Glykoproteiny v sérech onkologických pa­cientů

Súhrn

Východiska: Glykosylace je posttranslační modifikace, která je zapojena do mnoha bio­logických procesů a významně zasahuje i do dějů spojených s nádorovou progresí. Změny glykanových struktur na povrchu nádorových buněk způsobené alterujícími hladinami exprese glykosyltransferáz a glykosidáz ovlivňují proliferaci, adhezi, migraci i buněčnou signalizaci. Přítomnost neobvyklých glykanových struktur a glykokonjugátů v sérech byla popsána u mnohých onkologických onemocnění a řada glykoproteinů byla schválena Úřadem pro kontrolu potravin a léčiv v USA jako nádorové bio­markery pro klinická vyšetření. V současnosti se pozornost při hledání nových glykomarkerů zaměřuje na detekci proteinů s aberantní glykosylací nebo zvýšenou koncentrací v sérech nebo exozomech, a to z důvodu jejich aktivní sekrece nebo uvolňování z nádorových buněk do extracelulárního prostoru.

Cíl: Cílem článku bylo popsat strukturu glykanů, glykoproteinů i glykokonjugátů a přiblížit jejich funkci ve vývoji a progresi nádorů. Dalším cílem bylo čtenáře seznámit s vybranými klinicky schválenými glykoproteiny využívanými k dia­gnostice onkologických onemocnění (AFP, PSA, CA 125, HE4). Pozornost byla zaměřena na změny v glykanové struktuře uvedených proteinů, jejich funkce, koncentrace v sérech a jejich využití v klinice a dia­gnostice onkologických onemocnění.

Klíčová slova:

glykoproteiny – sérum – bio­markery – nádor

Struktura a funkce glykanů ve vývoji a progresi nádorů

Glykany jsou sacharidové jednotky (oligosacharidy a polysacharidy) vyskytující se volně nebo kovalentně vázané na bio­molekuly (protein či lipid, nazývané pak glykokonjugáty). Glykanová složka může ovlivnit funkci glykokonjugátů přímo, a to bezprostřední účastí na interakcích s ostatními bio­molekulami, nebo nepřímo zapojením do mechanizmů kontrolujících konformaci, stabilitu a životnost proteinu [1– 3]. Přehled glykanů a glykokonjugátů zapojených do nádorové progrese je uveden na obr. 1.

Funkce N-glykoproteinů závisí na počtu a složení glykanových částí navázaných na polypeptidový řetězec a na větvení glykanové části, přičemž abnormální struktury ovlivňují vývoj a progresi nádorů (obr. 2). Bylo publikováno mnoho prací zabývajících se N-glykanovým profilováním sér, tkání, ascitových tekutin nebo moče pa­cientů s nádorovým onemocněním. Výsledky upozornily na komplexní nebo naopak na velmi jednoduché (paucinomanózní) [4] glykanové struktury, typické pro dané onemocnění či molekulární podskupinu nádoru, jejichž výskyt koreloval s odpovědí na léčbu [5– 9]. Mezi O-glykoproteiny patří muciny, které se vyskytují ve větším množství na povrchu nádorových buněk a podílejí se na adhezi buněk podobně jako proteoglykany. Ty se dále účastní aktivace růstových faktorů. Výskyt glykosfingolipidů zase koreluje s růstem nádorů. Glykokonjugáty a glykany se kromě povrchu buněk vyskytují také intracelulárně anebo naopak extracelulárně jako sekretované molekuly, které jsou součástí extracelulární matrix. Odlišně lokalizované glykany plní různé funkce, např. ovlivňují buněčnou signalizaci, účastní se zánětlivých procesů, deregulují buněčný cyklus, podporují proliferaci, migraci nebo se aktivně účastní mezibuněčných interakcí [1,10,11]. Jsou tedy důležitou součástí mnoha bio­logických procesů, a proto je řada z nich považována za bio­markery [12].

Ně­kte­ré typy glykanů vyskytující se na povrchu nádorových buněk mohou zasahovat i do procesů spojených s nádorovou progresí (obr. 2). Přítomnost glykoproteinů společně s dalšími látkami (proteiny, lipidy, enzymy atd.) byla také zaznamenána v exozomech (extracelulárních váčcích nesoucích transferinový receptor) produkovaných ve větším množství nádorovými buňkami než buňkami normálními [13]. Exozomy zajišťují výměnu informací a látek mezi buňkami, mohou modifikovat lokální i vzdálené mikroprostředí, ovlivňují vývoj metastáz i vývoj imunitní odpovědi. Látky přítomné v exozomech jsou velmi lákavým cílem pro využití v dia­gnostice, prognostice i léčbě onkologických onemocnění [13,14], např. u karcinomu slinivky břišní [15] nebo u epiteliálního karcinomu vaječníků [16].

Dia­gnostický potenciál glykosyltransferáz

Glykosyltransferázy jsou enzymy zajišťující přenos a vazbu monosacharidu na glykan prostřednictvím různých typů glykosidických vazeb (např. galaktoglykosyltransferáza přenáší galaktózu). Glykosidázy naopak tyto vazby štěpí. U onkologických onemocnění byly zaznamenány snížené i zvýšené koncentrace přirozeně se vyskytujících sacharidů nebo byly detekovány sacharidy nové. Tyto změny jsou způsobeny právě změněnými hladinami glykosyltransferáz v Golgiho aparátu nádorových buněk [17] a vedou k modifikacím glykanových částí N- a O-glykoproteinů. Jednu z nejčastějších změn představuje netypické větvení N-glykanů i nárůst velikosti glykanové části způsobené zvýšenou produkcí sialyltransferáz, které připojují terminální molekuly sialových kyselin, nebo fukosyltransferáz způsobujících fukosylaci glykanů v jejich různých částech (obr. 3A) [18]. Sialové kyseliny mohou být přítomny ve vazbě alfa (2,3) nebo alfa (2,6), a tím vytvořit dva izomery, které mají naprosto rozdílnou bio­logickou aktivitu [19]. Tyto jevy obecně korelují s vývojem nádoru, pokročilým stadiem rakoviny a metastazováním. Objevují se však také u chronických zánětů, které s výskytem nádoru souvisejí [8]. Profilování genové exprese 210 glykosyltransferáz v 1 893 vzorcích pa­cientů se šesti typy karcinomů (prsu, vaječníků, glioblastomu, ledvin, plic a tlustého střeva) bylo použito k vývoji klasifikace karcinomů i jejich rozdělení do podskupin. Aplikací bio­statistických metod na kvantitativní hodnoty exprese genů kódujících glykosyltransferázy bylo možné identifikovat jednotlivé typy karcinomů a provést jejich subtypovou klasifikaci [12].

K progresi nádoru přispívají též glykosyltransferázy, které jsou zodpovědné za změny struktury N-glykanů, a tím i jejich funkce (obr. 3B) [20]. Jedná se o β1,4-N-acetylglukosaminyl transferázu (GnT-III), β1,6-N-acetylglukosaminyl transferázu (GnT-V) a α1,6-fukosyl transferázu (FUT8). GnT-III dává vznik bisektinové vazbě, při níž se objevuje třetí větev v terminální části glykanu. Tato struktura zabraňuje dalšímu procesu glykosylace, protože ztrácí vlastnosti substrátu pro další glykosyltransferázy. GnT-III je považována za enzym nezbytný v bio­syntetické dráze N-glykanů, který inhibuje metastazování [21]. Naopak GnT-V je zodpovědná za vznik rozvětvených glykanových struktur a její zvýšená exprese se projevuje sníženou buněčnou adhezí a zvýšenou invazivitou buněk metastazujících karcinomů tlustého střeva, mozku a prsu [21– 24]. Glykany nesoucí β1,6-N-acetylglukosamin jsou považovány za bio­markery progrese karcinomu tlustého střeva a prsu. FUT8 zajišťuje transfer fukózy na první N-acetylglukosamin (GlcNAc) u glykosidické vazby na asparagin (popisovaná jako fukosylace na jádře glykanu). Zvýšená exprese FUT8 přímo koreluje s velikostí nádoru [25] a naopak odstranění fukosylace na jádře glykanu přítomného v molekule IgG1 zvyšuje až 100krát buněčnou cytotoxicitu závislou na protilátkách [26].

Klinicky schválené bio­markery

Glykoproteiny a glykany jsou specifickými bio­markery onkologických onemocnění. Lze je nalézt v tkáních, séru, exozomech, moči nebo jiných tělních tekutinách, nejčastěji se však setkáváme s detekcí glykoproteinů nebo glykanů přítomných v sérech. Přehled vybraných glykoproteinů přítomných v sérech schválených Úřadem pro kontrolu potravin a léčiv v USA a používaných jako nádorové bio­markery je uveden v tab. 1.

Biomarkery detekovatelné v sérech jsou sloučeniny jinak přítomné v nádorech nebo jimi produkované a uvolněné do krevního řečiště, které slouží k odlišení patologických změn organizmu od fyziologických. I když je v současnosti známo mnoho nádorových bio­markerů, vzhledem k vysoké heterogenitě a širokému spektru nádorů zatím neexistuje univerzální marker, který by byl schopen jasně určit dané onkologické onemocnění, jeho prognózu nebo předpovědět úspěšnost léčby. Fyziologické koncentrace nádorových markerů se mohou vyskytnout i u maligních onemocnění, a proto je mnoho vědeckých pracovišť zaměřeno na výzkum úlohy glykosylace v nádorové patogenezi a pochopení dějů při vývoji a progresi nádorů. Zde uvádíme popis vybraných bio­markerů, další jsou popsány v dokumentu Valíka et al [27].

α-fetoprotein

Přítomnost onkofetálního α-fetoproteinu (AFP) v séru lidského plodu byla poprvé zmíněna v roce 1956 [28], jeho hladina je standardně vysoká v embryonálním žloutkovém vaku a fetálních játrech. Syntéza AFP významně klesá po porodu a v dospělých játrech se tvoří jen ve stopovém množství. V séru dospělých zdravých jedinců se koncentrace volného sérového AFP pohybuje pod 10 μg/ l a zvýšená koncentrace AFP v séru je charakteristická pro většinu hepatocelulárních karcinomů, hepato­blastomů, karcinom slinivky břišní a gastrointestinálního traktu nebo karcinom mozku [30]. AFP je protein s jedním N-glykanem s komplexní dvouantenární strukturou, alterující terminální sialylací a fukosylací v jádře a jeho velikost je přibližně 70 kDa (obr. 4) [29,31]. Zvýšená fukosylace AFP může korelovat s progresí hepatocelulárního karcinomu [32].

Prostatický specifický antigen

Prostatický specifický antigen (PSA) je bio­marker využívaný pro detekci karcinomu prostaty u mužů. Vyskytuje se v perianálních a periuretrálních žlázách a močovém měchýři. Jedná se o serinovou proteázu syntetizovanou epitelem acinů a výstelkou duktů prostaty. Koncentrace volné i vázané formy PSA se u zdravého jedince pohybuje pod 4 μg/ l. Zvýšená koncentrace PSA v krevním oběhu indikuje porušení mikrostruktury prostaty a průnik z acinů a duktů do kapilár. Rostoucí koncentrace PSA v séru koreluje s velikostí a stage tumoru, přičemž koncentrace nad 30 μg/ l indikuje přítomnost vzdálených metastáz [33]. PSA je glykoprotein s jednou N-glykanovou strukturou (jeho velikost je 28,4 kDa), který je dále dělen do glykosylovaných a neglykosylovaných podskupin [34]. Glykanová část se vyskytuje v různých alterujících strukturách (fukosylace a/ nebo sialylace), které jsou charakteristické pro pa­cienty s karcinomem prostaty [35– 37].

Nádorový antigen CA 125

CA 125 (MUC 16) byl poprvé popsán jako bio­marker detekovaný monoklonální protilátkou vyvinutou proti buněčné linii OVCA 433 odvozené od karcinomu vaječníků [38]. Koncentrace CA 125 v séru pohybující se nad 35 kU/ l může indikovat přítomnost karcinomu vaječníků, dělohy, endometria, slinivky břišní, trávicího ústrojí nebo prsu. Vyšetření hladiny CA 125 se však využívá hlavně pro dia­gnostiku karcinomu vaječníků a je vždy vhodné jej doplnit např. stanovením hladiny karcinoembryonálního antigenu a tkáňového polypeptidického antigenu. CA 125 patří do skupiny mucinózních glykoproteinů lokalizovaných na vnější membráně buněk, je tvořen opakujícími se peptidovými epitopy mucinu MUC 16 [39,40] s přítomností O- i N-glykosylace. Jeho molekulová hmotnost v nativním stavu je vyšší než 2 miliony Da. CA 125 urychluje proliferaci nádorových buněk a potlačuje protinádorovou imunitní odpověď [41,42].

Zvýšená hladina CA 125 nad fyziologickou hodnotu (35 kU/ l) může indikovat přítomnost peritoneálních metastáz karcinomu vaječníků [43].

Lidský epididymální protein 4 

Lidský epidydimální protein 4 (HE4) se nachází v epiteliálních buňkách epididymis a ženském reprodukčním traktu. Fyziologické hodnoty HE4 v séru se pohybují v rozmezí 50– 80 pmol/ l, a to v závislosti na stáří ženy (před a po menopauze). Funkce proteinu doposud nebyla popsána. Bylo však zjištěno, že jeho nadprodukce, a tedy zvýšená koncentrace v sérech pa­cientek se objevuje jednak v přítomnosti serózních a endometroidních nádorů vaječníků [44], dále pak u adenokarcinomů plic a endometria [45,46]. HE4 je označován za sérový bio­marker epiteliálního karcinomu vaječníků a vykazuje jako jeden z mála bio­markerů vysokou specificitu v časných stadiích tohoto onemocnění (stadium I/ II). Ve srovnání s CA 125 poskytuje větší specificitu v rozlišení benigních a maligních karcinomů. Doporučuje se též použít hodnoty koncentrací obou markerů (HE4 a CA 125) k výpočtu ROMA (risk of ovarian malignancy algorithm) skóre, které udává pravděpodobnost přítomnosti epitelového karcinomu vaječníků, pokud je pomocí zobrazovací metody nalezena abnormalita v oblasti vaječníků. Úspěšnost správné klasifikace rizika epiteliálního karcinomu vaječníků byla tímto přístupem stanovena na 93,8 % [47]. HE4 je sekretovaný nízkomolekulární N-glykoprotein [44], avšak jeho glykanová struktura zatím nebyla podrobně popsána.

Závěr

Dosavadní klinicky používané nádorové bio­markery [27] fungují velmi dobře u pa­cientů s rozvinutým onkologickým onemocněním. Je však třeba nalézt sady dalších bio­markerů, které by byly: 1) dostatečně senzitivní (schopné rozpoznat dané onemocnění); 2) charakteristické pro časná stadia onemocnění; 3) specifické (dostatečně odlišující onkologicky nemocného člověka od zdravého nebo trpícího jinými zdravotními problémy). V poslední době se objevilo mnoho prací popisujících moderní a efektivní metodické přístupy umožňující detekci glykosylačních změn na glykoproteinech přítomných v sérech. Glykoproteiny tedy představují atraktivní cíle při hledání bio­markerů v séru či exozomech z důvodu jejich aktivní sekrece, úniku nebo transportu ve vezikulách z nádorových buněk do extracelulárního prostoru [13,14,28]. Cílem přístupů je analyzovat nejenom glykoproteiny vyskytující se ve vysokých koncentracích (nad 1 g/ l), ale také ty se střední a nízkou koncentrací (pod 1 g/ l), které mohou představovat nové bio­markery. Mezi takové patří lektinová afinitní chromatografie [48], ELISA využívající vazbu lektinů [49,50] nebo rychle se rozvíjející hmotnostně spektrometrické techniky společně s bio­informatickými nástroji [51– 53]. To vše vede nejen k detekci změn koncentrací glykoproteinů i jejich glykoforem přítomných v sérech v nízkých koncentracích, ale také k detailnímu popisu změn glykanových částí, které se mění v závislosti na vzniku a progresi nádorů [54].

Práce byla podpořena projekty MŠMT – NPU I – LO1413, MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209805) a GAČR 16-04496S.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do bi omedicínských časopisů.

prof. Ing. Lenka Hernychová, Ph.D.

Regionální centrum aplikované molekulární onkologie

Masarykův onkologický ústav

Žlutý kopec 7

656 53 Brno

e-mail: lenka.hernychova@mou.cz

Obdrženo/Submitted: 17. 6. 2019

Přijato/Accepted: 19. 8. 2019