EML4-ALK fúzní gen u pacientů s plicním karcinomem: biologie, diagnostika a cílená terapie

Súhrn

Cílená terapie představuje v současné době jednu z možných léčebných strategií u plicních nádorů. Její vysoká účinnost spočívá ve specifické inhibici cílové struktury, která je abnormálně aktivovaná v nádorové buňce a hraje klíčovou roli v onkogenezi. EML4-ALK fúzní gen, který byl poprvé popsán před pěti lety u pacientů s adenokarcinomem plic, má prokazatelně onkogenní potenciál, a je proto vhodným kandidátem pro cílenou léčbu. Tato přestavba vzniká v důsledku paracentrické inverze na krátkém raménku chromozomu 2 a vyskytuje se u 3–5 % pacientů s nemalobuněčným karcinomem plic. Dále bylo identifikováno několik dalších genů, které mohou do fúze s genem ALK vstupovat: TGF, KIF5B a KLC1. Cílená inhibice konstitutivně aktivované ALK kinázy zprostředkovaná crizotinibem přinesla u pacientů pozitivních na přestavbu ALK genu výraznou léčebnou odpověď (57 %) s minimální toxicitou. Nicméně nedávno byla popsána ztráta odpovědi na léčbu crizotinibem v důsledku vzniku rezistentních mutací (C1156Y a L1196M) v kinázové doméně fúzního proteinu. Tím se otevírá prostor pro nové, vysoce specifické inhibitory, které budou schopné překonat rezistenci mutovaného EML4-ALK. Při výběru vhodných pacientů pro cílenou terapii hraje nezastupitelnou roli molekulární diagnostika, která nabízí pro detekci přestaveb genu ALK několik různých metodik. S identifikací nových genetických změn asociovaných se vznikem nádoru a vývojem nových molekulárních inhibitorů se léčba onkologických pacientů stále více posouvá k individualizované terapii.

Klíčová slova:
EML4-ALK fúzní protein – nemalobuněčný karcinom plic – molekulární diagnostika – molekulární cílená terapie – inhibitory proteinkináz – crizotinib

Úvod

Přes intenzivní úsilí o zdokonalení léčby a včasnou diagnostiku zůstává karcinom plic v důsledku vysoké incidence spojené s výraznou úmrtností v popředí zájmu nejen onkologů, ale též molekulárních biologů a farmaceutických firem. Snahou nových terapeutických přístupů je prodloužit přežívání pacientů s karcinomem plic, zkvalitnit jejich život a minimalizovat vedlejší účinky léčby. Vedle standardních léčebných protokolů, které se opírají o chemoterapii, radioterapii a chirurgickou resekci, získává stále více prostoru i tzv. cílená (někdy též biologická) léčba. Jak již z názvu vyplývá, tato terapie je zaměřena na konkrétní cílovou strukturu (nukleová kyselina, protein), která hraje klíčovou roli v onko­genezi, růstu nádoru či jeho metastazování. Inhibicí takového cíle může být nádorová buňka vrácena zpět do fyziologického stavu, případně v ní mohou být aktivovány procesy vedoucí k vlastní destrukci, tzv. programované buněčné smrti (apoptóze). Obecně tedy dochází v nádorové buňce k zablokování abnormálně aktivovaných procesů, jako jsou růst a dělení buňky, motilita a vaskularizace, či naopak jsou uvolněny proteiny/geny klíčové pro kontrolu buněčného cyklu a spuštění apoptózy. Podání cílené terapie mimo jiné vyžaduje molekulární diagnostiku pacienta, kdy je nutné potvrdit přítomnost aktivované struktury, která má být inhibována. Molekulární genetika má tedy nezastupitelnou roli nejen při hledání kandidátních genů/proteinů účastnících se onkogeneze, ale také následně při diagnostice a výběru vhodných pacientů pro konkrétní terapii. Proto se v odborné literatuře stále více setkáváme s termínem terapie šitá na míru (tzv. tailored therapy) či individualizovaná léčba.

Cílená léčba je v současné době u plicních nádorů již rutinně používána, a to při inhibici intracelulární kinázové domény receptoru pro epidermální růstový faktor (epidermal growth factor receptor – EGFR) pomocí tyrozinkinázových inhibitorů (TKI) gefitinibu (Iressa, Astra Zeneca, Velká Británie) a erlotinibu (Tarceva, Roche, Švýcarsko) [1–3]. Gefitinib je schválen pro pacienty s pokročilým nemalobuněčným karcinomem plic (non-small cell lung cancer – NSCLC), u nichž byla prokázána aktivační mutace v genu EGFR, neboť vykazují výraznou léčebnou odpověď v porovnání s pacienty s nemutovanou formou [4–7]. Studie dále potvrdily delší přežívání bez progrese (progression-free survival, PFS) u pacientů s mutovaným EGFR léčených v první linii gefitinibem oproti skupině pacientů, kterým byla podána standardní chemoterapie [5,8]. Druhým z TKI působícím na EGFR je erlotinib, který je nyní indikován u pokročilého NSCLC bez ohledu na mutační status EGFR. Nicméně nedávné studie prokázaly, že léčba pomocí erlotinibu v první linii přinesla pacientům s mutovaným EGFR delší PFS a omezila výskyt toxických účinků oproti standardní chemoterapii, a to jak u asijské [9], tak evropské populace [10]. Do budoucna lze tedy očekávat změnu v podávání erlotinibu, který tak bude určen pro léčbu pokročilého NSCLC v první linii u pacientů s mutovanou formou EGFR, podobně jako gefitinib. Vedle TKI zacílených na EGFR je u plicních nádorů dále schválen bevacizumab (Avastin, Roche, Švýcarsko), který tlumí abnormálně exprimovaný vaskulární endotelový růstový faktor (vascular endothelial growth factor – VEGF) [11]. Molekulární inhibitory mohou být podávány jak v monoterapii, tak i v kombinaci se standardní chemoterapií či radioterapií. Stále probíhají klinické studie, které u plicních karcinomů ověřují účinnost řady dalších preparátů z kategorie cílené terapie. Nově je také věnována pozornost vysoce efektivním inhibitorům, které působí na několik různých cílů současně (případně kombinacím několika různých inhibitorů), čímž dochází k utlumení více procesů či signálních kaskád najednou.

Fúzní gen EML4-ALK

V roce 2007 byla japonskými autory poprvé popsána fúze genu ALK (anaplastic lymphoma kinase) s genem EML4 (echinoderm microtubule associated protein like 4) u pacientů s NSCLC [12]. EML4 gen je lokalizován na krátkém raménku chromozomu 2 (2p21) a kóduje protein, který je směřován do cytoplazmy, kde hraje důležitou roli při správném uspořádání mikrotubulů. Nezastupitelná úloha EML4 proteinu při mitotickém dělení byla potvrzena in vitro experimenty, v nichž byl EML4 gen vyřazen z funkce pomocí siRNA inhibice, což ve výsledku vedlo k celkovému poklesu počtu buněk a nižšímu proliferačnímu indexu [13]. ALK gen se nachází na 2p23 a kóduje transmembránový receptor s tyrozinkinázovou aktivitou, který patří do superrodiny receptorů pro inzulin. Za fyziologických podmínek je ALK exprimován v neuronech specifických oblastí mozku (thalamus, střední mozek, čichový bulbus). Funkce tohoto proteinu u člověka není dosud známa, avšak předpokládá se jeho účast při diferenciaci nervových buněk vzhledem k jeho vysoké expresi v časné embryogenezi v nervovém systému [14]. Dále bylo prokázáno, že aktivace ALK kinázy, ať už v důsledku navázání ligandu, nebo patologické fúze, vede ke snížení apoptózy. Fúze genu ALK byla poprvé popsána u anaplastického velkobuněčného lymfomu (anaplastic large-cell lymphoma – ALCL), kde byl jako fúzní partner detekován gen NPM (nukleofosmin) [15]. Přestavby ALK genu jsou dále uváděny v souvislosti s inflamatorním myofibroblastickým tumorem [16], difuzním velkobuněčným B lymfomem [17] a nověji také u některých epiteliálních nádorů, jako jsou karcinomy ledviny [18], prsu a tlustého střeva [19] či NSCLC [12]. Nedávno byly u neuroblastomu detekovány amplifikace genu ALK či missence mutace v kinázové doméně vedoucí ke zvýšení kinázové aktivity proteinu [20]. Výše uvedené příklady poukazují na důležitou roli mutovaného genu ALK v onkogenezi solidních nádorů.

Geny EML4 a ALK jsou shodně lokalizovány na 2p, avšak leží v opačné orientaci a vzdálenost mezi nimi činí 12 mega­bází (Mb). Fúzní gen EML4-ALK je proto důsledkem malé paracentrické inverze inv(2)(p21p23). Ačkoli mohou vznikat různé varianty, vždy je součástí fúzního proteinu intracelulární kinázová doména proteinu ALK (tedy gen ALK je přítomen v rozsahu exonů 20–29). Naopak transmembránová a extracelulární doména pochází z genu EML4. Jeho amino-terminální zásaditá (basic) doména (izoelektrický bod při pH 10,2), obsažená ve všech fúzních variantách, poskytuje dle in vitro experimentů nově vzniklému proteinu dostatečný onkogenní potenciál [12]. Předpokládá se, že hraje důležitou roli při dimerizaci proteinu, a umožňuje tak autofosforylaci kinázových domén. EML4 bývá přítomen v různé délce, přičemž dosud detekované zlomy nastávají za exony 2, 6, 13, 14, 15, 17, 18 a 20 [12,21–24]. Přehledný výčet jednotlivých variant EML4-ALK proteinu včetně jejich poměrového zastoupení u NSCLC uvádí tab.  1. Varianta E13;A20 (písmena symbolizují názvy fúzujících genů, čísla označují příslušné exony), známá též pod názvem va­rianta 1, patří spolu s variantou E6a/b;A20 (varianta 3a/b) mezi nejčastěji detekované (33 % a 29 %) [23]. Gen EML4 není jediným fúzním partnerem ALK, který byl dosud u NSCLC popsán. V roce 2007 byla identifikována přestavba s genem TGF (transforming growth factor) [25], o dva roky později pak fúze s KIF5B (kinesin family member 5B) [26]. Nedávno byla u NSCLC objevena nová přestavba genu ALK, tentokrát s genem KLC1 (kinesin light chain 1) [27]. Existence různých variant fúzního genu EML4-ALK i různých partnerských genů, které mohou do fúze vstupovat, klade vysoké požadavky na detekční techniky. Tato problematika bude dále v textu detailně řešena.

Přestavba genu je jedním z hlavních mechanizmů, kterým buňka získá onkogenní charakter. Na základě in vitro a in vivo experimentů bylo opakovaně potvrzeno, že výše popsané genetické aberace na 2p, které postihují gen ALK, mají transformační potenciál [12,21,24]. Soda et al pokračovali dále v průkazu onkogenní transformace buněk vlivem EML4-ALK kinázy a připravili transgenní myši, které exprimují EML4-ALK fúzní gen přímo v epiteliálních buňkách plic, nikoli však v ostatních tkáních. U všech testovaných jedinců byla krátce po narození během několika týdnů potvrzena přítomnost adenokarcinomu v plicích na obou stranách [28].

V rozporu s výše uvedenými experimenty je hypotéza publikovaná ve studii Perner et al, která nepokládá přestavbu genu ALK za počáteční událost vedoucí k nádorové transformaci buňky [29]. Tento názor je podpořen výsledky cytogenetických analýz, kdy u pozitivních vzorků nebyl fúzní gen EML4-ALK (případně amplifikace ALK či EML4) detekován vždy ve všech nádorových buňkách, ale byl přítomen u 50–100 % nádorových buněk. Druhým, více pravděpodobným vysvětlením může být vlastní heterogenita nádoru, a tedy současná přítomnost několika různých klonů.

Dále bylo testováno, zda je EML4-ALK fúzní gen specifický pouze pro NSCLC, či zda je přítomen také u jiných nádorových onemocnění (akutní myeloidní leukemie, kolorektální karcinom, gastrointestinální karcinom, karcinom prsu, malobuněčný karcinom plic, non-Hodgkinovy lymfomy aj.). Ačkoli několik nezávislých studií potvrdilo, že EML4-ALK je vysoce specifický pro NSCLC [12,21,30], nedávno publikované výsledky dokládají, že se tento fúzní gen vyskytuje u karcinomů ledvin [18], kolorekta i prsu [19].

Klinicko-patologické charakteristiky pacientů s fúzním genem EML4-ALK

Přítomnost fúzního genu EML4-ALK byla poprvé popsána u 6,7 % (5/75) pacientů s NSCLC z Japonska [12]. Obdobné frekvence bylo dosaženo i v dalších studiích, v nichž byl fúzní gen detekován u < 8 % pacientů s NSCLC [22,29,31–34]. Tato z molekulárně-genetického hlediska jasně vymezená skupina má i své klinické charakteristiky: adenokarcinom [21,22,31] a absence kouření, případně slabé kouření v minulosti (≤ 10 balíčků cigaret/rok a ukončené kouření před ≥ 1 rokem) [12,23]. Výše uvedená kritéria však charakterizují také pacienty, kteří ve svém genomu nesou aktivační mutace v genu EGFR a jsou vhodnými kandidáty pro terapii gefitinibem. Nicméně studie Shaw et al poukázala na zjevný věkový rozdíl mezi skupinou pacientů s přestavbou ALK a pacientů s aktivačními mutacemi v EGFR (věkový průměr 52 let vs 66 let) [35]. Dále bylo pozorováno, že přítomnost fúzního genu EML4-ALK se vylučuje s aktivačními mutacemi v genech EGFR a KRAS, čímž vzniká v rámci NSCLC nová, samostatná podskupina pacientů [12,31,33,35]. Nicméně byly popsány i výjimky, které jsou v rozporu s výše uvedenými klinickými charakteristikami: skvamózní abronchio-­alveolární karcinom [12,35], pacient silný kuřák ve věku 76 let [33] či současný výskyt fúzního genu s aktivační mutací v KRAS (G12C) [32] nebo v EGFR (2235-2249 del15 v exonu 19) [36]. Některé práce pak upozorňují i na další kritéria, jako jsou vyšší stadium onemocnění a histologický nález solidního karcinomu s prstenčitými buňkami (signet--ring cells) [33,35].

Diagnostické testy pro detekci přestaveb genu ALK

Ačkoli jsou přestavby genu ALK známy již několik let, nebyla dosud stanovena žádná diagnostická metoda, která by sloužila jako zlatý standard. Přehled v současné době nejvíce používaných metodických postupů používaných u NSCLC nabízejí následující odstavce.

FISH

Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) využívá pro detekci inv(2)(p21p23) tzv. break-apart sondy. Ty jsou navrženy do 3´konce ALK a jeho centromerické oblasti a jsou značeny odlišnými fluorescenčními barvami (červenou a zelenou). V případě, že je ve vyšetřovaném materiálu gen ALK neporušen, je v mikroskopu patrný žlutý signál, neboť obě próby se nacházejí v těsné blízkosti a jejich fluorescence se překrývá. Pokud však nastal zlom v genu ALK a v důsledku inverze došlo k prostorovému rozdělení genu, tedy i míst pro hybridizaci sond, bude signál z každé próby detekován samostatně (zvlášť červený a zelený) [33,35,37,38]. Další, méně po­užívanou variantu FISH (tzv. fussion assay) představuje hybridizace fluorescenčně značených prób v podobě umělých bakteriálních chromozomů (bacterial arteficial chromosomes – BAC), které obsahují DNA sekvence odpovídající genům ALK a EML4 [22,24]. I v tomto případě jsou próby značeny fluorescenčními barvami s odlišným emisním spektrem: ALK (červená barva), EML4 (zelená barva). Jsou-li barevné signály v mikroskopu separované, jedná se o nemutovaný vzorek, neboť za fyziologických podmínek leží mezi oběma geny 12Mb DNA. Pokud však dochází k jejich překryvu, je zřejmé, že nastala paracentrická inverze vedoucí ke vzniku EML4-ALK. Pozitivita ALK+ na základě FISH je stanovena, pokud je ve vyšetřovaném vzorku detekováno >15 % pozitivních nádorových buněk ze všech hodnocených (zpravidla ze 100 buněk) [33,35,37,38]. Výsledky FISH analýz opakovaně potvrdily, že kromě přestaveb genu ALK dochází také k nárůstu počtu kopií genů ALK a EML4 či k amplifikaci celé oblasti zahrnující 2p21 a 2p23 [29,37].

Výhodou FISH při použití break-apart prób je schopnost detekovat všechny možné přestavby genu ALK, tedy nejen ty, do nichž vstupuje jako partner EML4. Na druhou stranu však nedokáže rozlišit mezi jednotlivými variantami daného fúzního genu či určit konkrétního fúzního partnera. Dále FISH umožňuje pracovat s archivními vzorky ve formě parafinových bločků, v nichž je tkáň fixována formalinem (formaline fixed paraffin embedded – FFPE). Tento materiál není naopak příliš vhodný pro jiné metody, které jsou citlivé na kvalitu nukleových kyselin. V důsledku fixace formalinem jsou totiž vodíkové vazby v nukleových kyselinách narušeny, dochází k dezintegraci dvouvláknových struktur, čímž je celkově snížena jejich stabilita, a mohou vznikat kovalentní vazby mezi bázemi nukleových kyselin a formaldehydem. Za účelem standardizace protokolu je jistě výhodou i komerční dostupnost ALK break-apart prób v podobě diagnostických souprav (Vysis ALK Break Apart FISH ProbeKit, Abbott Molecular, USA). Úskalí FISH při detekci EML4-ALK fúze spočívá v jejím hodnocení, neboť inverze postihuje relativně krátký úsek DNA (12Mb) a separace fluorescenčních signálů sond nemusí být vždy zcela zřetelná. Vzorek může být pak chybně označen jako negativní, ačkoli jiné metody poskytnou jednoznačně pozitivní výsledek [33].

RT-PCR a jiné PCR techniky

Reverzní transkripce (RT) s následnou amplifikací pomocí polymerázové řetězové reakce (polymerase chain reaction – PCR) představuje rychlou a velmi citlivou metodu pro detekci fúzních genů. Templátem pro RT je RNA, která je reverzní transkriptázou přepisována do komplementární DNA (cDNA), a ta posléze slouží jako vstupní materiál pro vlastní amplifikaci. cDNA oproti DNA neobsahuje introny, ale pouze kódující sekvence (exony), a tak celý fúzní gen dosahuje velikosti pouze několika set bází, a proto může být pomocí této metody testován. Jelikož se geny EML4 a ALK nacházejí na 2p v opačné orientaci, je zřejmé, že primery navržené pro RT-PCR neposkytnou žádný specifický produkt, bude-li templátem RNA bez fúzního genu. Jak bylo zmíněno výše, EML4-ALK existuje v několika různých variantách, proto musí PCR probíhat jako multiplex, tj. s několika sadami vhodných párů primerů, nebo v několika samostatných reakcích, tak aby byly všechny varianty potenciálně zachytitelné [21,22,34]. Maximální efektivnosti lze pak dosáhnout metodou skenování exonů (exon scanning), kdy pro prvních 22 exonů genu EML4, které mohou vstupovat do fúze, je navržen vždy jeden primer, přičemž druhý primer lokalizovaný v genu ALK je pro všechny reakce univerzální [39]. Pro vlastní detekci amplifikovaných fragmentů slouží gelová elektroforéza, ať už v podobě agarózových gelů, nebo s využitím přístroje Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, USA). Je-li jeden z primerů značen fluorescenční barvou, lze produkty amplifikace separovat s vyšší přesností pomocí kapilární elektroforézy [39]. Na základě velikosti PCR produktů je dále možné rozlišit jednotlivé varianty fúzního genu, případně detekovat nové, dosud nepublikované va­rianty. Vzhledem k možnosti kontaminace je nutné pozitivní výsledek vždy potvrdit nezávislou metodou, např. přímým sekvenováním.

Nevýhodou RT-PCR je skutečnost, že vycházíme z předem navržených krátkých sekvencí DNA (oligonukleotidových primerů), které vymezují úsek RNA/cDNA pro vlastní analýzu fúzního genu. Další úskalí této metody představuje vlastní manipulace s RNA, která s sebou přináší vysoké nároky na kvalitu materiálu a jeho zpracování (RNA snáze podléhá degradaci v porovnání s DNA). Tento problém je obzvláště těžko řešitelný, neboť většina bioptických vzorků se uchovává ve formě FFPE. RNA extrahovaná z fixovaného materiálu je silně degradovaná v porovnání s RNA izolovanou z nativní tkáně (tyto materiály jsou v analýze proto více upřednostňovány). Oproti ostatním technikám dosahuje RT-PCR vysoké citlivosti, a proto je vhodná i v situacích, kdy je v materiálu nízké zastoupení nádorových buněk nebo klon nesoucí přestavbu genu ALK představuje v nádoru minoritní populaci. V současné době lze diagnostikovat EML4-ALK fúzní varianty na bázi RT-PCR pomocí komerčního setu vyvinutého společností Response Genetics (USA).

Vedle běžné PCR, která navazuje na RT, je možné pro detekci genu EML4-ALK použít amplifikaci v reálném čase (tzv. real-time PCR) s využitím specifických fluorescenčních sond pro detekci. Technologii real-time PCR využívá např. AmoyDx EML4-ALK fusion gene detec­tion kit (Amoy Diagnostics, Čína) či firmy Applied Biosystems Life Technologies (USA) a Lab21 (USA).

PCR techniky s následnou sekvenací mají svou nezastupitelnou roli při hledání konkrétních zlomových míst v intronech fúzovaných genů nebo při identifikaci nových fúzních variant. Dále je lze využít pro určení fúzních partnerů genu ALK v situacích, kdy FISH či imuno­histochemie prokážou pozitivitu, avšak RT-PCR navržená pro EML4-ALK fúzi podá negativní výsledek. RT-PCR je pro tyto účely, kdy známe pro amplifikaci pouze část sekvence pocházející z genu ALK, modifikována a probíhá jako RACE-PCR (rapid amplification of cDNA ends) [18,27,36] nebo inverzní PCR [26].

IHC

Imunohistochemie (IHC) je rutinně po­užívanou technikou v laboratořích ústavů patologie, a proto by mohla být vhodnou screeningovou metodou pro detekci EML4-ALK proteinu. Princip IHC spočívá v detekci cílového proteinu na FFPE řezech pomocí specifické protilátky. Základním předpokladem je fakt, že v buňkách karcinomu plic je detekovatelná exprese kinázy ALK pouze v případě, že dochází k přestavbě genu ALK. Ačkoli je na trhu k dispozici několik IHC testů pro stanovení ALK+ u ALCL, jejich použití se ukázalo jako nevhodné pro vzorky NSCLC. Srovnávací analýza 10 ALK+ vzorků identifikovaných na základě FISH poukázala na nedostatečnou citlivost (4/10 pozitivních) použité protilátky ALK1 (Dako, Glostrup, Dánsko). Ani modifikace protokolu ve smyslu amplifikace signálu, která přinesla jisté zlepšení, nebyla však dostačující (8/10 pozitivních) [33]. Další porovnání metodik FISH a IHC (opět s protilátkou ALK1) ukázalo obdobné výsledky: senzitivita 90 % a specificita 97,8 % [38]. Důvodem tohoto neúspěchu je nižší hladina exprese proteinu ALK u plicních nádorů pozitivních na přestavbu genu ALK v porovnání s úrovní exprese ALK u ALCL [40]. Nicméně nedávno publikovaná studie, která používá novou monoklonální protilátku D5F3 (Cell Signaling Technology, Inc., USA) vážící se s vysokou specificitou na ALK, dokládá, že IHC může být u NSCLC vysoce citlivou metodou rutinně užívanou pro diagnostiku přestaveb genu ALK [40]. Ve sporných případech, kdy je barvení slabé či lokální, by jako konfirmační metoda mohla posloužit FISH či RT-PCR.

ALK cílená terapie

Řada experimentů prokázala, že kináza EML4-ALK působí u NSCLC onkogenně, a proto představuje vhodnou strukturu pro cílenou léčbu pomocí kinázových inhibitorů na bázi malých molekul. Účinnost ALK inhibitorů (WHI-P154, TAE684, PF-02341066) byla v prvé řadě ověřena pokusy in vitro, přičemž došlo k omezení růstu buněk exprimujících EML4-ALK a poklesu úrovně fosforylace kinázy ALK [12,22,41]. Navazující in vivo testy prokázaly jednoznačný léčebný efekt ALK inhibitorů, neboť u EML4-ALK transgenních myší došlo k omezení růstu nádoru, a dokonce i k jeho regresi [22,28,41].

Dosud postoupil do klinických studií jediný preparát, a tím je crizotinib (PF-02341066, Pfizer, USA). Jedná se o kompetitivní kinázový inhibitor, který se váže do ATP vazebného místa kinázy ALK. Tím je znemožněna vazba ATP, a proto nemůže dojít k autofosforylaci kinázových domén. Crizotinib byl původně představen jako inhibitor kinázy MET, teprve dodatečně byla zjištěna také jeho účinnost při tlumení kinázové aktivity ALK. První klinická studie u pacientů s NSCLC pozitivních na přestavbu genu ALK přinesla velmi povzbudivé výsledky: z 82 pacientů vykázalo 57 % částečnou nebo kompletní léčebnou odpověď a u dalších 33 % pacientů bylo onemocnění vyhodnoceno jako stabilní [42]. Crizotinib (při dávce 250 mg 2× denně) byl dobře tolerován s minimem vedlejších účinků, které, pokud se vyskytly, byly převážně gastrointestinální povahy. V současné době probíhá randomizovaná klinická studie třetí fáze, v níž je porovnávána účinnost a bezpečnost léčby crizotinibem s konvenční chemoterapií (pemetrexed či docetaxel). Bezpečnost a protinádorová aktivita u pacientů s pokročilým NSCLC bude dále hodnocena v připravované klinické studii druhé fáze.

Ačkoli byla zaznamenána výrazná léčebná odpověď na podávání crizotinibu u EML4-ALK pozitivních pacientů, úspěšnost léčby nemusí mít trvalý charakter. Podobně jako při užití TKI cílených na EGFR [43], může se i v tomto případě vyvinout rezistence [44]. Po úspěšné pětimě­síční terapii crizotinibem byl u EML4-ALK pozitivního pacienta s plicním adenokarcinomem pozorován opětovný růst nádoru a zmnožení pleurálního výpotku. Molekulární analýza odhalila přítomnost dvou de novo mutací v genu ALK, které jsou příčinou vzniku substitucí C1156Y a L1196M lokalizovaných v kinázové doméně. In vitro experimenty jednoznačně prokázaly vliv obou mutací na pokles citlivosti vůči crizotinibu. Leucin v pozici 1196 utváří za fyziologických podmínek dno ATP vazebného místa, a proto záměna za metionin s objemným postranním řetězcem (při mutaci L1196M) může přímo bránit ve vazbě ALK inhibitoru. Substituce L1196M koresponduje pozičně se záměnou T790M v EGFR u pacientů s NSCLC způsobující obdobně rezistenci vůči erlotinibu či gefitinibu. Proto byly v preklinických studiích představeny nové preparáty cílené na ALK kinázu (NVP-TAE684, AP26113 [45] a CH5424802 [46]), které dokážou překonat rezistenci na podkladě mutace L1196M.

Závěr

EML4-ALK fúzní gen reprezentuje u NSCLC další z genetických markerů, a definuje tak konkrétní skupinu pacientů vhodných pro léčbu pomocí inhibitorů ALK kinázy. Jelikož jsou přestavby genu ALK u NSCLC relativně vzácné (cca 3–5 %), je možné pacienty selektovat na základě klinicko-patologických charakteristik (adenokarcinom, lehký kuřák či nekuřák), a obohatit tak vyšetřovaný vzorek pacientů před vlastním diagnostickým testem. Vzhledem k absenci mutací v genech EGFR a KRAS je dále možné vyšetřovat fúze ALK genu pouze u pacientů s nemutovanou variantou genů EGFR a KRAS. Úspěšná identifikace onkogenních příčin plicního karcinomu spolu s vývojem cílených inhibitorů umožňuje individualizovaný přístup v léčbě spojený s výrazným zlepšením kvality života a delším přežíváním pacientů.

Poděkování

Ráda bych poděkovala paní Ing. Daně Dvořákové, CSc., za kritické přečtení textu a cenné připomínky.

Mgr. Alžběta Vašíková, Ph.D.

Centrum molekulární biologie a genové terapie

Interní hematologická a onkologickáklinika LF MU a FN Brno

Černopolní 9

625 00 Brno

e-mail: alzbeta. vasikova@fnbrno. cz

Obdrženo: 16. 4. 2012

Přijato: 5. 6. 2012