Endoteliální dysfunkce u dětí s Crohnovou chorobou – kombinovaný diagnostický přístup

Súhrn

Idiopatické střevní záněty jsou spojené s vyšším rizikem kardiovaskulárních onemocnění v dospělosti, literární údaje, zahrnující dětskou populaci, jsou však dosud sporadické. Cílem naší prospektivní studie byla detekce endoteliální dysfunkce (ED) pomocí reaktivního hyperemického indexu (RHI) a biochemických parametrů u rizikové skupiny dětí s Crohnovou chorobou (CD).

Do výzkumné studie bylo zařazeno celkem 21 pacientů s CD a 12 zdravých jedinců kontrolní skupiny. Diagnóza CD byla založena na klinických, endoskopických a histologických kritériích, zahrnujících pediatrický index aktivity Crohnovy choroby (PCDAI). ED byla hodnocena pomocí pletyzmografického měření reaktivního hyperemického indexu (RHI) a vybraných biochemických parametrů.

Nalezli jsme signifikantně nižší hodnotu RHI u pacientů s CD oproti kontrolnímu souboru (p <0,05). Současně byly v souboru pacientů s CD nalezeny signifikantně zvýšené hodnoty E-selektinu (p <0,05), asymetrického dimetylargininu (p <0,01) a vysoce senzitivního CRP (p <0,05).

Závěry naší studie ukazují, že CD může být spojena s ED a tedy vyšším rizikem rozvoje předčasné aterosklerózy. Zároveň ukazují na vhodnost využití kombinace měření RHI a biochemických markerů pro detekci ED a následné hodnocení kardiovaskulárního rizika pacientů s CD v dlouhodobém časovém horizontu.

Klíčová slova:
endoteliální dysfunkce, děti, reaktivní hyperemický index, asymetrický dimetylarginin, Crohnova choroba

Úvod

Endoteliální dysfunkce (ED) hraje důležitou roli v rozvoji předčasné aterosklerózy, hypertenze a srdečního selhání [7]. Crohnova choroba (CD) a ulcerózní kolitida (UC) představují dvě hlavní formy idiopatických střevních zánětů (ISZ), u nichž však současné znalosti o etiopatogenezi nejsou dostatečné. Současné pojetí CD chápe její vznik jako poruchu, kdy dochází k abnormální slizniční imunitní odpovědi na běžnou střevní mikroflóru u predisponovaných jedinců [1]. Výzkum ukazuje, že endoteliální výstelka hraje klíčovou roli ve vývoji nekontrolovaného chronického zánětu [2]. Dysfunkční endotel vede ke zvýšené produkci prozánětlivých cytokinů, vazoadhezivních a protrombogenních molekul majících za následek poškození cévní stěny [3, 4]. Rozhodující roli hraje snížená dostupnost endoteliálního oxidu dusnatého (NO) vedoucí k poruše vazodilatace. Klinicky je ED nejčastěji popisována jako snížená schopnost odpovědi cévní stěny na příslušný podnět.

Nejnovější studie u dospělé populace poukazují na zvýšené riziko vzniku ischemické choroby srdeční u pacientů s ISZ [5, 6]. V současné době je k dispozici pouze několik málo studií zabývajících se prevalencí subklinické aterosklerózy u dětí s CD [5, 8, 9, 13]. Nicméně žádná z dosavadních studií dosud nehodnotila endoteliální funkci kombinací pletyzmografického a biochemického vyšetření.

Reaktivní hyperemický index (RHI) odráží změny arteriálního tonu v periferním řečišti (PAT). Nedostatečné zvýšení PAT amplitudy během reaktivní hyperémie, následující po fázi přechodné okluze, je spojeno s ED. Tento fakt potvrzují již dříve publikované studie, při kterých byly konfirmačně použity též invazivní metody měření [9]. ED se manifestuje též specifickými biochemickými markery. Ty mohou být využity v detekci prozánětlivých a protrombogenních změn endotelu.

Soubor a metodika

Soubor pacientů

Do studie bylo zařazeno celkem 21 pacientů s CD. Diagnóza CD byla založena na standardních klinických, radiologických, endoskopických a histologických kritériích [14]. Aktivita onemocnění byla hodnocena pomocí pediatrického indexu aktivity Crohnovy choroby (PCDAI), kde hodnota PCDAI vyšší nebo rovna 10 byla považována za aktivní onemocnění [15]. V souladu s Pařížskou klasifikací mělo 15 pacientů zánětlivou formu CD, 4 pacienti stenózující formu a 2 fistulující formu CD. Dva pacienti z této skupiny dětí byli pro CD operováni [16]. Trvání CD bylo definováno jako doba mezi stanovením diagnózy a zařazením pacienta do studie.

Do studie byli zařazeni pouze pacienti s trváním choroby 3,0 ± 2,6 let, kteří během studie pokračovali v zavedené protizánětlivé a imunosupresivní léčbě CD. Jedenáct z  našich 21 pacientů bylo léčeno imunomodulátory (azathioprinem) a mesalazinem, u 4 pacientů probíhala terapie steroidy a zbytek pacientů byl léčen pouze mesalazinem. Žádný z pacientů nikdy nebyl léčen biologickou léčbou (infliximab, adalimumab). Dále byla do studie zařazena kontrolní skupina 12 zdravých dětí bez anamnézy zánětlivého, metabolického nebo neoplastického onemocnění. Tato skupina odpovídala pacientům s CD věkem, pohlavím a hodnotou BMI (body mass index) [31]. U žádného z členů kontrolní skupiny se nevyskytovaly gastrointestinální (GI) potíže, probandi neužívali antibiotika, protizánětlivé ani další léky, včetně anticytokinové biologické terapie, které by mohly ovlivnit funkci endotelu [17]. Demografická charakteristika souboru je uvedena v tabulce 1. Mezi kritéria vylučující zařazení do výzkumné studie patřila autoimunitní onemocnění, onemocnění jater, recidivující bolesti břicha, gastrická infekce Helicobacter pylori, renální dysfunkce, kouření, kardiovaskulární onemocnění a jejich předčasná manifestace v rodinné anamnéze a dále pacienti, u kterých nebyla možná komunikace a spolupráce během studie.

Metody

Měření RHI

Měření jsme prováděli pomocí přístroje EndoPAT^® (Itamar Caesarea^®, Izrael). Metoda měření je založena na principu pletyzmografického hodnocení změny postokluzního arteriálního tonu v periferním řečišti (PAT) za použití biosenzorů umístěných na ukazováčcích obou rukou. Vyšetření probíhalo v tiché, termoneutrální místnosti. Během patnáctiminutové klidové fáze byly zaznamenány vstupní hodnoty PAT na obou rukou. Poté byla na nedominantní končetině provedena pětiminutová okluze pomocí manžety nafouknuté 60 mmHg nad hodnotu systolického tlaku, nejméně však 200 mmHg. Po jejím ukončení měření pokračovalo pětiminutovou postokluzní fází, manifestující se jako reaktivní hyperémie, s výpočtem reaktivního hyperemického indexu (RHI). Ten je vypočítán automaticky pomocí softwaru (EndoPAT^®) z poměru hodnot post- a preokluzního arteriálního průtoku, které jsou vztaženy k hodnotám na simultánně měřené, neokludované kontralaterální končetině [32]. Tak je minimalizováno riziko nežádoucích změn cévního tonu exogenního původu v průběhu měření.

Laboratorní měření

Vzorky krve jsme získávali od všech účastníků studie po nočním lačnění za standardních klinických podmínek. Mezi biochemické parametry, které jsme hodnotili v souvislosti s ED, patřil asymetrický dimetylarginin (ADMA), E-selektin a vazoadhezivní molekuly VCAM-1, měřené metodou ELISA (OLD Diagnostica^®, BioVendor^®). Vysoce senzitivní CRP (hs-CRP) byl hodnocen pomocí imunoturbidimetrického stanovení (Orion Diagnostica^®). Sérové hladiny celkového cholesterolu, triacylglycerolů, HDL a LDL byly stanoveny v klinické laboratoři pomocí autoanalyzátoru (enzymatic assay GTP Human^® and CHOD-PAP Dialab^®).

Všechny vzorky byly shromážděny kvalifikovaným personálem, analýza byla provedena certifikovaným biochemickým pracovištěm v rámci zaslepené studie bez znalosti klinického stavu jednotlivých probandů.

Statistické hodnocení

Hodnoty získané z jednotlivých měření jsou vyjádřeny pomocí průměrné hodnoty, směrodatné odchylky, mediánu a interkvartilového rozmezí. Statistická rozdílnost mezi skupinami zdravých kontrol a pacientů s CD byla vypočítána pomocí neparametrického Wilcoxonova párového testu. Korelace mezi hodnotami RHI a biochemickými parametry byly hodnoceny pomocí Spearmanova a Kendallova koeficientu pořadové korelace. Všechny statistické výpočty byly zpracovány pomocí softwaru Statistica^® (Stasoft, Tulsa, USA). Hodnota p = 0,05 a méně byla považována za statisticky významnou.

Etické aspekty

Studie byla provedena v souladu se zásadami Helsinské deklarace. Protokol studie byl schválen lokální etickou komisí. Před zahájením studie byl u všech účastníků zákonnými zástupci dětí podepsán informovaný souhlas. Výzkum nebyl sponzorován žádnou společností.

Výsledky

Demografická data

Základní demografické a klinické charakteristiky souboru pacientů s CD a zdravých kontrol jsou shrnuty v tabulce 1. Oba soubory byly srovnatelné a mezi jednotlivými soubory nebyly zjištěny žádné signifikantní rozdíly ve věku, pohlaví, krevním tlaku, výšce, hmotnosti a BMI. Do souboru pacientů s CD byly zařazeny děti s nízkou aktivitou onemocnění, PCDAI 6,0 ± 4,8 a trváním onemocnění 3,0 ± 2,6 let. Hladiny lipoproteinů ve skupině dětí s CD byly nižší ve srovnání se zdravými kontrolami, přesto však u všech dětí v mezích referenčních hodnot.

Hodnocení funkce endotelu

Hodnota RHI v souboru pacientů s CD byla signifikantně nižší v porovnání s kontrolním souborem (1,50 ± 0,55 vs. 1,99 ± 1,68, p <0,05). Výsledky jsou uvedeny v grafu 1.

Hodnota E-selektinu u dětí s CD byla signifikantně vyšší v porovnání se zdravými kontrolami (92,28 ± 42,40 µg/L vs. 55,28 ± 26,86 µg/L, p <0,05).

ADMA u dětí s CD byl signifikantně vyšší v porovnání se zdravými kontrolami (0,74 ± 0,11 µmol/L vs. 0,56 ± 0,08 µmol/L, p <0,01).

Plazmatická hladina hsCRP u dětí s CD byla signifikantně vyšší v porovnání se zdravými kontrolami. Ze souboru jsme vyřadili 3 vzorky překračující 10 mg/L (2,23 ± 2,80 mg/L vs. 0,31 ± 0,42 mg/L, p <0,05).

V plazmatických hladinách sVCAM nebyl signifikantní rozdíl mezi pacienty s CD a zdravými kontrolami (1046 ± 237 µg/L vs. 915 ± 155 µg/L, p >0,05).

Výsledky jsou uvedeny v grafu 2.

Korelační analýza

V obou souborech byl nalezen signifikantní inverzní vztah mezi RHI a VCAM-1 (r = -0,9276; p <0,05,r = -0,4608; p <0,05). Žádné další asociace nalezeny nebyly. Multivariantní regresní analýza neidentifikovala žádné nezávislé proměnné ve vztahu k RHI.

Diskuse

V této studii jsme se zabývali možností detekce ED u dětí s CD. Signifikantně snížené hodnoty RHI a zároveň zvýšené plazmatické koncentrace hsCRP, ADMA a E-selektinu poukazují na pravděpodobný výskyt ED ve skupině dětí s CD. Námi použitý model je prvním výzkumným projektem, který přináší informace týkající se endoteliální funkce u dětských pacientů s CD pomocí kombinovaného měření RHI a specifických biochemických markerů. Literární údaje potvrzují, že chronická zánětlivá a imunologická onemocnění, jako autoimunitní revmatická onemocnění [18], chronická renální onemocnění [19], systémový lupus erythematodes [20], progresivní systémová skleróza [21], diabetes mellitus 2. typu [22] a autoimunní tyroiditida [23], jsou spojena se zvýšeným rizikem ED a předčasných změn cévní stěny.

Ze studie Moriho et al. [6] víme, že pokles průtoku krve během experimentální kolitidy může mít za následek sníženou kapacitu arteriol tlustého střeva reagovat na endotel-dependentní vazodilatátory, jako je bradykinin. Nikotinamidadenindinukleotidfosfát oxidázou derivovaný superoxid hraje zásadní roli v indukci zánětem indukované, na endotelu dependentní dysfunkce arteriol. HsCRP také souvisí s aterogenním procesem a zvýšená hladina hsCRP je zřejmě prediktivním faktorem morbidity a mortality při kardiovaskulárních příhodách u zdánlivě zdravých jedinců, bez ohledu na konvenční obecně známé rizikové faktory [8, 13]. V naší studii jsme pozorovali signifikantně zvýšené hladiny hsCRP u pacientů s CD v souladu s již dříve publikovanými pediatrickými údaji [13]. E-selektin je odpovědný za adhezi leukocytů v endoteliálních buňkách založenou na imunologicko-zánětlivých interakcích. Zvýšená hladina E-selektinu byla nalezena u dětí s ISZ [10], srovnatelné byly hodnoty i v naší skupině pacientů s CD. Výsledky studie ukazují signifikantně zvýšené hladiny ADMA u pacientů s CD ve srovnání se zdravými kontrolami. Tyto nálezy odráží skutečnost, že zvýšené hladiny ADMA, coby kompetitivního inhibitoru syntázy oxidu dusnatého, vedou k poklesu postokluzní vazodilatace. Výsledky jsou v souladu se závěry publikovanými u dospělých jedinců [12]. Podobně jsme nalezli signifikantně zvýšené hladiny ADMA u dětí s diabetes mellitus 1. typu a familiární hypercholesterolemií v našich předchozích studiích [24]. Diagnóza obou těchto onemocnění je spojena s vyšším rizikem předčasné manifestace aterosklerózy. Zmíněné nálezy tedy významně podporují naši hypotézu o úzkém vztahu mezi hladinami ADMA a endoteliální funkcí.

Dalším zajímavým nálezem naší studie byl signifikantně nižší celkový a LDL cholesterol u dětí s CD, hodnoty lipoproteinů u pacientů s CD byly také snížené oproti kontrolnímu souboru, u všech dětí však stále byly v rámci referenčních hodnot. Tyto změny jsou zřejmě dány poruchou lipidového metabolismu způsobenou peroxidačním stresem na podkladě CD [25] vyžadující však ověření dalšími studiemi u dětí.

Nález signifikantně nižšího RHI u dětí s CD je analogický s výsledky dříve publikovaných studií, které hodnotily ED u dospělých pacientů s nespecifickým střevním zánětem za použití ultrasonografických metod s vysokým rozlišením. Mezi tyto metody patří FMD (flow-mediated dilatation) a IMT (intima-media thickness). Reprodukovatelnost FMD u dětí je předmětem diskuse vzhledem k technické náročnosti, metoda nemůže navíc eliminovat exogenně podmíněné neurovegetativní změny během měření. Použití IMT u dětí je též problematické, neboť je nepravděpodobné, že by morfologické změny tloušťky intimy a medie arteriální stěny detekovatelné ultrazvukem předcházely funkčním změnám na buněčné úrovni. IMT se navíc mění s věkem a je tedy obtížné stanovit přesnou hranici normálních hodnot v dětské populaci [8]. Tato fakta korespondují s rozporuplnými výsledky, které se týkají IMT u dětí s idiopatickým střevním zánětem [13, 27] a dříve publikovanými studiemi u mladých dospělých [28, 29].

Naproti tomu neinvazivní pletyzmografická metoda měření RHI vykazuje z technického hlediska řadu nesporných výhod. Její provádění je jednodušší, automatizovaná analýza eliminuje případnou subjektivní chybu vyšetřujícího. Simultánní komparace s kontralaterální neokludovanou končetinou redukuje případné cévní změny v důsledku náhodného vnějšího vlivu během vyšetření. Úzký vztah mezi RHI a ED byl potvrzen pomocí invazivních metod [9]. Osika et al. ve své studii, zahrnující 248 zdravých dětí, demonstrovali, že nejsou žádné rozdíly v hodnotách RHI mezi pohlavími [30].

V případě hodnocení výsledků naší analýzy musíme také brát do úvahy určité limitace, se kterými jsme se v rámci studie setkali. Jednou z možných limitací této studie může být absence limit cut-off hodnot RHI a biochemických markerů u dětí a také počet dětí naší kontrolní skupiny. To je částečně odrazem etických důvodů a praktických potíží při zařazování zdravých dětí do studie, která vyžaduje odběry vzorků krve. Nicméně RHI skóre v naší kontrolní skupině souhlasí s dříve publikovanými daty z rozsáhlých studií u zdravých dětí [30], což významně zvyšuje sílu výsledků v naší studii. S ohledem na biochemické parametry považujeme velikost vybraného kontrolního souboru za dostatečnou k získání objektivních závěrů především proto, že všechny zkoumané biochemické markery jsou spojeny s relativně nízkou variabilitou. Je nutné brát v úvahu též fakt, že v jedné z nedávných studií byla prokázána zvýšená základní PAT amplituda u obézních lidí ve srovnání se zdravými kontrolami, a současně inverzní vztah mezi základní amplitudou a reakcí PAT na hyperémii [7]. V malé studii Moerlanda et al. jsou popsány rozporuplné výsledky týkající se RHI skóre a jeho schopnosti detekovat akutní změny vazodilatace následující po kouření [26]. Těchto skutečností jsme si vědomi, do naší studie však obézní děti ani kuřáci zařazeni nebyli.

Závěr

Z výsledků naší studie vyplývá, že CD může být spojena s vyšším rizikem rozvoje předčasné aterosklerózy. Signifikantně snížené hodnoty RHI a elevované hodnoty biochemických markerů poukazují na možný výskyt ED u dětí s CD. Jsme názoru, že kombinace měření RHI a specifických biochemických parametrů by mohla být vhodnou metodou pro detekci ED a stratifikaci individuálního kardiovaskulárního rizika v dlouhodobém sledování těchto pacientů. Nicméně se jedná o první studii tohoto charakteru v dětském věku, praktický přínos této metodiky bude třeba ověřit v dalších rozsáhlejších studiích.

Studie byla podpořena výzkumným projektem MSMT CZ- No. 0021620816 a PRVOUK P36.

Došlo: 7. 5. 2014

Přijato: 6. 1. 2015

MUDr. Aneta Masopustová

Dětská klinika FN

Alej Svobody 80

304 00 Plzeň

e-mail: masopustovaa@fnplzen.cz