dosažení optimálních výsledků bylo nutné modifikovat složení reakční směsi – množství templátu a reagencií. Specifita tohoto typu RQ-PCR u konkrétního pacienta vždy závisí na návrhu ASO oligonukleotidu a optimalizaci reakčních teplot.

Následně jsme zvolili nový přístup ke stanovení MRD – RQ-PCR využívající LNA (Locked Nucleic Acid) sondy a TaqMan technologii. Pro jednotlivé V_H rodiny byly do FR3 oblasti navrženy LNA modifikované TaqMan sondy (TIB MolBiol, Berlín) specifické pro všechny klony dané V_H rodiny (obr. 3). Pro každého pacienta byly navrženy specifické oligonukleotidy, jeden vždy lokalizován do klonotypové CDR3 oblasti. Pro konstrukci standardní křivky byl připraven plazmid se sekvencí IgV_H pacienta. Jako referenční gen jsme zvolili gen pro albumin. Senzitivita metody dosahuje 10^-5 a u žádného ze sledovaných pacientů nevznikl problém s nespecifickou amplifikací. Tato metoda přináší v porovnání s předchozím přístupem řadu výhod k nimž patří především vyšší specifita reakce. Z toho vyplývá i podstatně kratší doba optimalizace a testování analýzy pro konkrétního pacienta.

Dynamiku MRD jsme sledovali výlučně u pacientů po alogenní transplantaci krvetvorných buněk (obr. 4a-d). V transplantované skupině byli pouze pacienti s nemutovaným IgV_H. V případě pacientů s hypermutovaným IgV_H, u nichž by nebylo možné použít navrženou V_H specifickou LNA sondu, lze pro sledování navrhnout specifickou LNA sondu pro daného pacienta.

Prezentujeme zde monitorování MRD na příkladu čtyř vybraných pacientů. Dynamika MRD na molekulární úrovni byla souběžně srovnávána s výsledky stanovení MRD metodou čtyřbarevné průtokové cytometrie podle mezinárodně standardizovaného protokolu A. Rawstrona (2007). Analýzou fenotypu CLL buněk je možné určit hladinu MRD v periferní krvi a kostní dřeni s citlivostí až 0,01 % z leukocytů, přičemž vzorek může být analyzován, pokud je zastoupení CD5+19+ populace menší než 5 % z leukocytů. Srovnání hladiny MRD oběma metodami spolehlivě korelovalo, přičemž molekulární vyšetření je o řád citlivější a dříve upozornilo na opětovný výskyt nebo malý nárůst buněk nádorového klonu CLL. Odběry se u jednotlivých pacientů prováděly v měsíčních intervalech a při přesvědčivém nárůstu sledovaného klonu umožnily včasnou léčebnou intervenci (obr. 4a). Molekulární vyšetření není ovlivněno fenotypovými změnami buněk CLL, například důsledkem léčby, a jde v současné době o přístup s maximální senzitivitou, kterým lze na základě častého sledování dynamiky nádorového klonu CLL předvídat hematologický relaps. Sledování minimální reziduální nemoci vysoce citlivými metodami u pacientů po terapii má zásadní prognostický význam a umožňuje včasnou modifikaci terapie při incipientním relapsu nemoci.

Závěr

V roce 2008 byly vydány aktualizované směrnice mezinárodní pracovní skupiny pro CLL (International Workshop on CLL, IWCLL) (6), podle kterých je doporučeno zařadit sledování MRD do klinických studií. I když klinický význam stanovení MRD bude možné zhodnotit až na základě probíhajících studií, dá se předpokládat, že především u pacientů po transplantaci krvetvorných buněk bude toto vyšetření přínosem. Molekulární remise tj. dosažení negativity MRD má nepochybně pozitivní dopad na další vývoj onemocnění, záchyt opětovného nárůstu maligního klonu může být impulsem pro včasnou léčebnou intervenci. Podle našich zkušeností časté monitorování buněk nádorového klonu CLL citlivější metodou RQ-PCR spolehlivě upozorní na budoucí nástup hematologického relapsu onemocnění.

Zkratky

CLL - chronická lymfocytární leukemie

IgV_H- variabilní část těžkého řetězce imunoglobulinového genu

CDR1-3 - complementarity determining region 1-3

FR1-3 - framework region 1-3

V_H-D-J_H - variabilní (variable) – rozlišovací (diverzity) – spojovací (joining) segment genu těžkého imunoglobulinového řetězce

PCR - polymerázová řetězová reakce

ASO RQ-PCR - alelově specifická polymerázová řetězová reakce v reálném čase

MRD - minimální zbytková nemoc (minimal residual disease)

BCR - B buněčný receptor

FCM - průtoková cytometrie (flow cytometry)

Práce byla podpořena grantem IGAMZČR No. NS10439-3/2009 a výzkumným záměrem MSM 0021622430.

Mgr. Hana Skuhrová Francová

Centrum molekulární biologie a genové terapie

Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno

Černopolní 9

613 00 Brno

Do redakce doručeno: 1. 6. 2009

Přijato: 14. 10. 2009