Externí hodnocení kvality stanovení CD34+ buněk v České a Slovenské republice – dlouhodobé zkušenosti z osmiletého období

Souhrn

Stanovení počtu CD34+ buněk průtokovou cytometrií je základní metodou pro hodnocení kvality transplantátů hemopoetických kmenových buněk a pro plánování leukaferéz k jejich odběru. Metoda je založena na víceparametrové průtokové cytometrii a je mezinárodně dobře standardizovaná. Program EHK pro CD34+ kvantifikaci je v rámci ČR a SR k dispozici od roku 2010 a účastní se jej více než 20 laboratoří. Vyhodnocení 8leté zkušenosti ukázalo výbornou dlouhodobou úspěšnost účastníků pohybující se mezi 80–100 % s ojedinělými výkyvy. Část účastníků, kteří jsou do programu zapojeni od začátku, dosahuje dokonce 90% úspěšnosti. Reprodukovatelnost výsledků měření je velmi závislá na množství CD34+ buněk ve vzorku. Při počtu CD34+ buněk nad 10/μl se pohybuje CV okolo 10 %, pod touto hladinou roste o desítky procent. Program hraje důležitou roli v harmonizaci měření CD34+ buněk mezi transplantačními centry a zvyšuje pravděpodobnost získání přesných a porovnatelných výsledků.

Klíčová slova:

variabilita – kontrola kvality – CD34+ – EHK

ÚVOD

Transplantace hemopoetických kmenových buněk (autologní nebo alogenní) je dnes standardní léčebnou modalitou pro řadu hematologických nádorových, ale i nemaligních onemocnění. Množství kmenových buněk v transplantátu určuje kinetiku přihojení („engraftment“) a ovlivňuje výsledek samotné transplantace bez ohledu na to, zda se jedná o kostní dřeň nebo mobilizované periferní kmenové buňky [1]. Přesné a reprodukovatelné měření krvetvorných buněk je zcela zásadní a má významný klinický dopad. Umožňuje nám posuzovat kvalitu transplantátů, monitorovat množství kmenových buněk v průběhu zpracování či manipulace se štěpy, ale slouží také ke správnému načasování aferéz při mobilizaci a odběru periferních kmenových buněk.

Standardně využívanou metodou stanovení kmenových buněk je detekce CD34+ buněk pomocí průtokové cytometrie. CD34+ buněčná frakce obsahuje hlavní část hemopoetické kapacity schopné zajistit rekonstituci víceliniové hematopoézy [2]. Množství CD34+ buněk v transplantátu na kilogram hmotnosti příjemce je základním parametrem určujícím kvalitu štěpu. Jsou definovány doporučené dávky CD34+ buněk pro jednotlivé typy štěpů a transplantací [3]. Klonogenní testy založené na počítání kolonie tvořících jednotek mají oproti cytometrii některé nevýhody, z nichž nejvíce omezující je časová náročnost, ale také subjektivita hodnocení a omezená reprodukovatelnost a standardizace, a proto je jejich praktické využití omezené.

Pro cytometrické měření se využívají různé způsoby přípravy vzorku, různé protilátky, fluorochromy a „gating“ strategie. Zastoupení CD34+ buněk ve vyšetřovaných materiálech se pohybuje v širokém rozmezí od setin procent, resp. jednotlivých buněk na μl až po procenta, resp. stovky buněk na μl. V extrémních oblastech tohoto spektra, a to zejména při nízkých hodnotách na úrovni tzv. „rare events“, se dostává analytická metoda mimo své běžné limity.

Z výše uvedených důvodů byla vypracována řada národních a mezinárodních odborných doporučení pro CD34+ kvantifikaci, jejichž cílem je dosažení nízké intra- i mezilaboratorní variability [4, 5]. Východiskem je vždy víceparametrová průtoková cytometrie, která detekuje kmenové buňky na základě exprese znaků CD34 a CD45 zpravidla v kombinaci s vitálním barvením a zároveň využívá sekvenční „gating“ k vyloučení nespecifických událostí. Nejvíce rozšířený je postup navržený mezinárodní společností pro buněčnou terapii (www.isct.org, dříve ISHAGE) [4].

V řadě studií byla i přes harmonizační snahy pozorována významná variabilita výsledků mezi jednotlivými transplantačními centry, která poukázala na skutečnost, že výsledek CD34+ měření je ovlivněn řadou proměnných, jako je typ vzorku a jeho zpracování, zkušenost personálu, analýza naměřených dat apod. [6–8]. S ohledem na komplexnost CD34+ kvantifikace, její sklon k mezilaboratorní variabilitě na straně jedné a velký klinický dopad na straně druhé, je důležitou součástí tohoto stanovení externí hodnocení kvality (EHK), které umožňuje zúčastněným laboratořím nezávisle porovnávat své výsledky a ověřovat správnost svých měření. Národní program EHK pro CD34+ kvantifikaci je v České republice k dispozici od roku 2010. Cílem tohoto sdělení bylo vyhodnotit dlouhodobou zkušenost s programem EHK pro stanovení CD34+ buněk za osmileté období, shrnout jeho výsledky a případné trendy.

MATERIÁL A METODIKA

Organizace a metodika hodnocení EHK

Program externího hodnocení kvality pro stanovení CD34+ buněk obsahuje každý rok dva cykly v jarním a podzimním termínu. Vzorky jsou připravovány centrálně na pracovišti supervizora. Jedná se o periferní krev pacientů mobilizovaných k odběru autologních hemopoetických kmenových buněk. Pacienti musí být negativní na základní infekční markery (HBsAg, anti-HBc, anti-HCV, syfilis, anti-HIV, p24 Ag) a musí podepsat informovaný souhlas.

Krev je ihned po odběru „aliquotována“ (rozdělena do více zkumavek pro další analýzu) a ošetřena stabilizačním roztokem TransFix podle doporučení výrobce (Cytomark, Buckingham, UK). Příprava probíhá v závislosti na kinetice vyplavení CD34+ buněk koncem týdne, účastníkům jsou vzorky odesílány v pondělí. Oproti jiným programům EHK zde není den rozesílání vzorků účastníkům stanoven předem a upřesňuje se e-mailem v závislosti na dostupnosti vhodných vzorků. Účastníci realizují měření na různých typech cytometrů, s využitím různých reagencií a různých analytických software, neprovádí se žádná mezilaboratorní metodologická ani přístrojová standardizace. Od druhé poloviny roku 2013 účastníci dostávají 2 vzorky (do té doby byl rozesílán jen jeden vzorek). V rámci každého cyklu se provádí na pracovišti supervizora studie stability, která ověřuje kvalitu vzorků po dobu 4 dnů od rozeslání, protože v tomto období provádějí účastníci měření.

Program EHK hodnotí vždy celkem tři zkoušky, které účastníci uvádění ve výsledkových listech: absolutní počet leukocytů (WBC 10⁹/l), relativní počet CD34+ buněk (CD34+_REL, %) a absolutní počet CD34+ buněk (CD34+_ABS, počet/μl). Při zpracování výsledků se jako vztažné hodnoty (AV) používají robustní průměry (RoM). Maximální povolené odchylky výsledků účastníků od vztažné hodnoty (tzv. D_max) jsou nastaveny podle kritérií uvedených v tabulce 1.

Na základě D_max je stanoveno rozmezí ohraničené dolní (LL) a horní (UL) mezí, které definuje „správný“ výsledek pro hodnocení úspěšnosti účastníka v dané zkoušce. Úspěšnost je vyjádřena i graficky v Youdenových grafech (graf 1). Nejdůležitějším hodnoceným parametrem je absolutní počet buněk CD34+, který zahrnuje celý proces měření a nejlépe odráží celkovou výkonnost laboratoře pro tuto analýzu.

Účastníci cyklu EHK obdrží individuální hodnocení pro každou z výše uvedených 3 zkoušek, přičemž zkouška je hodnocena jako úspěšná tehdy, pokud účastník uvedl správný výsledek dané zkoušky pro oba vzorky. Kromě vlastního hodnocení dostávají účastníci i další informace, jako například počet účastníků cyklu, rozptyl naměřených výsledků, celková úspěšnost apod.

VÝSLEDKY

Dlouhodobé výsledky EHK

Bylo vyhodnoceno celkem 16 cyklů EHK pro stanovení CD34+ buněk, které proběhly v období 2010–2018. Stanovení CD34+ buněk je specifickou problematikou, která je vázána zejména na transplantační centra a větší centralizované laboratoře, proto se dotýká relativně menšího počtu účastníků. Do programu je dlouhodobě zapojeno přes dvacet laboratoří, z toho cca 40 % představují účastníci ze Slovenska (graf 2.).

Celková úspěšnost (všichni účastníci) stanovení relativních a absolutních hodnot CD34+ buněk se většinou pohybovala mezi 80 do 100 % (graf 3). Uvedený graf rovněž ukazuje, že 3krát celková úspěšnost významněji poklesla pod 80 %:

• V prvním cyklu roku 2010 celková úspěšnost jen mírně přesáhla 60 % – jednalo se o vůbec první cyklus EHK zaměřený na měření počtu CD34+ a nižší úspěšnost lze přičíst „počátečním obtížím“ (záměna jednotek, formální chyby při zápisu výsledků).
• V druhém cyklu roku 2013 dosáhla celková úspěšnost jen 65 % – tento cyklus byl první, ve kterém jsme účastníkům začali posílat 2 vzorky, a tím skokově vzrostla obtížnost, protože jako úspěšní jsou při použití 2 vzorků hodnoceni jen ti, kteří uvedou správné výsledky pro oba vzorky (navíc jsme v tomto cyklu poprvé od roku 2010 zařadili vzorek s relativně nízkým (pod 10/µl) zastoupením buněk CD34+).
• V druhém cyklu roku 2015 dosáhla celková úspěšnost 72 %. Zde se nám nepodařilo najít nějakou objektivní příčinu snížené úspěšnosti – zřejmě se jednalo o nešťastnou kombinaci náhodných chyb měření.

Při posuzování celkové úspěšnosti je rovněž nutné mít na paměti to, že při malém počtu účastníků je celková úspěšnost v jednotlivých cyklech silně ovlivněna i jen jednotlivými neúspěšnými účastníky (při 20 účastnících v cyklu způsobí 2 neúspěšní pokles celkové úspěšnosti o 10 %).

Kromě celkové úspěšnosti jsme sledovali i vývoj individuální úspěšnosti pro 15 laboratoří, které se účastní programu dlouhodobě (absolvovaly všechny cykly od roku 2013). Celkem 10 laboratoří vykazuje dlouhodobou relativní úspěšnost nad 80 % a 7 laboratoří dokonce nad 90 % (graf 4.).

V průběhu 8 let fungování EHK jsme se setkali také s velmi neúspěšnými pracovišti (šlo o 2 pracoviště s úspěšností do 20 %), která se do programu EHK zapojila jen na krátkou dobu a pak svou účast ukončila. Stanovení CD34+ buněk nepředstavovalo pravděpodobně v těchto laboratořích rutinní vyšetření, které bylo v kontextu slabých výkonů v EHK následně přenecháno jiným pracovištím s větším objemem analýz a zkušeností.

Neúspěšnost měření byla v některých případech způsobena i formálními chybami účastníků, zejména ve výpočtech, kdy vzájemně nekoreloval počet leukocytů a absolutní a relativní počet CD34+ buněk. V takových případech jsme účastníkům zasílali individuální komentáře a v průběhu několika let tento typ chyb prakticky vymizel.

Reprodukovatelnost výsledků měření (tj. rozptyl hodnot naměřených jednotlivými laboratořemi) byla významně závislá na „buněčnosti“ rozeslaných vzorků. Nízké zastoupení CD34+ buněk v testovaném materiálu vedlo ke strmému nárůstu rozptylu, jak ukazuje graf 5. Pokud vzorek obsahoval méně než 10 buněk/μl, vzrostl variační koeficient (CV) na desítky až stovky (!) procent, zatímco u vzorků s vyšším zastoupením buněk se CV běžně pohyboval mezi 6 a 20 % (průměrně 13 %). Jakkoli může na první pohled CV v řádu desítek či stovek procent vypadat děsivě, jedná se o očekávaný výsledek, který nemá klinický dopad (z klinického pohledu není podstatné, zda byl naměřen počet CD34+ „jedna buňka na µl“ nebo „dvě buňky na µl“ – strategii péče o pacienta to nijak neovlivní). V podobných případech byl při hodnocení výsledků účastníků adekvátně rozšiřován D_max, a to i s ohledem na malý klinický význam variability v těchto nízkých hodnotách (například ve druhém cyklu roku 2014 naměřili účastníci přibližně jednu buňku na µl, přičemž jako správné byly hodnoceny výsledky od 0 do 5 buněk/µl).

Stanovení absolutního počtu CD34+ buněk je možné buď výpočtem z absolutního počtu leukocytů změřeného hematologickým analyzátorem a procenta CD34+ buněk stanoveného průtokovým cytometrem (dual platform metoda, DP), nebo je možné jej získat přímo z cytometru pomocí vhodného kalibračního standardu (single platform metoda, SP). Kolem 60 % účastníků využívá metodu SP, cca 40 % metodu DP (ovšem někteří účastníci metodu měření neuvádí a někteří účastníci metody měření mezi jednotlivými cykly střídají).

DISKUSE

Kvantifikace CD34+ buněk představuje speciální laboratorní metodu, která má zásadní význam pro hodnocení kvality transplantátů hemopoetických kmenových buněk a posuzování efektivity mobilizace a odběru periferních kmenových buněk pro účely autologních i alogenních transplantací, stejně jako se uplatňuje v rámci diferenciální diagnostiky myeloproliferativních neoplazií. Přesné stanovení počtu krvetvorných kmenových buněk je v transplantační medicíně zásadní. Dávka životaschopných CD34+ buněk je kritickým parametrem pro dlouhodobé přihojení a jsou stanovené minimální požadavky na kvalitu transplantátů.

Externí hodnocení kvality je důležitou součástí systému kontroly kvality klinické laboratoře. EHK napomáhá odhalení možných problémů v laboratorní analýze a identifikaci jejich příčin. Účast v programech EHK je zároveň příležitostí pro ověřování způsobilosti pracovníků a také jedním z důležitých akreditačních požadavků.

Program externího hodnocení kvality stanovení počtu CD34+ buněk byl v České republice a na Slovensku zahájen v roce 2010. Výsledky programu CD34+ jsou uspokojivé, celková úspěšnost v posledních letech se pohybuje nad 80 %. Přes vysokou míru standardizace, které bylo pro tuto analýzu celosvětově dosaženo (doporučené postupy pro měření, hodnocení výsledků, validované kity a cytometrické moduly), existuje stále určitá mezilaboratorní variabilita daná řadou okolností, jako jsou typ a nastavení cytometru, příprava vzorku, analýza dat atd. Tato variabilita může být snížena hlavně díky maximálnímu sjednocení protokolů a edukaci personálu, jak potvrdila multicentrická studie ve 24 evropských centrech, kdy se po implementaci standardizovaného postupu podařilo snížit mezilaboratorní CV z 23 % na 11 % [6]. V rámci EHK pak nelze jako jeden z faktorů zvyšujících variabilitu výsledků opominout ani vlastnosti samotných vzorků, které ve srovnání se vzorky pacientů obsahují stabilizační roztok, který umožňuje krátkodobé skladování a následný transport od poskytovatele do laboratoře účastníka.

Reprodukovatelnost výsledků (mezilaboratorní variabilita) byla v naší analýze ovlivňována zejména zastoupením CD34+ buněk v kontrolním vzorku. Průměr CV pro vzorky s vyloučením extrémně nízkých hodnot byl 13 %. Ovšem CV významně narůstalo při poklesu množství CD34+ buněk pod 10, resp. 5 buněk/μl. Variabilita měření ve stabilitních studiích se pohybovala do 10 %. Reprodukovatelnost uváděná v multicentrických studiích se pohybuje od 10 do 28 %, a to často na vzorcích s vyšším zastoupením CD34+ buněk, kde je variabilita přirozeně nižší [6, 9].

Přestože klinická relevance intra- i interlaboratorní variability je v nízkých hodnotách zpravidla zanedbatelná, je zařazování takovýchto vzorků do EHK důležité. Jednak odráží běžnou klinickou situaci a zejména umožňuje i přes očekávaný vyšší rozptyl ověřovat laboratořím, že jejich výsledky spadají do řádově stejných rozmezí a nedochází k chybnému nadhodnocování množství CD34+ buněk. Zároveň by si laboratoře měly uvědomovat, že při nízkých hodnotách roste nejistota měření, a s tímto vědomím by měly výsledek interpretovat, případně provádět v indikovaných případech opakovaná měření vzorku a stanovovat z nich průměrné hodnoty. Ideálně by měla mít laboratoř stanovenu dvojí nejistotu měření, jednak pro vzorky v běžném klinickém rozmezí a jednak pro vzorky s nízkými počty buněk CD34+, a uvádět ji ve výsledkových listech. Jednou z možností snížení nejistoty měření je také zvýšení počtu načítaných událostí. Pro nízké hladiny CD34+ buněk by mělo být načítáno minimálně 200 tisíc událostí [10].

Dalším opatřením pro snížení variability měření je využití single platform metody, kdy je relativní i absolutní počet CD34+ buněk stanoven průtokovým cytometrem. Odstraněním hematologického vstupu a případných nepřesností vnášených do analýzy hematologickým analyzátorem, ale také např. zaokrouhlováním procenta CD34+ buněk, dochází k redukci počtu složek nejistoty měření v porovnání s dual platform metodou, jak prokázala řada studií [11, 12]. V rámci výsledků získaných v našem programu EHK se bohužel k uvedeným údajům můžeme vyjádřit pouze omezeně, protože počet účastníků je příliš nízký na to, aby umožňoval podrobnější analýzu. Nicméně i v našem souboru je patrné, že úspěšné laboratoře častěji využívají SP metodu, zatímco nejméně úspěšné spoléhají výhradně DP přístup. Na druhou stranu je vhodné SP metodu doporučit spíše zkušeným laboratořím, které s ní zacházejí rutinně a jsou schopny splnit zvýšené nároky na precizní přípravu vzorku.

ZÁVĚRY

Stanovení CD34+ buněk reprezentuje v rámci EHK velmi specifický program s malým počtem účastníků a speciálně připravovanými vzorky, které vyžadují zvláštní péči v rámci logistických postupů. Přesto je jeho význam pro cílovou skupinu zejména hemato--onkologických nemocných poměrně zásadní. V současné době je program plně etablovaný, se stabilním počtem pravidelných účastníků, kteří vykazují vysokou míru úspěšnosti měření. Program přispívá k harmonizaci výsledků měření počtu CD34+ buněk. Správné měření CD34+ buněk patří mezi důležité indikátory kvality transplantačního centra a je zároveň předpokladem pro získávání přesných a porovnatelných multicentrických klinických dat.

Podíl autorů na přípravě rukopisu

DL – příprava a finalizace rukopisu

MB – statistická analýza, korekce rukopisu

PJ, MH – revize rukopisu

Poděkování

Podpořeno projektem institucionálního výzkumu MZČR –FNPI, 00669806.

Čestné prohlášení

Autor práce prohlašuje, že v souvislosti s tématem, vznikem a publikací tohoto článku není ve střetu zájmů a vznik ani publikace článku nebyly podpořeny žádnou farmaceutickou firmou. Toto prohlášení se týká i všech spoluautorů.

Do redakce doručeno dne 9. 3. 2019.

Přijato po recenzi dne 15. 4. 2019.

doc. MUDr. Daniel Lysák, Ph.D.

Hematologicko-onkologické oddělení

Fakultní nemocnice Plzeň

Alej Svobody 80

304 60 Plzeň

e-mail: lysak@fnplzen.cz