Crohnova nemoc – genetické faktory z pohledu etiopatogeneze

Crohn’s disease – etiopathogenetic factors

Crohn’s disease is often purely inflammatory, but most patients develop complicated disease with strictures or fistulae. Specific etiopathogenesis of this severe disease is not definitely clear despite research efforts and learning of many pathogenetic mechanisms. Many studies have suggested that NOD2 mutations are associated with increased risk of complicated disease. Presence of NOD2 mutation itself is just one of factors contributing to development of this disease. Genetically predisposed individuals in combination with influence of environmental factors result in a disturbed innate (i.e., disturbed intestinal barrier, Paneth cell dysfunction) and adaptive (i.e., imbalance of effector and regulatory T cells and cytokines, migration and retention of leukocytes) immune response towards a diminished diversity of commensal microbiota. Data of meta-analysis made so far provide ambiguous evidence to support top-down therapy based solely on single NOD2 mutations, but suggest that targeted early-intensive therapy for high-risk patients with two NOD2 mutations might be beneficial, but more prospective trials could answer these questions.

Key words:
biologic treatment léčba – Crohn’s disease – fenotypization – genetic – imunobiology

Autori: Tomáš Kupka ¹; Jarmila Šímová ^2,3; Lubomír Martínek ^3,4; Pavel Svoboda ¹; Pavel Klvaňa ¹; Martina Bojková ¹; Magdalena Uvírová ^2,3; Lenka Dovrtělová ⁵; Petr Dítě ¹
Pôsobisko autorov: Akademické centrum gastroenterologie Interní kliniky LF OU a FN Ostrava, přednosta doc. MUDr. Arnošt Martínek, CSc. ¹; Vzdělávací a výzkumný institut AGEL, o. p. s. – pobočka Ostrava-Vítkovice, CGB laboratoř, a. s., Laboratoř molekulární genetiky a patologie, vedoucí Mgr. Jarmila Šimová ²; LF OU Ostrava, děkan doc. MUDr. Jaroslav Horáček, CSc. ³; Chirurgická klinika LF OU a FN Ostrava, přednosta doc. MUDr. Pavel Zonča, Ph. D., FRCS ⁴; Katedra podpory zdraví FSS MU Brno, vedoucí katedry Mgr. Lenka Dovrtělová, Ph. D. ⁵
Vyšlo v časopise: Vnitř Lék 2014; 60(7-8): 635-639
Kategória: 100th Birthday - prof. Z. Mařatka

Súhrn

Crohnova nemoc se často projevuje čistě jako zánětlivé onemocnění, ale u mnoha pacientů se vyvine v komplikované onemocnění charakterizované tvorbou striktur nebo píštělí. Přesná etiopatogeneze tohoto závažného onemocnění není zcela jednoznačně objasněna, a to i přes veškeré úsilí výzkumu a přes poznání řady dílčích patogenetických mechanizmů. Mnoho studií naznačuje, že se zvýšeným rizikem rozvoje komplikované formy onemocnění souvisí zejména varianty v NOD2/CARD15 genu. Samotná přítomnost variant v NOD2 genu je pouze jen jedním z faktorů přispívajících k rozvoji tohoto onemocnění. U geneticky predisponovaných jedinců v kombinaci s působením faktorů prostředí dochází k porušení vrozené (např. porušená střevní bariéra, dysfunkce Panethových buněk) i adaptivní (např. nerovnováha efektorových a regulačních T lymfocytů a cytokinů, migrace a retence leukocytů) imunitní odpovědi vůči snížené pestrosti střevních komenzálů. Data dosud provedených metaanalýz neposkytují jednoznačné důkazy k podpoře top-down strategie terapie závislé pouze na jediné variantě v NOD2 genu, ale na druhé straně v případě vysoce rizikových pacientů se dvěma variantami v NOD2 genu data ukazují, že cílená a časná intenzivní terapie by mohla být prospěšná. Na tyto otázky by mohly odpovědět další prospektivní studie.

Klíčová slova:
biologická léčba – Crohnova nemoc – fenotypizace – genetika – imunobiologie

Úvod

Crohnova nemoc a ulcerózní kolitida jsou dva hlavní zástupci nespecifických střevních zánětů. Crohnova nemoc je relabující zánětlivé onemocnění postihující zejména gastrointestinální trakt a projevující se bolestmi břicha, horečkou a klinickými známkami střevní obstrukce nebo průjmy s příměsí krve, hlenu, nebo obojího.

Patogeneze tohoto onemocnění je multifaktoriální a na rozvoji tohoto onemocnění se podílejí jak genetické faktory, tak i faktory environmentální. Složité interakce mezi imunitním systémem a střevní luminální flórou spouštějí chronické zánětlivé odpovědi, jejichž výsledkem je vývoj střevní fibrózy. V úvodu se u většiny pacientů vyvinou čistě zánětlivé projevy choroby, ale u mnoha pacientů se časem vyvine střevní fibróza, což může vést k rozvoji těžkých komplikací, jako jsou stenózy střevního lumen, anebo střevní píštěle. Počet pacientů, u kterých se vyvine stenozující nebo fistulující komplikace, se různí. Míra progrese onemocnění se zdá být nepředpověditelná, ačkoliv bylo uskutečněno mnoho pokusů k definování „agresivního fenotypu“ [1,2]. Cílem předpovědi fenotypu choroby je identifikovat pacienty s vysokým rizikem rozvoje závažného onemocnění, kteří by mohli profitovat z časné agresivní terapie. Existují dvě nutné podmínky, které musejí být splněny, aby byla prediktivní strategie úspěšná. První podmínkou je, že prediktivní test musí být senzitivní a specifický pro komplikované onemocnění. Druhou podmínkou je, že skupina pacientů, predikována jako nemocní s komplikovaným onemocněním, musí mít prokazatelnou pozitivní odpověď na velmi nákladnou změnu terapie.

Incidence Crohnovy choroby (CD) se uvádí 4–9 případů na 100 000 obyvatel a prevalence 27–48 případů na 100 000 obyvatel, výskyt je stejně častý u obou pohlaví. Celkový počet onemocnění za období posledních dvaceti let se viditelně zvýšil.

Genetika

Hromadný familiární výskyt je znám více než 70 let a už velké studie dvojčat v severní Evropě naznačovaly přítomnost spoluúčasti genetické složky. Studie potvrdily, že příbuzní prvního stupně pacientů s CD mají přibližně 10–20% celoživotní riziko rozvoje CD ve srovnání s obecnou populací [3,4]. Na základě celogenomových studií a meta-analýz bylo identifikováno nejméně 70 chromozomálních lokusů, které vykazují spojitost s rozvojem Crohnovy choroby [5].

S Crohnovou chorobou byla asociována cela řada genů. Již v roce 2001 byla nezávisle dvěma skupinami poprvé publikována asociace polymorfizmů/variant v NOD2 (nucleotide-binding oligomerization domain 2) genu označovaného také jako CARD15 (caspase recruitment domain 15) se zvýšenou pravděpodobností rozvoje Crohnovy choroby [6,7]. Jako další varianty, velmi signifikantně asociované s rizikem CD, jsou zmiňovány zejména varianty v genech ATG16L1, IBD5, IRGM, DLG5, IL23 a TLR4 [8–12].

NOD2 gen je umístěn na chromozomu 16 (16q12) a kóduje protein patřící do rodiny NOD2-like receptorů. Tento cytoplazmatický protein, intracelulární receptor, který je exprimován v zejména v monocytech, makrofázích, dendritických buňkách, Panethových buňkách a intestinálních epiteliálních buňkách, hraje důležitou roli v imunitní odpovědi na bakteriální infekci [13,14]. Rozpoznává komponenty buněčných stěn bakterií (mikrobiální membrány), jakými jsou například bakteriální lipopolysacharidy a peptidoglykany. Jako ligand NOD2 byl identifikován muramyl dipeptid (MDP) odvozený od bakteriálních peptidoglykanů. Po vazbě ligandu NOD2 indukuje aktivaci specifické signální dráhy aktivující NF-κB, což následně vede k produkci prozánětlivých mediátorů a anti-mikrobiálních molekul [15–17].

Jako jednonukleotidové polymorfismy (sekvenční varianty) v NOD2 genu asociované s CD jsou označovány dvě jednonukleotidové substituce p.R702W (rs139104022), p.G908R (rs2066845), které vedou ke změně aminokyselinové sekvence v NOD2 proteinu a jednobázová inzerce cytozinu v sekvenci NOD2 genu p.L1007fs (rs2066847) (označována i c.3019_3020insC, p.Leu1007fsX1008) vedoucí ke vzniku stop kodonu a vzniku zkráceného proteinu [18,19]. Uvádí se, že tyto tři varianty představují přibližně 81 % mutací v NOD2 genu u pacientů s CD [20]. Uvádí se, že relativní riziko rozvoje CD je ve srovnání se zdravou populací 2–4krát vyšší u nosičů jedné ze sekvenčních variant v NOD2 genu (heterozygoti) a přibližně až 17krát vyšší u nosičů dvou variant (homozygoti, složení heterozygoti) [21]. Přesný mechanizmus, jak jsou výše uvedené sekvenční varianty v NOD2 genu spojeny s rozvojem CD zůstává stále nejasný. Výsledkem těchto variant je nejspíše snížená schopnost aktivovat NF-κB po stimulaci MDP [16].

Byly vytvořeny tři hlavní teorie vysvětlující patogenezi Crohnovy nemoci prostřednictvím mutovaného NOD2 proteinu. První ukazuje na pozorování zvýšené produkce IL12 na základě stimulace splenických makrofágů myší s NOD2 mutací bakteriálními peptidoglykany, na rozdíl od makrofágů s divokým typem NOD2. Toto dává vzniknout hypotéze, že NOD2 normálně funguje jako negativní regulátor produkce IL12, což je mutací NOD2 genu porušeno. Druhá hypotéza vznikla na základě studie s myšmi s NOD2 mutací, jejichž makrofágy z kostní dřeně projevovaly zvýšenou produkci IL1β na základě stimulace MDP, což vedlo k závěru, že mutace NOD2 spojené s Crohnovou nemocí se mohou projevovat jako alely se získanou funkcí. Třetí teorie vznikla zjištěním, že mutace NOD2 způsobují nižší expresi α-defenzinu ve sliznici ilea u pacientů s Crohnovou nemocí společně se zvýšenou mírou výskytu extraintestinální infekce Listeria monocytogenes u myší s NOD2 mutací. To vedlo k závěru, že NOD2 má podíl na hostitelské slizniční obraně. Na základě těchto studií by mutace NOD2 mohly vést k přetrvávajícímu slizničnímu zánětu [23].

**Schéma. Schematické znázornění genu a proteinu NOD2/CARD15. Upraveno podle [22]**

Studie z roku 2002 jasně ukázaly blízkou funkční korelaci mezi NOD2 a regulací autofagie [24]. Přítomnost variant NOD2 asociovaných s Crohnovou nemocí má za následek nepřiměřenou odpověď střevního epitelu k bakteriálním antigenům, což vede k nekontrolovanému prozánětlivému působení [25]. Zdá se, že muramyl dipeptid prostřednictvím NOD2 reprezentuje silný aktivátor autofagie [26,27]. U dendritických buněk je autofagie zprostředkovaná NOD2 zásadní pro nakládání s invadujícími bakteriemi stejně jako pro prezentaci antigenu a indukci odpovědi CD4⁺ T-lymfocytů s antigenem. Dendritické buňky u pacientů s mutantním NOD2 proteinem selhávají ve shlukování autofagozomů a prezentaci antigenů. Jako možný mechanizmus ukázali Travassos et al [26], že NOD2 je nezbytný k iniciaci autofagie na buněčné membráně v místě vstupu bakterií. Buňky s variantami v NOD2 genu spojenými s Crohnovou nemocí nejsou schopné se přesně nasměrovat na místo imunitní odpovědi v plazmatické membráně. Přítomnost těchto buněk také způsobuje vyšší sekreci prozánětlivých cytokinů IL1β a IL6 z mononukleárů periferní krve. Tato pozorování silně naznačují, že NOD2 stejně jako autofagie hrají klíčovou roli ve vrozené imunitní odpovědi a představují funkční mechanizmus, jak porušená funkce autofagie může přispět k rozvoji chronického střevního zánětu.

Ačkoliv byla patogeneze Crohnovy nemoci na základě mutace v NOD2 rozsáhle studována, neexistuje žádná shoda, že by se na patogenezi onemocnění podílel jediný dominantní mechanizmus, ale že k rozvoji nemoci dochází velmi pravděpodobně vlivem několika různých působení.

Podle literárních údajů přibližně 30–50 % pacientů s CD ze západní Evropy a severní Ameriky nese nejméně jednu z uvedených variant v NOD2 genu (uvádí se, že 10–30 % pacientů s CD jsou heterozygoti – nositelé jedné ze tří sekvenčních variant v NOD2 genu a 3–15 % CD pacientů jsou homozygoti nebo složení heterozygoti – nositelé dvou variant) [28–30]. Rizikové alely se vyskytují i u zdravé populace, avšak v daleko nižší frekvenci (0,5–20 %) [31]. Studie zahrnující přes 3 500 zdravých osob (z 15 různých skupin ze tří kontinentů) uvádí frekvenci výskytu s CD asociovaných variant v NOD2 genu následovně p.R702W u zdravé kavkazské populace přibližně 4,3 %, v případě p.G908R je to 1,2 % a p.L1007fs přibližně okolo 2,3 % [32].

Byly publikovány práce zabývající se vztahem mezi mutacemi v NOD2 genu a závažností projevů CD – např. rozvojem onemocnění v mladším věku, ilealními komplikacemi, ileocekální resekcí, strikturou, vznikem píštělí s možností penetrace, vyšším rizikem postoperativních relapsů a reoperací [28,29,33–38].

Většina studií se zaměřila na riziko vývoje nemoci a příliš nespecifikují tíži onemocnění. Relativně málo studií přímo řešilo otázku tíže onemocnění. Studie, které publikovaly fenotyp onemocnění, ukázaly různorodé stupně rizika, které lze přičíst variantám v NOD2 genu [39]. Některé se zaměřovaly na rozdíly mezi specifickými mutacemi NOD2 genu, jiné se soustředily na počet mutantních alel [40,41]. U určitých variant NOD2 se předpokládalo, že vedou k závažnějším obtížím, a proto predikují agresivnější chování nemoci [38,42]. Dosavadní data si však, co se týče prognostické hodnoty genotypu NOD2, odporovala.

U nás Hošek et al [43] vyšetřili skupinu osob s M. Crohn a ulcerózní kolitidou, žijících v České republice a na Slovensku. Prokázali statisticky významný rozdíl v pozitivitě mutace p.L1007fs pro NOD2 mezi M. Crohn a zdravou populací a podobně statisticky významný rozdíl i pro variantu p.K469E pro ICAM-1 gen.

Metaanalýza autorů Adlera et al [44] zjistila, že přítomnost jedné varianty v NOD2 genu má nízkou prediktivní schopnost pro určení fenotypového projevu onemocnění, avšak současný výskyt dvou variant v genu NOD2 má vysoký stupeň specificity pro agresivní fenotyp onemocnění, ačkoliv senzitivita zůstává nízká. Tyto výsledky ukazují, že přítomnost vícečetných mutací určuje jen částečně vysoce rizikovou skupinu. Naproti tomu přítomnost jedné mutace v NOD2 není důvěryhodný prediktor fenotypu onemocnění. Ani metaanalýza Solon et al [45] nepotvrdila zvýšené riziko rekurence chirurgických zákroků u pacientů s CD s variantami v NOD2 genu. Nicméně poslední práce Cleynen et al [46] publikována na základě výsledků IBDchip European project, studující varianty asociované s CD a klinickými charakteristikami, uvádí, že přítomnost variant v NOD2 genu je spojena s agresivnějším klinickým projevem a je nezávislým prediktivním faktorem pro ileální lokalizaci, stenozující a penetrující formu onemocnění.

Závěr

Je zřejmé, že genetika hraje jednu z důležitých rolí z pohledu rozvoje Crohnovy nemoci a studium genetických variant asociovaných s rozvojem CD přispívá k pochopení patofyziologie tohoto onemocnění. Na vyjádření fenotypu onemocnění se podílí nejen genetika kombinací a interakcí vícečetných rizikových alel, ale i řada faktorů environmentálních. K celkovému určení fenotypu tohoto onemocnění je tedy potřeba multifaktoriální přístup, který zahrnuje faktory prostředí, genetické faktory, vystavení různé medikaci, kouření, první projevy onemocnění atd. Pro pacienty by v praxi bylo užitečné, kdyby bylo jasně definováno, že určení genotypu dokáže odhadnout riziko tíže onemocnění. Kdyby byla metoda předpovědi tíže onemocnění přesná, mělo by to výrazný benefit pro pacienta a péči o něj. Přesný a dostatečně silný prediktor komplikovaného onemocnění následovaný cílenou terapeutickou intervencí by pravděpodobně změnil celkový pohled na Crohnovu nemoc a ospravedlnil by časné použití nákladné biologické léčby u vysoce ohrožených pacientů.

MUDr. Tomáš Kupka

tomas.kupka@fno.cz

Interní klinika LF OU a FN, Ostrava-Poruba

http://www.fno.cz/interni-klinika

Doručeno do redakce 9. 5. 2014

Zdroje

1. Louis E, Collard A, Oger A F et al. Behaviour of Crohn’s disease according to the Vienna classification: changing pattern over the course of the disease. Gut 2001; 49(6): 777–782.

2.Beaugerie L, Seksik P, Nion-Larmurier I et al. Predictors of Crohn’s disease. Gastroenterology 2006; 130(3): 650–656.

3. Lakatos L, Mester G, Erdelyi Z et al. Striking elevation in incidence and prevalence of inﬂammatory bowel disease in a province of western Hungary between 1977–2001. World J Gastroenterol 2004; 10(3): 404–409.

4. Beaugerie L, Seksik P, Nion-Larmurier I et al. Predictors of Crohn’s disease. Gastroenterology 2006; 130(3): 650–656.

5. Franke A, McGovern DP, Barrett JC et al. Genome-wide meta-analysis increases to 71 the number of confirmed Crohn´s disease susceptibility loci. Nat Genet 2010; 42(12): 1118–1125.

6. Hugot JP, Chamaillard M, Zouali H et al. Association of NOD2 leucine-rich repeat variants with susceptibility to Crohn‘s disease. Nature 2001; 411 (6837): 599–603.

7. Ogura Y, Bonen DK, Inohara N et al. A frameshift mutation in NOD2 associated with susceptibility to Crohn‘s disease. Nature 2001; 411(6837): 603–606.

8. Silverberg MS, Duerr RH, Brant SR et al. NIDDK IBD Genetics Consortium. Refined genomic localization and ethnic differences observed for the IBD5 association with Crohn’s disease. Eur J Hum Genet 2007; 15(3): 328–335.

9. Stoll M, Corneliussen B, Costello CM et al. Genetic variation in DLG5 is associated with inflammatory bowel disease. Nat Genet 2004; 36(5): 476–480.

10. Duerr RH, Taylor KD, Brant SR et al. A genome-wide association study identifies IL23R as an inflammatory bowel disease gene. Science 2006; 314(5804): 1461–1463.

11. Prescott NJ, Dominy KM, Kubo M et al. Independent and population-specific association of risk variants at the IRGM locus with Crohn’s disease. Hum Mol Genet 2010; 19(9): 1828–1839.

12. Weersma RK, Stokkers PC, van Bodegraven AA et al. Dutch Initiative on Crohn and Colitis (ICC). Molecular prediction of disease risk and severity in a large Dutch Crohn’s disease cohort. Gut 2009; 58(3): 388–395.

13. Ogura Y, Inohara N, Benito A et al. Nod2, a Nod1/Apaf-1 family member that is res-tricted to monocytes and activates NF-kappaB. J Biol Chem 2001; 276(7): 4812–4818.

14. Lala S, Ogura Y, Osborne C et al. Crohn’s disease and the NOD2 gene: a role for paneth cells. Gastroenterology 2003; 125(1): 47–57.

15. Shih DQ, Targan SR. Immunopathogenesis of infl ammatory bowel disease. World J Gastroenterol 2008; 14(3):390–400.

16. Inohara, N., Y. Ogura, A. Fontalba et al. 2003. Host recognition of bacterial muramyl dipeptide mediated through NOD2: implications for Crohn’s disease. J Biol Chem 2003; 278(8): 5509–5512.

17. Kobayashi, K. S., M. Chamaillard, Y. Ogura, O et al. Nod2-dependent regulation of innate and adaptive immunity in the intestinal tract. Science 2005; 307(5710): 731–734.

18. Derakhshan F, Naderi N, Farnood A et al Frequency of three common mutations of CARD15/NOD2 gene in Iranian IBD patiens. Indian J Gastroenterrol 2008; 27(1): 8–11.

19. Hugot JP, Zaccaria I, Cavanaugh J et al for the IBD International Genetics Consortium. Prevalence of CARD15/NOD2 mutations in Caucasian healthy people. Am J Gastroenterol 2007 Jun;102(6): 1259–1267.

20. Lesage S, Zouali H, Cezard JP. CARD15/NOD2 mutational analysis and genotype-phenotype correlation in 612 patients with inflammatory bowel disease. Am J Hum Genet 2002; 70(4): 845–857.

21. Economou M, Trikalinos TA, Loizou KT, et al. Differential effects of NOD2 variants on Crohn´s diesease risk and phenotype in diverse populations: a metaanalysis. Am J Gastroenterol 2004; 99(12): 2393–2404.

22. Mathew CG, Lewis CM. Genetics of inflammatory bowel disease: progress and prospects. Hum Mol Genet 2004;13(Spec No 1): R161-R168.

23. Zelinková Z. Individualizácia liečby nešpecifických zápalových ochorení čreva. Habilitační práce v oboru „Vnitřní lékařství“. Lekárska fakulta Univerzity Komenského: Bratislava 2012.

24. Ahmad T, Armuzzi A, Bunce M et al. The molecular classification of the clinical manifestations of Crohn’s disease. Gastroenterology 2002; 122(4): 854–866.

25. Biswas A, Liu YJ, Hao L et al. Induction and rescue of NOD2-dependent Th1-driven granulomatous inflammation of the ileum. Proc Natl Acad Sci USA 2010; 107(33): 14739–14744.

26. Travassos LH, Carneiro LA, Ramjeet M et al. NOD1 and NOD2 direct autophagy by recruiting ATG16L1 to the plasma membrane at the site of bacterial entry. Nat Immunol 2010; 11(1): 55–62.

27. Homer CR, Richmond AL, Rebert NA et al. ATG16L1 and NOD2 interact in an autophagy-dependent antibacterial pathway implicated in Crohn’s disease pathogenesis. Gastroenterology 2010; 139(5): 1630–1641.

28. Alvarez-Lobos M, Arostegui JI, Miquel S et al. Crohn’s disease patients carrying NOD2/CARD15 gene variants have an increased and early need for first surgery due to stricturing disease and higher rate of surgical recurrence. Ann Surg 2005; 242(5): 693–700.

29. Henckaerts L, Vermeire S. NOD2/CARD15 disease associations other than Crohn‘s disease. Infl amm Bowel Dis 2007; 13(2): 235–241.

30. Brant SR, Wang MH, Rawsthorne P et al. A population-based case-control study of CARD15 and other risk factors in Crohn‘s disease and ulcerative colitis. Am J Gastroenterol 2007; 102(2): 313–323.

31. Hugot, JP, I. Zaccari, J. Cavanaugh J et al ( IBD International Genetics Consortium). Prevalence of CARD15/NOD2 mutations in Caucasian healthy people. Am. J. Gastroenterol 2007; 102(6): 1259–1267.

32. Pascoe L, Zouali H, Sahbatou M et al. Estimating the odds ratios of Crohn disease for the main CARD15/NOD2 mutations using a conditional maximum likelihood method in pedigrees collected via affected family members. Eur J Hum Genet 2007; 15(8): 864–871.

33. Bianchi V, Maconi G, Ardizzone S et al. Association of NOD2/CARD15 mutations on Crohn‘s disease phenotype in an Italian population. Eur J Gastroenterol Hepatol 2007; 19(3): 217–23.

34. Van der Linde K, Boor PP, Houwing-Duistermaat JJ et al. CARD15 mutations in Dutch familial and sporadic infl ammatory bowel disease and an overview of European studies. Eur J Gastroenterol Hepatol 2007; 19(6): 449–459.

35. Heliö T, Halme L, Lappalainen M et al. CARD15/NOD2 gene variants are associated with familially occurring and complicated forms of Crohn‘s disease. Gut 2003; 52(4): 558–562.

36. Seiderer J, Brand S, Herrmann KA et al. Predictive value of the CARD15 variant 1007fs for the diagnosis of intestinal stenoses and the need for surgery in Crohn‘s disease in clinical practice: results of a prospective study. Infl amm Bowel Dis 2006; 12(12): 1114–1121.

37. Laghi L, CostaS, Saibeni S et al. Carriage of CARD15 variants and smoking as risk factors for resective surgery in patients with Crohn’s ileal disease. Aliment Pharmacol Ther 2005; 22(6): 557–564.

38. Annese V, Lombardi G, Perri F et al. Variants of CARD15 are associated with an aggressive clinical course of Crohn’s disease – an IG-IBD study. Am J Gastroenterol 2005; 100(1): 84–92.

39. Louis E, Michel V, Hugot J P et al. Early development of stricturing or penetrating pattern in Crohn’s disease is influenced by disease location, numbers of flares, and smoking but not by NOD2/CARD15 genotype. Gut 2003 ;52(4): 552–557.

40. Abreu M T, Taylor K D, Lin Y C et al. Mutations in NOD2 are associated with fibrostenosis disease in patients with Crohn’s disease. Gastroenterology 2002; 123(3): 679–688.

41. Economou M, Trikalinos T A, Loizou K T et al. Differential effects of NOD2 variants on Crohn’s disease risk and phenotype in diverse populations: a metaanalysis. Am J Gastroenterol 2004; 99(12): 2393–2404.

42. Jurgens M, Brand S, Laubender R P et al. The presence of fistulas and NOD2 homozygosity strongly predict intestinal stenosis in Crohn’s disease independent of the IL23R genotype. J Gastroenterol 2010; 45(7): 721–731.

43. Hošek J, Bartošová L, Gregor P et al. Frequency of representative single nucleotide polymorphism associated with inflammatory bowel disease in the Czech Republic and Slovak Republic. Folia Biol (Praha) 2008; 54(3): 88–96.

44. Adler J, Rangwalla S C, Dwamena B A et al. The prognostic power of the NOD2 genotype for complicated Crohn’s Disease: a meta-analysis. Am J Gastroenterol 2011;106(4): 699–712.

45. Solon JG, Burke JP, Walsh SR et al. The effect of NOD2 polymorphism on postsurgical recurrence in Crohn’s disease: a systematic review and meta-analysis of available literature. Inflamm Bowel Dis 2013 Apr; 19(5): 1099–1105.

46. Cleynen I, González JR, Figueroa C et al. Genetic factors conferring an increased susceptibility to develop Crohn’s disease also influence disease phenotype: results from the IBDchip European Project. Gut 2013 Nov; 62(11): 1556–1565.