Význam biomarkerů NGAL a cystatinu C u kardiovaskulárních onemocnění

Souhrn

Cystatin C je inhibitor lyzozomálních proteáz a extracelulárních cysteinových proteáz, podílí na regulaci metabolizmu extracelulárních proteinů. Je plně filtrovatelný glomerulem a zcela se vstřebává a katabolizuje buňkami proximálního tubulu ledvin. NGAL (Neutro­phil gelatinase-associated lipocalin) je protein akutní fáze, podílí se na antibakteriální imunitě a jeho důležitou vlastností je tvorba komplexu s matrix metaloproteázou 9 (MMP-9), čímž zvyšuje její aktivitu a brání její degradaci. NGAL je volně filtrován přes glomerulární membránu a v proximálním tubulu ledvin je reabsorbován endocytózou. NGAL detekovaný v moči je produkován zejména v distálním nefronu. Podle sérové hladiny cystatinu C a NGAL je možné diagnostikovat akutní poškození ledvin o 1,5–2 dny dříve než při monitoraci funkce ledvin podle sérové hladiny kreatininu. Ve srovnání s informacemi, které poskytuje kreatinin nebo odhadovaná GFR, zvýšení hladiny cystatinu C přináší u pacientů s kardiovaskulárním onemocněním navíc informaci o prognóze těchto pacientů. Zvýšená hladina NGAL byla detekována u pacientů s akutním infarktem myokardu, srdečním selháním nebo po cévní mozkové příhodě. O prognostickém významu NGAL u pacientů po infarktu myokardu nebo se srdečním selháním je zatím minimum dat, rovněž chybí jejich srovnání navzájem a porovnání s běžně stanovovanými natriuretickými peptidy.

Klíčová slova:
cystatin C – NGAL – biomarker

Cystatin C

Fyziologické funkce cystatinu C

Cystatin C (také cystatin 3) je sérový protein tvořený 120 aminokyselinami s molekulovou hmotností 13,3 kDa. Poprvé byl izolován v roce 1961 z cerebrospinálního likvoru zdravých dobrovolníků a z moči pacientů s renálním selháním, sekvence aminokyselin byla popsána v roce 1982 [1]. Cystatin C je syntetizován všemi jadernými buňkami. Jeho fyziologickou funkcí je inhibice lyzozomálních proteáz a je zřejmě nejdůležitějším extracelulárním inhibitorem cysteinových proteáz (enzymů, které se podílí na degradaci extracelulárních proteinů). Cystatin C je plně filtrovatelný glomerulem a zcela se vstřebává a katabolizuje buňkami proximálního tubulu. Cystatin C není secernován ledvinami a za fyziologických podmínek se nachází v moči množství o koncentraci menší než 120 µg/l. Při poklesu glomerulární filtrace klesá množství cystatinu C, které je filtrováno a následně metabolizováno tubulárními buňkami, a tím stoupá jeho sérová koncentrace. Při poklesu schopnosti vstřebávání látek z glomerulárního filtrátu, tedy u pacientů s tubulární a smíšenou nefropatií, je v moči detekovatelný cystatin C v koncentraci nad 120 µg/l. Cut-off hodnota pro cystatin C je pro dospělé 0,95. Hodnoty cystatinu C jsou ve srovnání s kreatininem méně závislé na věku, pohlaví, etniku a množství svalové hmoty. Hladiny cystatinu C jsou mimo glomerulární filtrace ovlivněny vyšší hladinou HDL-cholesterolu, nižším body mass indexem, hypertenzí a proteinurií. Hladinu sérového cystatinu C mohou ovlivňovat hormony, které se podílí na regulaci syntézy proteinů, tj. hormony štítné žlázy a steroidní hormony [2,3].

Odhad glomerulární filtrace

Glomerulární filtrace (GFR) vyjadřuje množství plazmy filtrované za jednotku času z glomerulu do Bowmanova váčku, při normální funkci ledvin je hodnota GFR 100–130 ml/min/1,73 m². Běžně užívanou metodou ke stanovení GFR je výpočet kreatininové clearance. Ta se provádí výpočtem z plazmatické koncentrace kreatininu a množství kreatininu vyloučeného do moči za 24 hod. Limitací metody je nutnost přesného sběru moči za 24 hod. Hodnota kreatininové clearance je mírně nadhodnocena oproti GFR o 10–20 %, protože k vylučování krea­tininu dochází i jeho sekrecí v tubulech. K odhadu GFR se v praxi užívají vzorce vycházející z plazmatické hladiny kreatininu. Tyto vzorce byly stanoveny na základě rozsáhlých souborů pacientů se známou hladinou kreatininu a GFR. Vzorec na odhad kreatininové clearance dle Cockcroft-Gaulta vyžaduje informace o hladině kreatininu, věku, pohlaví a váze. Dalším užívaným vzorcem pro odhad GFR je tzv. MDRD vzorec (Modification on Diet in Renal Disease). Zde je nutné znát hladiny kreatininu, věk, pohlaví a etnikum, starší verze vzorce vyžadovaly i hladinu albuminu a urey. Nevýhodou tohoto vzorce je jeho validace pro chronická onemocnění ledvin, nikoli pro akutní renální selhání. Při odhadu GFR pomocí cystatinu C se vychází z jeho plazmatické hladiny a není nutný sběr moči [4]. Nevýhodou je ztráta validity výpočtu při těžké renální insuficienci při GFR pod 20 ml/min. Výhodou sledování renálních parametrů pomocí cystatinu C v intenzivní medicíně je možnost detekovat akutní renální selhání (definované jako nárůst cystatinu C ≥ 50 % a více, stadium R dle RIFLE kritérií) o 1,5–2 dny dříve než v porovnání s nárůstem hladiny kreatininu [5].

Prognostický význam cystatinu C

Je obecně známo, že i mírné postižení renálních funkcí, většinou stanovené na základě zvýšené hodnoty kreatininu nebo odhadované GFR, představuje významný prediktivní faktor horší prognózy, zejména u pacientů se známou ischemickou chorobou srdeční [6]. V posledním desetiletí byla publikována řada prací, které prokázaly, že mírně zvýšená hladina cystatinu C představuje biomarker k predikci zvýšeného rizika kardiovaskulární morbidity a mortality, a to nad rámec klasických rizikových faktorů a prediktorů nepříznivé prognózy, včetně kreatininu a odhadované GFR.

V práci, která prospektivně sledovala 4 637 pacientů, bylo prokázáno významně vzrůstající riziko celkové mortality s narůstající hodnotou cystatinu C i kreatininu (pro kreatinin křivka nebyla lineární, ale byla typu J, pro cystatin C byla závislost lineární). Důležité je, že pacienti v 5. quintilu dle cystatinu C (1/5 pacientů s nejvyšší hodnotou cystatinu C) měli zvýšené riziko úmrtí z kardiovaskulárních příčin [HR 2,27 (95% CI 1,73–2,97)], infarktu myokardu [HR 1,48 (95% CI 1,08–2,02)] a cévní mozkové příhody [HR 1,47 (95% CI 1,09–1,96)] oproti pacientům s nejnižší hodnotou cystatinu C, a to i po multivariantní adjustaci na ostatní rizikové faktory. Podobná prediktivní vlastnost se u krea­tininu neprokázala [7]. Mírně zvýšená hladina cystatinu C představuje prognosticky vyšší riziko kardiovaskulární příhody (kardiovaskulární úmrtí, infarkt myokardu, srdeční selhání, cévní mozková příhoda) u pacientů, kteří se doposud s ledvinami neléčili a jejichž odhadovaná GFR na základě sérové hladiny kreatininu je normální. Autoři došli k závěru, že se na tom podílejí buď nerenální faktory, které vedou k vyšší hladině cystatinu C, nebo že cystatin C představuje biomarker, který postihuje preklinické postižení ledvin, které ještě není diagnostikovatelné hladinou kreatininu či odhadovanou GFR, a již může predikovat zvýšenou kardiovaskulární morbiditu [8]. Studie PREVEND, která hodnotila hladinu cystatinu C a GFR stanovenou na základě výpočtu kreatininové clearance u 8 058 subjektů, zjistila, že hodnota cystatinu C částečně závisí na věku, pohlaví, hmotnosti či kouření a koreluje s hladinou CRP [9]. Ve studii PRIME, která prospektivně sledovala 9 758 mužů ve věku 50–59 let po dobu 5 let, byla srovnána podskupina mužů, u kterých se vyskytl v průběhu sledování infarkt myokardu nebo úmrtí z kardiovaskulárních příčin, s kontrolní podskupinou mužů bez kardiovaskulární příhody. Hodnota cystatinu C pozitivně korelovala s BMI, LDL-cholesterolem, triglyceridy a markery zánětu (CRP, IL-6, TNF-α a jeho receptory TNFR1A a TNF1B). Po adjustaci na tradiční rizikové faktory (kouření, věk, DM, hypertenze, LDL-cholesterol, HDL-cholesterol, triglyceridy) byla hladina cystatinu C nadále významným rizikovým prediktorem kardiovaskulární úmrtnosti. Předpovědní hodnota cystatinu C pozbyla významu, pokud byl do analýzy započítán CRP nebo IL-6. Zajímavé je rovněž zjištění, že vyšší hladina cystatinu C ve skupině pacientů s kardiovaskulární příhodou ve srovnání s kontrolami nebyla vysvětlitelná pouze poklesem glomerulární filtrace [10]. I další práce dokládají, že vyšší hodnota cystatinu C (dle ROC analýzy > 1 051 ng/ml) představuje nezávislý prediktor zvýšeného výskytu kardiovaskulárních příhod jak u pacientů po akutním infarktu myokardu [11,12], tak u stabilních pacientů se známou ischemickou chorobou srdeční [13].

Velmi zajímavý pohled na zvýšení hladiny a patofyziologickou funkci cystatinu C přinesla experimentální práce na zvířecím modelu Xie et al [14]. Prokázali, že oxidační stres vede k produkci cystatinu C kardiomyocyty. Zároveň zjistili, že vyvolání kardiomyo­patie po podání doxorubicinu nebo po myokardiální ischemii podvazem r. intervetricularis anterior na laboratorních zvířatech vede ke zvýšené hladině cystatinu C. Ten pak v ischemické tkáni myokardu inhibuje aktivitu katepsinu B a vede k akumulaci fibronektinu a kolagenu I/III. Cystatin C se tak podílí na regulaci metabolizmu extracelulární matrix bez ovlivnění aktivity matrix metaloproteináz. Toto může být jednou z příčin nerenálního zvýšení hladiny cystatinu C u pacientů po infarktu myokardu a zároveň pomáhá vysvětlit, proč může být znalost jeho hladiny přínosem u pacientů s ischemickou chorobou srdeční a monitorací renálních funkcí pomocí kreatininu.

NGAL

Fyziologické funkce NGAL

Lipokalin asociovaný s gelatinázou neutrofilů (Neutrophil gelatinase-associated lipocalin – NGAL nebo také lipocalin-2) je zástupce velké skupiny lipokalinů – malých extracelulárních proteinů s velkou funkční rozmanitostí. Tento protein akutní fáze je 25 kDa velký glykovaný monomer jednoduchých proteinových řetězců. Původně byl identifikován jako protein izolovaný ze specifických granul neutrofilů [15] a následně bylo prokázáno, že se kovalentně váže na neutrofilní gelatinázu (enzym ze skupiny matrix metaloproteáz – kolagenáza IV o velikosti 92 kDa, obsažená v neutrofilech) [16]. Kromě exkrece aktivovanými neutrofily může být NGAL uvolňován v malých koncentracích také epiteliálními buňkami, renálními tubulárními buňkami a během zánětu či zranění také hepatocyty [17]. Dále je přítomen v endoteliálních buňkách a buňkách makrofágů. Vysoké hladiny NGAL byly rovněž prokázány v adipocytech, poten­ciálně spojených s inzulinovou rezistencí u obézních [18].

NGAL – fyziologické funkce

NGAL tvoří důležitou součást přirozené antibakteriální imunity. Jeho bakteriostatické vlastnosti jsou dány vazbou na bakteriální siderofory, čímž brání bakteriím získávat železo z okolí [17]. Během vývoje ledvin podporuje epiteliální diferenciaci mezenchymálních kmenových buněk, což vede k tvorbě glomerulů, proximálních tubulů, Henleovy kličky a distálních tubulů [19]. Exprese NGAL je výrazně zvýšená při poškození epite­liálních buněk ledvin, tlustého střeva, jater a plic. To je pravděpodobně zprostředkováno skupinou transkripčních faktorů, označovaných jako NF-κB, které dokážou po akutním poškození rychle aktivovat epitelové buňky [20]. Důležitou funkcí NGAL je tvorba komplexu s matrix metaloproteázou 9 (MMP-9), čímž zpomaluje její inaktivaci tkáňovými inhibitory matrix metaloproteáz (TIMP-1), a vede tak k delšímu účinku její proteo­lytické aktivity a zároveň zvyšuje její aktivitu. MMP-9 se podílí na degradaci kolagenu [21,22]. Tvorba NGAL je často indukována u řady humánních nádorů, kde představuje prediktor špatné prognózy [23]. Samotný NGAL by se pak mohl podílet na invazivním chování nádoru.

NGAL – biomarker poškození ledvin

Plazmatický NGAL je volně filtrován přes glomerulární membránu a v proximálním tubulu je prakticky všechen reabsorbován pomocí endocytózy. Detekce NGAL v moči je možná pouze v případě, že došlo k poškození proximálního tubulu, a tím k poruše zpětného vstřebávání, anebo je výrazně zvýšená syntéza NGAL de novo. Studie zabývající se genovou expresí NGAL při akutním poškození ledvin prokázaly rychlou a masivní up-regulaci NGAL mRNA v distálním nefronu, a to zejména ve vzestupném raménku Henleovy kličky a sběrných kanálcích. Výsledná syntéza proteinu NGAL a jeho sekrece v distálním nefronu proto zřejmě tvoří hlavní část NGAL detekovaného v moči. Zvýšená exprese NGAL v distálním tubulu a jeho rychlá sekrece do dolních močových cest je v souladu s jeho antimikrobiální funkcí a odpovídá také podpoře buněčné proliferace.

Ve vztahu k plazmatické hladině NGAL se ovšem ledviny nezdají být jeho hlavním zdrojem. Ve zvířecích studiích odběr vzorku ipsilaterální renální žíly po unilaterální ischemii ukázal, že NGAL syntetizovaný v ledvinách není vyplaven do krevního řečiště, ale je hojně přítomen v ipsilaterálním ureteru [24]. Akutní renální poškození vede ke zvýšení exprese NGAL mRNA zejména v játrech a plicích. Nově vytvářený protein NGAL se uvolní do krevního oběhu a představuje většinu tzv. systémového poolu NGAL. Další část systémového NGAL pochází z neutrofilů a monocytů, je totiž reaktantem akutní fáze a během imunitní reakce je jimi uvolňován do systémového oběhu [25]. Navíc každý pokles GFR vyplývající z ledvinného poškození vede ke snížení renální clearance NGAL a jeho následné akumulaci v systémové cirkulaci. Přesný podíl těchto mechanizmů na nárůstu plazmatické hladiny NGAL zatím není přesně určen. Velmi důležitou informací je, že ke zvýšení koncentrace NGAL v krvi i moči dochází již 2 hod po poškození ledvin (ischemickém, nefrotoxickém či septickém). Zvýšení jeho koncentrace tak předchází zvýšení kreatininu v séru o 12–24 hod [26]. Např. diagnostika kontrastem indukované nefropatie je možná s využitím stanovení hladin NGAL již po 2 hod po aplikaci kontrastní látky z moči i séra (senzitivita 71 %, specificita 100 %) [27]. U pacientů s chronickou renální insufi­ciencí (CHRI) hladiny NGAL korelují se závažností renálního poškození, sérovou hladinou kreatininu, glomerulární filtrací (GFR) a proteinurií. Nicméně je třeba poznamenat, že poměrné zvýšení plazmatické hladiny NGAL je obecně výrazně nižší, než se obvykle vyskytuje při akutním renální postižení [28].

NGAL má jako biomarker akutního poškození ledvin téměř všechny ideální vlastnosti: jeho odběr je snadno proveditelný ze vzorku krve či moči, je měřitelný pomocí standardizovaných laboratorních metod, je dostatečně citlivý pro včasné rozpoznání poškození ledvin a má široký dynamický rozsah a cut-off hodnoty, které umožní stratifikaci rizika. Nevýhodou je, že hladina plazmatického NGAL může být zároveň ovlivněna dalšími podmínkami, jako je hypertenze, systémová zánětlivá onemocnění, anémie, ischemie nebo malignity [23,29].

NGAL a kardiovaskulární onemocnění

V rámci kardiovaskulárních onemocnění může být více příčin a mechanizmů zvýšené hladiny NGAL a zároveň se jejich aktivita může uplatňovat na více místech.

U hypertoniků byla v porovnání s normotoniky zjištěna zvýšená hladina NGAL, která závisela především na funkci ledvin (vyjádřené glomerulární filtrací, hladinou kreatininu nebo cystatinu), věku a délce trvání hypertenze [29]. Ve skupině hypertoniků s aterosklerotickým postižením karotid byla prokázána korelace sérové hladiny NGAL s výší diastolického krevního tlaku a s věkem [30].

V rámci aterosklerotického postižení cév se NGAL může podílet na vaskulární remodelaci a nestabilitě aterosklerotických plátů. Přítomnost NGAL byla prokázána v cévní medii, a to jak ve své volné formě, tak i v komplexu s MMP-9. Jak bylo konstatováno výše, tvorbou komplexu s MMP-9 brání jeho degradaci a zároveň potencuje jeho proteolytickou aktivitu, která se může podílet na tvorbě nestabilního plátu. Tento komplex se nachází v aterosklerotických plátech a jeho zvýšená koncentrace byla detekována v plátech s intramurálním hematomem a centrální nekrózou [31–34]. Zvýšená hladina sérového NGAL byla prokázána u pacientů po akutní cerebrovaskulární příhodě (CMP, TIA) a přetrvávala až 1 rok [35].

Ke zvýšené expresi NGAL dochází i u pacientů s akutním infarktem myokardu. Lze jej považovat za aktivní mediátor postischemického zánětu a remodelační reakce. Jeho hladina v infarktové nekrotické zóně, ale i v okolní zdravé tkáni, je vyšší. Souběžně s tím narůstá ve srovnání se zdravými jedinci i jeho sérová hladina. Bylo zjištěno, že výrazně vyšší hladiny NGAL po IM predikují nepříznivý vývoj.

NGAL se zřejmě podílí na patogenezi srdečního selhání. Aktivace neutrofilů a následné uvolnění NGAL se účastní na rozvoji zánětlivé reakce v průběhu srdečního selhání. Remodelace levé komory, která vede k rozvoji a progresi srdečního selhání, je velmi složitý proces, jehož součástí jsou nejen změny kardiomyocytů, ale také změny v extracelulární matrix. A právě aktivované metaloproteinázy jsou velmi důležitým prostředníkem v tomto procesu. Yndestad et al ve své studii prokázali, že pacienti se srdečním selhání po IM, stejně jako pacienti s chronickým srdečním selháním jakékoli jiné etiologie, mají zvýšené sérové hladiny NGAL, které významně korelují s jejich klinickým stavem [36].

Význam cystatinu C a NGAL jako markeru poškození ledvin a prediktoru prognózy u pacientů s kardiovaskulárním onemocněním

Řada studií prokázala, že prostřednictvím stanovení sérové hladiny cystatinu C i NGAL je možné odhalit akutní poškození ledvin o 1,5–2 dny dříve než při sledování funkce ledvin podle sérové hladiny kreatininu. Ve srovnání s informacemi, které poskytuje kreatinin nebo odhadovaná GFR, zvýšení hladiny cystatinu C přináší u pacientů s kardio­vaskulárním onemocněním navíc informaci o prognóze těchto pacientů. Zvýšená hladina NGAL byla detekována u pacientů s akutním infarktem myokardu, srdečním selháním nebo po cévní mozkové příhodě. Dosud je málo dat o prognostickém významu zvýšené hodnoty NGAL u pacientů po akutním infarktu myokardu nebo pacientů se srdečním selháním. Zároveň chybí srovnání jednotlivých markerů mezi sebou a informace, zda stanovení těchto markerů přináší přídatnou prognostickou informaci v porovnání s prediktory prognózy, jako jsou natriuretické peptidy, ejekční frakce levé komory, hodnota kreatininu či přítomnost anémie.

Práce byla podpořena VVZ MŠMT 0021624202.

MUDr. Mgr. Jiří Pařenica, Ph.D.

www.fnbrno.cz

e-mail: jiri.parenica@atlas.cz

Doručeno do redakce: 1. 11. 2011

Přijato po recenzi: 27. 12. 2011