Analýza vztahu sérových hladin párů těžkých/lehkých řetězců imunoglobulinu (Hevylite™) k výsledkům standardní gelové elektroforézy a nefelometrického vyšetření bílkovin séra při diagnóze mnohočetného myelomu

Súhrn

Úvod:
Stále preciznější diagnostika a léčba mnohočetného myelomu (MM) vyžaduje přesnou analýzu imunoglobulinů séra, což naráží na limitace standardních vyšetřovacích metod. Metoda Hevylite™ umožňuje kvantitativní analýzu párů těžkých/lehkých řetězců tumorózního a normálního IgG a IgA imunoglobulinu (HLC) a výpočet jejich vzájemného poměru (HLC-r). Cílem studie bylo zhodnocení přínosu metody Hevylite™ v diagnostice MM v porovnání s nefelometrií (NEF), standardní gelovou elektroforézou (SPE), imunofixační elektroforézou (IFE) proteinů séra a vyšetřením hladin volných lehkých řetězců imunoglobulinu (VLŘ) metodou Freelite™ a párů těžkých/lehkých řetězců imunoglobulinu (HLC) metodou Hevylite™.

Metody:
Metodami Hevylite™, NEF, SPE, IFE a Freelite™, byl vyšetřen soubor 134 jedinců splňujících diagnostická kritéria International Myeloma Working Group (IMWG), 96 bylo IgG a 38 IgA typu.

Výsledky:
Hladiny HLC-kappa (K) a HLC-lambda (L), stejně jako HLC-r nezávisely na věku a pohlaví. Abnormální hodnoty HLC byly přítomny v 84 až 100 %, patologický HLC-r v 92–100 % podle izotypu MIg. Byla zjištěna silná pozitivní korelace mezi hladinami IgG i IgA (NEF) a součtem hodnot HLC IgG-K + IgG-L (Hevylite™) (r = 0,80, p < 0,0001) i HLC IgA-K + IgA-L (r = 0,75, p < 0,0001). Velmi silná pozitivní korelace byla mezi koncentrací MIg (SPE) a hodnotami HLC (Hevylite™) u IgG-K (r = 0,73), IgG-L (r = 0,76), IgA-K (r = 0,70) a IgA-L (r = 0,89), p < 0,0001. Systematický rozdíl mezi Hevylite™ vs. MIg (SPE) byl potvrzen Blandovým-Altmannovým testem v případě HLC IgA-K i IgA-L, nikoliv HLC IgG-K a IgG-L a při korelaci hodnot HLC s hladinami Ig IgG a IgA (NEF). Nejvýznamnější korelace mezi SPE (soubor s MIg < 15 g/l) vs. Hevylite™ byla zjištěna při analýze souboru HLC IgG-K+ IgA-K (r = 0,85, p < 0,0001), a v celkové sestavě všech nemocných s MM, tj. IgG + IgA-kappa a lambda (r = 0,76, p < 0,0001), ověřená Blandovým-Altmannovým testem. Těsným pozitivním vztahem se vyznačovala korelace mezi HLC-r a indexem monoklonality VLŘ-K/L u MM typu IgG i IgA (p < 0,0001).

Závěr:
Hevylite™ metoda, zejména stanovení HLC-r u IgA typu MM je oproti SPE a NEF citlivější a zvyšuje diagnostickou přesnost a hodnocení velikosti nádorové masy. Přes omezení týkající se zejména vysokých hodnot IgG typu MIg má Hevylite™ technika slibný potenciál k obohacení standardního armamentária analytických technik, neboť umožňuje navíc stanovení koncentrace a poměr hladin nádorových i nenádorových imunoglobulinů, tj. hloubku imunnosuprese, validní zejména u MM s nízkou hodnotou MIg.

Klíčová slova:
mnohočetný myelom – monoklonální imunoglobulin – hladiny páru těžkých/lehkých řetězců imunoglobulinu – poměr HLC-kappa/HLC-lambda imunoglobulinu – Hevylite™ – elektroforéza proteinů séra – imunofixační elektroforéza – volné lehké řetězce imunoglobulinu – Freelite™

ÚVOD

Mnohočetný myelom (MM) je zhoubné onemocnění krvetvorného systému, vyznačující se monoklonální proliferací plazmatických buněk produkujících monoklonální imunoglobulin (MIg), nebo jeho strukturální komponenty, tj. lehký řetězec kappa nebo lambda (l.ř. K nebo L) a přítomností příznakového komplexu CRAB (hyperkalcemie, porucha renální funkce, anémie a postižení skeletu). Odlišení normálního imunoglobulinu (Ig) od MIg včetně jejich přesné kvantifikace v séru patří k základním postupům v diagnostice, sledování průběhu, výběru léčby a odhadu prognózy MM (1–4). IMWG (International Myeloma Working Group) guidelines a další autoři doporučují jako základní „screeningové“ metody v diagnostice a sledování průběhu monoklonálních gamapatií (MG) standardní (SPE) a imunofixační (IFE) elektroforézu bílkovin séra a/nebo moči, nefelometrické vyšetření celkové hladiny jednotlivých tříd imunoglobulinů (NEF) a vyšetření hladin volných lehkých řetězců imunoglobulinu (VLŘ) kappa a lambda v séru metodou Freelite™, včetně výpočtu jejich poměru K/L (3–9). Je známo, že použitelnost SPE je omezena zejména při nízké hodnotě MIg a v případě IgA typu MIg jeho migrací s dalšími proteiny séra, např. s haptoglobinem, transferinem a C3 složkou komplementu, což vede k významnému zkreslení skutečné koncentrace MIg v séru, a tím i k nepřesnému odhadu celkové nálože nádorové masy (3, 6, 10–13). Tato limitace, stejně jako zkreslení výšky sérové hladiny MIg v důsledku změny objemu plazmy, posunu hodnoty hematokritu a rozdílného poločasu katabolismu jednotlivých tříd MIg odstraňuje metoda Hevylite™. Tato nefelometrická, případně turbidimetrická technika umožňuje díky použití specifických protilátek proti junkčním epitopům umístěným mezi těžkým a lehkým řetězcem molekuly Ig přesnou separátní kvantifikaci párů těžkých/lehkých řetězců imunoglobulinu kappa a lambda (HLC-K a HLC-L) (14, 15). Metoda Hevylite™ tedy umožňuje současné separátní stanovení sérové hladiny MIg produkovaného myelomovou tkání, tj. nádorového („involved“) MIg a nenádorového, polyklonálního (normálního, „uninvolved“) Ig stejného izotypu vytvářeného normálními reziduálními plazmocyty (1, 2, 8). U MM jde tedy o typ IgG-K/IgG-L a IgA-K/IgA-L s možností výpočtu jejich vzájemného poměru (HLC-r), tj. poměru MIg „monoklonálního/Ig polyklonálního“ (HLC-K/HLC-L) (4, 6, 16, 17).

Náplní předložené studie byla korelační analýza výsledků získaných vyšetřením proteinů séra technikou Hevylite™, a to s ohledem na věk a pohlaví a s výsledky vyšetření hladin IgG a IgA Ig s pomocí NEF i koncentrace MIg třídy IgG a IgA vyšetřené s pomocí standardní gelové SPE. Speciální subanalýza se zaměřila na „hyposekreční“ formu MM (zvolena hodnota MIg < 15 g/l) a na vyhodnocení vztahu mezi poměrem HLC-K/HLC-L (Hevylite™) a poměrem hladin VLŘ-K/VLŘ-L (index monoklonality K/L, Freelite™). Vzhledem k biologickým rozdílnostem mezi jednotlivými imunochemickými typy MM byla zvolena separátní analýza souborů s MIg třídy IgG, IgA, rozčleněných na podtypy kappa a lambda.

SOUBOR PACIENTŮ A POUŽITÉ METODY

Prospektivní studie vycházela z analýzy původně 163členné sestavy nemocných s MM, splňující diagnostická kritéria International Myeloma Working Group (IMWG) (5, 7). Analyzovaný soubor tvořilo 85 žen a 78 mužů (Ž/M: 1,09), věkový medián byl 67 (29–89) let. K vlastní analýze párů těžkých/lehkých řetězců Ig (HLC-K a L) metodou Hevylite™ provedené při diagnóze MM byla vybrána sestava 134 nemocných, 96 jedinců IgG (72 %) a 38 IgA typu (28 %), poměr zastoupení lehkých řetězců K/L byl 2,5. Z vlastní analýzy bylo nutné vyřadit jedince s nepřítomností intaktní molekuly MIg v séru (tj. Benceho-Jonesova typu) a pro neexistenci specifických Hevylite™ souprav 29 nemocných s IgD, biklonálním a nesekrečním typem MM. Základní biologické a laboratorní charakteristiky jednotlivě analyzovaných souborů, tj. tříd IgG, IgA a celkové sestavy (IgG + IgA) jsou shrnuty v tabulce 1.

Pro analýzu byla použita zmražená séra na –78 °C, deponovaná v bance sér FN Olomouc (3. IK-NRE a OKB). Stanovení sérových hladin M-proteinu se provádělo na přístroji Sebia Hydrasy s užitím souprav Sebia Hydragel 30 Protein(e) s následnou kvantifikací monoklonálního gradientu pomocí skeneru Epson 1680. Hladiny polyklonálních imunoglobulinů byly vyšetřovány soupravami Human IgG kit (NR: 7–16 g/l) a Human IgA kit (0,7–4 g/l). K imunofixační analýze byly použity soupravy Hydragel 4 IF. K vyhodnocení sérových hladin volných lehkých řetězců (VLŘ) byly použity soupravy Freelite SPA Plus kappa free (NR-normální rozmezí: 3,3–19,4 mg/l) a Freelite SPA Plus lambda free (NR: 5,7–26,3 mg/l) doplněné výpočtem indexu monoklonality K/L (NR: 0,26–1,65) (1, 2). Pro stanovení sérových koncentrací HLC byl použit turbidimetr SPA Plus (The Binding Site) a soupravy Hevylite Human IgG kappa (NR: 3,84–12,07 g/l), IgG lambda (NR: 1,91–6,74 g/l), IgA kappa (NR: 0,57–2,08 g/l) a IgA lambda (NR: 0,44–2,04 g/l), vzájemný poměr párů izotypů IgG a IgA Ig byl určen výpočtem. Část analyzovaných vzorků vyžadovala vzhledem k vysoké koncentraci HLC, převyšujících měřící rozsah přístroje manuální předředění. Sérové koncentrace β₂-mikroglobulinu (β₂-M) byly vyšetřeny s pomocí metody ELISA (normální hodnota < 2,3 mg/l), ke stanovení hladiny albuminu v séru byly použity standardní techniky. Ke stratifikaci nemocných s MM byl použit jednak klasický stážovací systém dle Durieho-Salmona (D-S), jednak podle International Staging System (ISS) (7, 18).

Ke statistické analýze byla použita Spearmanova korelační analýza, test dle Pearsona, U-test dle Manna-Whitneye, Wilcoxonův test a Blandova-Altmannova grafická analýza (p < 0,05).

VÝSLEDKY

Statistická analýza neprokázala v analyzovaných souborech, vyšetřených při diagnóze MM statisticky významný rozdíl v hladinách jednotlivých izotypů HLC (Hevylite™) ve vztahu k věku, tj. HLC třídy IgG-K a IgG-L: r = 0,177 a 0,056 v souboru kappa; r = 0,109 a 0,010 v souboru lambda i v souboru HLC třídy IgA-K a IgA-L: r = 0,178 a 0,219 v souboru kappa; r = 0,313 a 0,203 v souboru lambda. Nebyla rovněž zjištěna závislost poměru sérových hladin párů HLC-K/HLC-L, tj. hodnoty HLC-r k věku v souboru HLC IgG-K (r = 0,024), HLC IgG-L (r = 0,078), HLC IgA-K (r = 0,161) a HLC IgA-L (r = 0,326). Nevýznamně rovněž vyzněla analýza rozdílnosti vztahu hladin HLC mezi jedinci kategorií mladších vs. starších 65 let (p = 0,624). Rovněž analýza vztahu sérových hladin HLC-r k pohlaví vyzněla negativně (p = 0,866). Abnormální hodnoty nádorového(„involved“) HLC-K při diagnóze MM u všech vyšetřených jedinců byly zjištěny pouze ve skupině IgA-K (100 %), zatímco v souborech IgG-K, IgG-L, IgA-L a v celkové sestavě IgG + IgA se vyskytovaly abnormální hodnoty, tj. mimo referenční rozmezí (1, 2) v rozsahu 84–95 % s nejnižším zastoupením (84 %) u typu IgA-K (tab. 2). Abnormální poměr HLC-K/HLC-L, tj. HLC-r byl zaznamenán ve všech imunochemických třídách MIg v 92–98 % s výjimkou IgA-K, tedy častěji, než byla zaznamenána patologie sérových hladin HLC (tab. 2). Kombinovaná přítomnost abnormální hodnoty HCL a/nebo HLC-r byla zaznamenána ve všech souborech s odlišným typem MIg a v celkové sestavě nemocných s IgG + IgA typem M-proteinu v 83–93 % (tab. 2). Abnormální hodnoty HLC nebo HLC-r tedy nebyly přítomny zcela u všech jedinců analyzovaných souborů rozčleněných podle třídy MIg.

Ukázalo se, že v souboru nemocných s přítomností MIg typu IgG-K byla pozorována vyšší nebo nižší hodnota MIg (SPE) oproti součtu párů HLC IgG-K + IgG-L (Hevylite™) ve 44 vs. 56 %, zatímco v souboru IgG-L byl výskyt obdobný. V případě MIg typu IgA, a to v souborech IgA-K a IgA-L naprosto jednoznačně převažovala situace, vyznačující se vyššími hodnotami součtu párů HLC IgA-K + IgA-L, než byla koncentrace sérového MIg (SPE, tj. v 84 % a 77 %). Hlubší analýza zaměřená na nemocné s MM s MIg v séru < 15 g/l (SPE) potvrdila vysokou citlivost kvantitativního vyšetření hladin nádorového („involved“) imunoglobulinu (Hevylite™) s převahou vyšších hodnot nejen u IgA, ale i u IgG typu MM (80 % a 87 %).

Při srovnání výsledků součtu koncentrací HLC-K a HLC-L, vyšetřených s pomocí metody Hevylite™ oproti celkové hladině M-proteinu v séru vyšetřeného s pomocí konvenční SPE byla zjištěna poměrně těsná korelace naměřených hladin. Součty hladin nádorového („involved“) a normálního, nenádorového („noninvolved“) izotypu imunoglobulinu obou analyzovaných tříd, tj. HLC IgG a IgA vykazovaly silnou pozitivní korelaci s celkovou hladinou MIg vyšetřenou s pomocí konvenční SPE: 96členný soubor IgG (r = 0,743, p < 0,0001), 38členný soubor IgA (r = 0,777, p < 0,0001). Z korelačního bodového grafu je ale patrné, že v některých individuálních situacích byly zaznamenány v IgG i IgA třídě dosti výrazné rozdíly, stávající se stále nápadnějšími s narůstající koncentrací MIg (graf 1A a 1B).

Následná analýza se proto zaměřila k cílené separátní analýze vztahu součtu koncentrací párů HLC-K + HLC-L (Hevylite™) k celkové hodnotě Ig séra vyšetřené nefelometricky a k hladinám MIg (SPE) v souborech IgG a IgA podrozdělených podle typu l. ř. kappa a lambda. Byla zjištěna silná pozitivní korelace mezi celkovou hodnotou IgG typu Ig séra vyšetřeného nefelometrickou technikou a součtem párů IgG HLC-K a HLC-L (Hevylite™). Z korelačního bodového grafu 2A je patrné, že hodnoty celkového IgG v séru jsou vyšší než suma HLC IgG-K+IgG-L, což potvrdil i Wilcoxonův test, prokazující v 90 % vyšší hodnoty IgG (NEF). Z grafu dle Blanda-Altmanna je zřejmé, že mezi výsledky získanými nefelometrickou a Hevylite™ technikou je systematický rozdíl, přičemž ve zjištěných rozdílech není patrný trend (tab. 3, graf 2B). Subanalýza vztahu hodnoty IgG-K typu MIg (SPE) k HLC IgG-K (Hevylite™) prokázala silnou pozitivní korelaci (tab. 3) s nevýznamnou diferencí výsledků obou technik (graf 3A), přičemž analýza dle Blanda-Altmanna nenalezla do hodnoty 40 g/l mezi oběma metodami systematický rozdíl (tab. 3, graf 3B). Subanalýza, srovnávající M-komponentu IgG-L (SPE) vs. IgG-L HLC (Hevylite™) nalezla silnou pozitivní korelaci s nevýznamnou rozdílností výsledků obou metod (graf 4A), rozbor s použitím testu dle Blanda-Altmanna nezjistil systematický rozdíl ani patrný trend (tab. 3, graf 4B). V případě analýzy IgA typu imunoglobulinu byla rovněž zjištěna silná pozitivní korelace mezi výškou hladiny celkového Ig séra vyšetřenou nefelometrickou technikou a součtem párů IgA HLC-K a HLC-L (Hevylite™). Z korelačního bodového grafu 5A je patrné, že s rostoucí hodnotou IgA se zvětšují rozdíly naměřených hodnot oproti součtu HLC IgA-K a IgA-L, přičemž v 78 % je součet hodnot HLC IgA-K a IgA-L vyšší. Z grafu dle Blanda-Altmanna je zřejmé, že mezi nefelometrickou a Hevylite™ metodou je systematický rozdíl, přičemž od hodnoty MIg > 30 g/l jsou hodnoty součtu HLC IgA-K + IgA-L vyšší než koncentrace IgA určená nefelometricky (tab. 3, graf 5B). Subanalýza vztahu hodnoty MIg IgA-K typu (SPE) k HLC IgA-K (Hevylite™) prokázala silnou pozitivní korelaci s tím, že s rostoucími hodnotami MIg se rozdílnost naměřených hodnot zvětšuje, takže hladiny HLC IgA-K jsou v 84 % vyšší než MIg dle SPE (tab. 3, graf 6A). Při analýze podle Blanda- Altmanna (graf 6B) byl zjištěn mezi metodami SPE vs. Hevylite™ systematický rozdíl s tím, že hodnoty HLC IgA-K jsou vyšší nežli koncentrace MIg (SPE) a to zejména od hodnoty MIg > 30 g/l (tab. 3, graf 6B). Subanalýza vztahu hodnot MIg IgA-L typu (SPE) k HLC IgA-L (Hevylite™) prokázala silnou pozitivní korelaci s tím, že s rostoucími hodnotami MIg se rozdílnost naměřených hodnot zvětšovala, v 77 % byly hodnoty HLC IgA-L vyšší než koncentrace MIg typu IgA-L (SPE). Grafická analýza dle Blanda-Altmanna potvrdila systematický rozdíl mezi metodami SPE a Hevylite™ s tím, že od hodnoty MIg > 30 g/l (SPE) byly hodnoty HLC IgA-L vyšší než koncentrace MIg (SPE) (tab. 3).

Analýza sestavy vzniklé spojením nemocných s IgG + IgA typem MM potvrdila v souboru s l.ř. kappa i v souboru s l.ř. lambda silnou pozitivní korelaci mezi výsledky SPE a Hevylite™ s přítomností záporných i kladných diferencí, což dokládá i široká škála rozptylu diferencí mediánu rozdílnosti mezi hodnotami naměřenými SPE, eventuálně nefelometricky vs. Hevylite™. Při použití Blandovy-Altmannovy grafické analýzy nebyla zjištěna přítomnost systematického rozdílu mezi srovnávanými metodami (tj. SPE vs. Hevylite™) (tab. 3). Analýza sestavy vzniklé sdružením nemocných s IgG + IgA typem (včetně kappa + lambda typu) MM prokázala rovněž velmi silnou pozitivní korelaci s 71% výskytem vyšších hodnot HLC IgG + IgA (Hevylite™) oproti koncentracím MIg IgG + IgA (SPE). Analýza dle Blanda-Altmanna prokázala systematický rozdíl mezi oběma metodami (tab. 3).

Speciální analýza věnovaná rozboru skupiny 18 nemocných s MM IgG-K + IgA-K typu s koncentracemi MIg < 15 g/l prokázala mezi naměřenými hodnotami metodami SPE a Hevylite™ velmi silnou pozitivní korelaci (r = 0,854, p < 0,0001), přičemž hodnoty MIg (SPE) byly v 78 % nižší než součet hodnot HLC IgG-K + IgA-K. Grafická analýza podle Blanda -Altmanna prokázala mezi výsledky SPE a Hevylite™ systematický rozdíl, přičemž v pozorovaných rozdílech naměřených hodnot byl dobře patrný trend (tab. 4). Snaha o stejně zkoncipovanou analýzu v sestavě vzniklé spojením nemocných IgG-L + IgA-L typu MIg selhala pro nedostatečnou velikost souboru (n = 11). V případě korelace celkové hladiny Ig vyšetřené nefelometricky v sestavě IgG + IgA typu MM (bez ohledu na typ l. ř., tj. jedinců typu K + L) k součtu hodnot HLC IgG-K + IgG-L a IgA-K + IgA-L byla potvrzena silná pozitivní korelace, přičemž 43 % hodnot HLC IgG + IgA bylo vyšších a 57 % nižších než koncentrace imunoglobulinu IgG + IgA vyšetřená nefelometricky. Blandův-Altmannův test neshledal mezi oběma porovnávanými metodami systematický rozdíl (tab. 4). Popsané závěry dokresluje i výše vypočtené hodnoty mediánů rozdílností mezi hladinami MIg (SPE), případně výškou celkového Ig (NEF) oproti hodnotám párů HLC (Hevylite™), majících u jednotlivých dílčích analýz různě výrazný kladný nebo záporný vztah a rozdílný rozptyl naměřených hodnot (tab. 3 a 4).

Při korelační analýze vzájemného vztahu výsledků získaných Hevylite™ a Freelite™ technikou byla zjištěna velmi těsná korelace mezi poměrem sérových hladin HLC-K/HLC-L, tj. HLC-r (Hevylite™) a indexem monoklonality VLŘ kappa/lambda (Freelite™). Zjištěný vztah byl velmi obdobný při separátní analýze souboru s MIg třídy IgG a IgA i v rámci hodnocení celé sestavy, sdružující soubory nemocných s oběma typy, tj. IgG + IgA MM (tab. 5).

DISKUZE

Z provedené analýzy vyplývá, že hodnoty sérových hladin HLC i HLC-r nemají vztah k věku, a to i z hlediska srovnání jedinců v kategoriích mladších vs. starších 65 let, odlišné nejsou rovněž hodnoty HLC ani mezi jedinci různého pohlaví. K obdobnému závěru dospěla i předchozí studie věnovaná IgA typu MM, jež přes významnou tendenci k věkově podmíněnému zvyšování hladin párů HLC kappa a lambda neprokázala statisticky významnou rozdílnost hodnot HLC-r (13).

Z analýzy vyplynulo, že abnormální hodnoty tumorózního („involved“) HLC-kappa či HLC- lambda nemusejí být přítomny u všech nemocných s MM, neboť v naší 134členné sestavě MM, vyšetřené při diagnóze nemoci, jsme zjistili abnormální hladiny u IgG-K, IgG-L a IgA-L formy MM v 84–95 %, zatímco 100% výskyt patologických hodnot byl zaznamenán pouze u jedinců IgA-K typu. Z uvedeného vyplývá, že v rámci výrobcem doporučeného „normálního“ rozmezí nevylučuje nález normální hodnoty HLC-K nebo HLC-L diagnózu MM. Z hlediska klinické praxe je mnohem přínosnější stanovení HLC-r (poměru HLC K/L), neboť zohledňuje nejen výši produkovaného nádorového („involved“) MIg, ale i hloubku izotypově specifické „imunoparézy“, tj. stupně suprese „netumorózního“ (normálního, „noninvolved“) Ig stejného izotypu, což umožňuje i v případě normální hladiny tumorózního HLC rozpoznání monoklonality a polyklonální suprese u MM (6, 16, 19, 20) a na rozdíl od imunohistochemických technik neinvazivně, bez nutnosti biopsie kostní dřeně (KD) (3). Je nasnadě, že větší nádorová nálož je obvykle spojena s vyšší supresí normálních plazmocytů, a tím i s nižší hodnotou normálního (noninvolved) Ig (2). HLC-r je proto mnohem přínosnější ukazatel reziduální nálože nádorové tkáně u MM než SPE (21).

Na rozdíl od předchozích studií (2, 3, 16, 20), popisujících vysokou senzitivitu a specificitu Hevylite™ techniky, vyznačující se patologií hodnoty HLCr a vesměs i hladin HLC u všech nemocných při rozpoznání především IgA typu MM, v naší Hevylite™ analýze TM jsme zaznamenali normální hodnotu HLC-r u 2–8 % jedinců typu IgG-K, IgG-L a IgA-L, zato výskyt koncentrace HLC v rámci normálního rozmezí, s výjimkou IgA-K, u 3–16 % nemocných. Je tedy zřejmé, že přes opakovaně referovanou vysokou senzitivitu nelze považovat metodu Hevylite™ v diagnostice MM v klinické praxi za zcela spolehlivou a nahrazující IFE. IFE, vysoce citlivá detekční technika plní i nadále roli „zlatého standardu“ (12, 13, 16, 22), neboť obdobně jako Hevylite™ technika není ovlivněna komigrací MIg s jinými bílkovinnými komponentami séra (transferin, C3 složka komplementu, beta lipoprotein, haptoglobin aj.), avšak na rozdíl od Hevylite™ metody umožňuje exkluzivní detekci méně obvyklých typů MIg, tj. biklonálního, IgD a IgE typu včetně těžkého řetězce gama, alfa a mí (12, 14). Její dobře známou nevýhodou je nemožnost kvantitativní analýzy. Studie Wolffa zaznamenala při srovnání s IFE senzitivitu stanovení IgA HLC-r v séru 95,6 % (13). Je nutné poznamenat, že ojediněle byla odhalena situace vyznačující se abnormální hodnotou HLC-r v případě negativity SPE a zejména IFE. IFE a Hevylite™ je nutné tedy považovat za metody komplementární, vzájemně se nenahrazující (2, 6, 20, 22). Přes zmíněná omezení je tedy Hevylite™ technika důležitým příspěvkem v armamentáriu standardně používaných metod v detekci MIg, neboť překonává za typických klinicko-laboratorních podmínek limitace standardní SPE, zejména analytickou nepřesnost v kvantifikaci IgA typu M-proteinu (1, 3, 10, 12, 15). Z dosavadních studií vyplývá, že vzestup hodnoty HLC-r umožňuje časnou detekci relapsu a předpověď kratší doby do progrese nemoci (PFS). Jako negativní nezávislý prognostický faktor předpovídá vysoká hodnota HLC-r kratší dobu celkového přežití (OS) u IgG i IgA typu MM (6, 15, 20, 23).

Vzhledem k tomu, že zjištěné sumární hladiny HLC-K + HLC-L (Hevylite™) se v naší sestavě MM výrazně lišily od koncentrace MIg (SPE), byla provedena cílená analýza zaměřená na srovnání výsledků SPE, nefelometrie a Hevylite™. Bezprostředním impulzem byla skutečnost, že hladiny MIg v séru (SPE) byly při prostém srovnání v případě IgG-K v 44 % a u IgG-L v 50 % případů vyšší, než součet hladin HCL IgG-K + IgG-L (Hevylite™), zatímco v případě IgA jednoznačně převažovaly vyšší hodnoty HLC IgA-K + IgA-L nad koncentrací MIg, a to u IgA-K v 84 %, u IgA-L v 77 %. Toto zjištění odpovídá zkušenosti, že Hevylite™ vyšetření je důležité především u IgA typu MM vyznačujícího se širokou elektroforetickou migračníβ-zónou v důsledku interference IgA s některými proteiny, omezující přesnou a věrohodnou SPE denzitometrickou kvantifikaci M-proteinu, a to především u IgA (46–55 %), než u IgG (4 %) typu MM (1–3, 10, 15). Korelační analýza zjistila poměrně dobrý vztah mezi součtem nádorového („involved“) a nenárodového („noninvolved“) Ig téhož izotypu (HLC-K + HLC-L) s koncentrací MIg (SPE) v séru v případě IgG a IgA typu, i když s narůstající koncentrací MIg, případně i hladiny celkového Ig se vzájemný vztah, a to zejména u IgA typu oslaboval. Vzhledem k tomu, že tento jev byl pozorován již v předchozích studiích (1–3), byla provedena hlubší analýza v souborech rozčleněných podle typu l.ř. Ig K a L, a separátně i v případech „hyposekreční“ formy MM se zvolenou diskriminační hranicí MIg 15 g/l.

Z korelační analýzy vyplynulo, že celkové hodnoty IgG imunoglobulinu v séru stanovené nefelometricky pozitivně korelují a jsou v 90 % vyšší než součet příslušných HLC-K + HLC-L (Hevylite™), což potvrdila i grafická analýza dle Blanda-Altmanna prokazující mezi oběma metodami systematický rozdíl. Při stanovení celkového množství Ig má metoda Hevylite™ potenciál zpřesnit a případně nahradit dosavadně používané měření nefelometrickou metodou (23). Speciální subanalýza zaměřená na srovnání vztahu MIg (SPE) IgG-K a IgG-L k identickému izotypu HLC (Hevylite™) prokázala u obou izotypů MIg silnou pozitivní korelaci s nevýznamnou odlišností naměřených hodnot, přičemž v případě IgG-K nebyl s pomocí Blandovy-Altmannovy analýzy do koncentrace < 40 g/l pozorován systematický rozdíl ani patrný trend. HLC-r v případě IgG typu Ig není vzhledem k obdobné intenzitě katabolismu polyklonální a monoklonální formy ovlivněn změnami katabolického poločasu, a proto lépe odráží stupeň nádorové produkce nežli koncentrace MIg v séru stanovená s pomocí SPE (6).

Rovněž v případě korelační analýzy mezi celkovou hodnotou imunoglobulinu IgA vyšetřenou nefelometrickou technikou a součtem hodnot HLC IgA-K a IGA-L (Hevylite™) byla zjištěna silná pozitivní korelace, ovšem s narůstající rozdílností a se 78% přítomností vyšších hodnot HLC IgA-K + IgA-L. Analýza dle Blanda-Altmanna prokázala mezi výsledky nefelometrie a Hevylite™ systematický rozdíl s nálezem vyšších hodnot HLC (Hevylite™) od hodnoty Ig > 30 g/l. Speciální subanalýza věnovaná srovnání vztahu MIg (SPE) IgA-K a IgA-L k identickému izotypu HLC (Hevylite™) prokázala v obou srovnáních silnou pozitivní korelaci. S nárůstem koncentrace MIg byla zjištěna narůstající rozdílnost, takže u 84 % HLC IgA-K a v 77 % IgA-L byly hodnoty HLC vyšší než koncentrace MIg, změřená s pomocí SPE. Blandova-Altmannova analýza potvrdila mezi výsledky SPE a Hevylite™ systematický rozdíl s tím, že v případě HLC IgA-K i IgA-L jsou od > 30 g/l naměřené hodnoty vyšší než koncentrace MIg zjištěná s pomocí SPE. Hevylite™ metoda tedy potvrdila při srovnání s SPE přednost v přesné kvantifikaci M-proteinu, vyznačujícím se širokým elektroforetickým migračním obrazem (24).

Analýza sestavy, sdružující nemocné s IgG a IgA typem MM, rozvrstvená podle l.ř. K a L lambda potvrdila silnou pozitivní korelaci výsledků mezi SPE a Hevylite™ s přítomností záporných i kladných rozdílů v naměřených hodnotách, takže v Blandově-Altmannově analýze nebyla pozorována systematická rozdílnost. Vysvětlením je zřejmě odlišný charakter diferencí zjištěný při předchozích separátních analýzách u IgG a IgA typu MM. Analýza celkové sestavy zahrnující všechny nemocné s IgG a IgA kappa i lambda typem MM se vyznačovala velmi silnou pozitivní korelací a se 71% výskytem vyšších hodnot HLC než MIg, Blandův-Altmannův test systematickou rozdílnost mezi oběma metodami potvrdil.

Speciální analýza, věnovaná analýze MM s hodnotou IgG-K + IgA-K MIg < 15 g/l (SPE) prokázala nejsilnější pozitivní korelaci s hodnotou korelačního koeficientu r = 0,854 (p < 0,0001) a se 78% výskytem vyšších hodnot HLC než koncentrací MIg. Blandův-Altmannův test prokázal mezi SPE a Hevylite™ systematický rozdíl a v rozdílnostech dobře patrný trend. Uvedené zjištění zapadá do zkušenosti, že standardní SPE se vyznačuje limitem kvantifikace 0,5–2,0 g/l v závislosti na umístění MIg proužku, vztahu k jiným proteinům a míře fokusace v gelu, přičemž katodální IgG proužek je snadněji analyzován než anodální proužek IgA, jenž může obsahovat polymerické složky a má sklon ke komigraci s řadou dříve diskutovaných proteinů (2, 12). Obdobně zkoncipovaná analýza, zaměřená na nemocné s MM s hodnotou IgG-L + IgA-L typu MIg < 15 g/l se vzhledem k omezenému počtu nemocných nezdařila. Z dosavadních studií je známo, že 33 % nemocných s nízkou hodnotou M-proteinu typu IgA nelze s pomocí SPE přesně sledovat (15). Při hodnocení výsledků nutno vzít v potaz i skutečnost, že HLC diagnostické „assay“ pro IgA a IgM typ M-protein jsou citlivější než pro IgG, neboť ve srovnání s IgG mají obě tyto třídy kratší, pouze 5–6denní katabolický poločas. Tumory IgA a IgM typu, jsou proto v případě obdobné koncentrace MIg v séru relativně větší než IgG typu s katabolickým poločasem 21 dnů. Silná pozitivní korelace byla rovněž zjištěna při analýze vztahu celkové hodnoty IgG + IgA Ig kappa a lambda, vyšetřené nefelometricky oproti součtu párů HLC IgG + IgA K a L (Hevylite™), ovšem Blandův-Altmannův test neshledal vzhledem k heterogenitě souboru s prokázanou přítomností protichůdných tendencí mezi oběma sdruženými MIg systematický rozdíl. Získané výsledky potvrzují, že metoda Hevylite™ umožňuje přesné kvantitativní stanovení i velmi nízkých hodnot MIg, což ji předurčuje k detekci a kvantifikaci nízkých a „zastřených“ M-proteinů, a sledování minimální reziduální nemoci (MRD) a časného relapsu MM i při negativitě SPE a v některých případech i IFE (14).

Za přínos je možné považovat ověření předchozího zjištění, prokazující velmi těsnou pozitivní korelaci mezi poměrem sérových hladin HLC-K/HLC-L, tj. HLC-r (Hevylite™) a indexem monoklonality VLŘ K/L (VLŘ-r) (Freelite™), platící pro separátní analýzu souborů IgG, IgA i sestavu vzniklou spojení nemocných s IgG + IgA typu MIg, což dokládá, že při hodnocení klonality myelomového procesu jsou oba přístupy využitelné (23). Vyšetření HLC a VLŘ poskytuje neinvazivní, komplementární přístup k detekci a sekvenčnímu monitorování potenciálních nádorových klonů v KD (1). Srovnání výsledků vyšetření hladin VLŘ (Freelite™ ) oproti hladinám HLC (Hevylite™) v pilotní studii prokázalo, že metoda Hevylite™ je citlivější, neboť abnormální hodnoty byly nalezeny u všech nemocných, zatímco patologické hladiny VLŘ pouze v 86 % (23). Rovněž normalizace HLC-r se vyznačuje vyšším predikčním potenciálem než úprava indexu monoklality VLŘ K/L (3). Určitá diskordance výsledků Hevylite™ a Freelite™ metody v některých studiích, tj. hladin HLC a HLC-r vs. VLŘ a VLŘ-r je vysvětlitelná variabilitou klonální evoluce u MM s přítomností různých subklonů myelomových buněk vyznačujících se různou schopností produkce l.ř. Ig a intaktní molekuly MIg (3). Metoda Hevylite™ poskytuje navíc cenné informace o klonální evoluci, patogenezi a biologii MM (3, 25–28). Bylo prokázáno, že IgG plazmocelulární klony suprimují syntézu polyklonálních IgG imunoglobulinů intenzivněji než klony IgA a IgM typu (26). Hodnocení hladin nádorového (involved) a normálního (uninvolved) Ig a zejména jejich poměru (HLC-r) metodou Hevylite™ má navíc dle řady prací světového písemnictví význam pro stanovení stadia nemoci, monitorování průběhu, hodnocení hloubky léčebné odezvy (zejména minimální reziduální nemoci v podmínkách splnění standardních kritérií kompletní remise), predikce a rozpoznání časného relapsu/progrese MM a odhadu prognózy, tj. doby do progrese a celkového přežití MM (3, 6, 11, 29–33). Dnes již řada studií zaznamenala přínos Hevylite™ metody taktéž v diagnostice, stratifikaci, hodnocení průběhu, výsledků léčby a prognózy nemoci u monoklonální gamapatie nejistého významu (MGUS), systémové AL amyloidózy, primární Waldenströmovy makroglobulinémie a ne-hodgkinských lymfomů (zejména difuzního velkobuněčného B-lymfomu) (26, 34–38).

ZÁVĚR

Z předložené analýzy vyplývá, že Hevylite™ jako automatická a reproduktibilní vyšetřovací metoda je zejména v případě IgA třídy přesnější z hlediska detekce, typizace a stanovení výše MIg než standardní SEP. Vedle současné kvantifikace nádorového MIg a reziduálního normálního Ig umožňuje na rozdíl od SEP a IFE hodnocení hloubky imunní suprese (imunoparézy) rozšiřující standardní možnosti v klinickém vedení MM. Při hodnocení hladiny IgG imunoglobulinu v séru s pomocí Hevylite™ metody nutno počítat s úkazem, že ve srovnání s nefelometrickou technikou je součet hladin IgG-K + IgG-L u 90 % nemocných nižší. V případě IgA třídy Ig je naopak metoda Hevylite™ citlivější než nefelometrie, neboť zejména od koncentrace > 30 g/l je součet HLC IgA-K + IgA-L u 78 % nemocných vyšší než nefelometricky stanovená hodnota. Hodnoty MIg IgG-K i IgG-L změřené metodou Hevylite™ nejsou oproti SPE do koncentrace < 40 g/l systematicky rozdílné. Naopak v případě třídy IgA se vyznačují hodnoty MIg získané metodou Hevylite™ oproti SPE narůstající rozdílností, takže koncentrace HLC IgA-K a IgA-L je v 84 % a v 77 % vyšší, v případě HLC-IgA-L již od hodnoty > 30 g/l. Tím, že zejména ve třídě IgA a při nízké hodnotě MIg potlačuje metoda Hevylite™ limitace standardní SPE a poskytuje přesnější informaci o hladině MIg, umožňuje přesnější hodnocení rozsahu nádorové masy. Přes jistá omezení týkající se zejména vysokých hodnot MIg i Ig třídy IgG poskytuje Hevylite™ technika především u IgA typu MM oproti standardním analytickým technikám cenné přídatné a dynamické informace o změnách jednotlivých izotypů Ig, a tím i o stavu a vývoji MM. Dosažené výsledky naznačují, že Hevylite™ technika má ve vybraných situacích nadějný potenciál k obohacení dosavadního armamentária analytických metod, používaných běžně v klinické praxi (1–3, 6, 10, 12, 15).

Seznam použitých zkratek

β₂-M                  β₂-mikroglobulin

CRAB                 C – hyperkalcémie, R – renální porucha, A – anémie, B – postižení skeletu

                         u myelomu („myeloma bone disease“)

D-S                   stážovací systém dle Durieho-Salmona

ELISA                „enzyme-linked immunosorbent assay“

HLC                   pár těžkých/lehkých řetězců imunoglobulinu

HLC-r                poměr kappa/lambda páru těžkých/lehkých řetězců imunoglobulinu

IFE                    imunofixační elektroforéza

Ig                      imunoglobulin

IMWG                International Myeloma Working Group

ISS                    International Staging System

K                       kappa

K/L                    poměr lehkých řetězců kappa a lambda

KD                     kostní dřeň

KR                     kompletní remise

L                       lambda

l.ř.                     lehké řetězce imunoglobulinu

MG                    monoklonální gamapatie

MGUS                monoklonální gamapatie nejistého původu

MIg                   monoklonální imunoglobulin

MM                    mnohočetný myelom

NEF                   nefelometrie

NR                     normální rozmezí

NS                     nesignifikantní vztah

OS                     doba celkového přežití („overal survival“)

PFS                    doba do progrese myelomu nebo do úmrtí („progression free survival“)

SPE                   elektroforéza proteinů séra

VLŘ                   volné lehké řetězce imunoglobulinu

Podpora grantové studie IGA ČR NT 12451-5.

Konflikt zájmů: žádný.

ADRESA PRO KORESPONDENCI:

prof. MUDr. Vlastimil Ščudla, CSc.

3. IK-NRE FN
I. P. Pavlova 6,
775 20 Olomouc

e-mail: vlastimil.scudla@fnol.cz