Vyšetření bodových mutací v genu pro interleukin-11 v populaci neplodných žen a plodných kontrol

Súhrn

Cíl studie:
Interleukin-11 (IL-11) je jedním z klíčových cytokinů hrajících úlohu při decidualizaci a embryo-maternálním molekulárním dialogu, který probíhá během implantace embrya. Naším cílem bylo zjistit prevalenci variant v genu pro IL-11 v populaci neplodných žen a v populaci plodných kontrol.

Typ studie:
Kohortová studie.

Název a sídlo pracoviště:
Gynekologicko-porodnická klinika LF UK a FN v Plzni.

Metodika a soubor:
Vyšetřili jsme 354 infertilních a 195 kontrolních zdravých plodných žen. K analýze jsme použili elektroforézu probíhající v teplotním gradientu a přímou sekvenaci. Statistické zhodnocení rozdílu mezi skupinou neplodných pacientek a skupinou fertilních kontrol bylo provedeno pomocí Fisherova exaktního testu pro čtyřpolní tabulky.

Výsledky:
Ve skupině neplodných žen byla u 13 z nich zjištěna varianta G3651A, přičemž tato varianta má za následek záměnu argininu za histidin na pozici 113 (R113H). V kontrolní skupině tato bodová mutace zjištěna nebyla, což znamená, že frekvence této mutace v genu pro IL-11 je u neplodných žen signifikantně vyšší ve srovnání s plodnými ženami(p = 0,01 Fisherova exaktního testu pro čtyřpolní tabulky).

Závěr:
Výsledky prokazují přítomnost bodových mutací v genu pro IL-11 v populaci neplodných pacientek. Výskyt variant nemusí být sám o sobě mechanismem snižujícím plodnost, ale může přispívat k narušení cytokinové rovnováhy, která je k decidualizaci a následné implantaci embrya nutná. Ačkoli se mutace v genu pro IL-11 vyskytují vzácně, jejich vliv na molekulární pochody během implantace a časné embryogeneze by měl být objasněn.

Klíčová slova:
interleukin-11 – varianta – decidualizace – implantace embrya – neplodnost – asistovaná reprodukce – in vitro fertilizace – elektroforéza v teplotním gradientu – sekvenování DNA

ÚVOD

Jednou z příčin neplodnosti a také stále neuspokojivých výsledků její léčby [11] může být snížená schopnost embrya implantovat se do děložní sliznice. Implantaci embrya musí předcházet decidualizace děložní sliznice, která je kontrolována hierarchizovanou souhrou řady humorálních faktorů včetně mnoha cytokinů. Souvislost vyvážené a delikátně regulované cytokinové souhry se schopností spontánního otěhotnění byla opakovaně prokázána [7]. Interleukin-11 (IL-11) je pokládán za klíčový cytokin celé vyvážené cytokinové souhry regulující decidualizaci [5].

Interleukin-11 je členem rodiny interleukinu-6 spolu s leukemickým inhibičním faktorem (LIF), ciliárním neurotrofickým faktorem (CNTF), kardiotrofinem (CT-1) a onkostatinem-M (OSM) a společně s nimi sdílí afinitu k receptorovému řetězci gp130. Hotový protein je monomer složený ze 179 aminokyselin o molekulové váze 150 kDa. Sám se váže na vysokoafinní receptor IL-11Rα a po spojení s gp130 dochází k homodimerizaci IL-11 a přenosu signálu. IL-11 reguluje hematopoezu, indukuje proliferaci B buněk, stimuluje vývoj osteoblastů, buněk gastrointestinálního a nervového systému [6]. V roce 1997 byl schválen rekombinantní IL-11 (pod názvem Oprelvekin) jako lék pro prevenci závažné trombocytopenie u pacientů po chemoterapii.

Studie na myším modelu ukazují, že defekty v genu pro IL-11Rα nevedou k žádným abnormalitám v hemopoetickém procesu, ale samice s tímto defektem jsou sterilní [10]. Jako příčina neplodnosti u těchto myší byla potvrzena nedostatečná decidualizace endometria a jeho postupná degradace. U člověka byla pomocí imunohistochemického barvení prokázána produkce IL-11 v endometriu během celého menstruačního cyklu a v epiteliál-ních buňkách glandulárních byla pozorována silnější intenzita produkce IL-11 než u stromálních buněk endometria [4]. Bylo prokázáno, že produkce IL-11 epiteliálními buňkami endometria je silně snížená u žen s opakovanými potraty v anamnéze ve srovnání se zdravou skupinou [9] a také u žen s idiopatickou neplodností je přítomnost IL-11 v glandulárním epitelu signifikantně nižší [5].

Gen IL-11 se nachází na chromozomu 19 v oblasti q13.3–q13.4, je kódován pěti exony a čtyřmi introny. Dosud nebyla v literatuře popsána žádná mutace genu v souvislosti s neplodností. Je popsáno celkem 27 variant genu, z toho tři se nacházejí v exonech. Jako referenční sekvence byl v naší studii použit záznam genové banky číslo AY207429 z webových stránek http://www.ncbi.nlm.nih.gov odpovídající referenční sekvenci číslo NM_000641, ze které byly získány varianty genu [1]. V minulosti nalezené varianty genu IL-11 jsou uvedeny v seznamu známých variant na stránkách NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Tyto varian-ty byly zjištěny například firmou Seattle SNPs (CA, USA), která je částí National Heart Lung and Blood Institute‘s (NHLBI) a výzkum proběhl v rámci Programs for Genomic Applications (PGA). Jejich studie čítala 60 vzorků evropského původu, 60 vzorků afrického původu a 90 vzorků asijského původu.

Cílem naší práce bylo stanovit výskyt mutací v genu pro IL-11 v populaci neplodných žen a porovnat jej s kontrolní populací zdravých plodných žen.

METODIKA A SOUBOR ŽEN

Soubor žen

DNA jsme vyšetřili u 354 infertilních pacientek, z toho 252 bylo primárně a 102 sekundárně neplodných. Skupinu neplodných žen jsme rozdělili podle příčin sterility na ovariální faktor(n = 45), tubární faktor (n = 34), endometriózu(n = 30), andrologický faktor (n = 93), idiopatickou infertilitu (n = 99) a kombinaci faktorů (n = 44). Pacientky s endometriózou nebyly členěny podle stadia choroby. Pacientky klasifikované v naší studii jako idiopaticky neplodné měly ovulační cykly, laparoskopicky prokázanou průchodnost obou vejcovodů a absenci pelvických adhezí či endometriózy a měly též normální hysteroskopický či hysterosalpingografický nález. Jejich partneři měli normální spermiogramy a nebyly prokázány antispermatické protilátky.

Kontrolní populace pro vyšetřování DNA se skládala z 195 zdravých fertilních žen, které měly v anamnéze alespoň jedno spontánní otěhotnění následované porodem zdravého novorozence.

Studie byla schválena etickou komisí LF UK v Plzni a všechny pacientky podepsaly informovaný souhlas.

DNA extrakce

DNA byla izolována z leukocytů periferní krve za pomoci DNeasy Tissue Kit (QIAgen, Hilden, Germany) podle firemního protokolu. Vzorky byly skladovány při teplotě -20 °C.

Polymerázová řetězová reakce a vyšetřování mutací v genu pro IL-11

Pro analýzy DNA jsme používali gelovou elektroforézu probíhající v teplotním gradientu (TGGE) a přímé sekvenování. Analyzovány byly kódující oblasti a exon-intronové spoje genu. Za účelem vytvoření termostabilních domén byly primery modifikovány pomocí Poland java script přidáním GC svorek (www.biophys.uni-duesseldorf.de/POLAND/poland.html), ty vytvářejí u PCR produktu termostabilní domény, které umožňují analýzu variant pomocí TGGE. Polymerázová řetězová reakce (PCR) byla sestavena takto: 12.5 µl HotStart Taq PCR Master Mix (QIAgen), 10 pmol příslušných primerů, 100 ng DNA a destilovaná voda do celkového objemu 25 µl. Amplifikační program se skládal z denaturace při 95 °C po dobu 15 minut a pak 35 cyklů skládajících se z denaturace při 95 °C po dobu 30 sekund, annealingu při 60 °C po dobu 30 sekund a extenze při 72 °C po dobu 1 minuty. PCR byla zakončena finální extenzí při 72 °C po dobu 7 minut. Délka a kvalita PCR produktů byla kontrolována na standardním agarózovém gelu.

Vyhledávání mutací bylo prováděno analýzou heteroduplexů na TGGE (Biometra, Goettingen, Germany) za použití akrylamidových gelů (8% akrylamid (AA:bis-AA [37,5:1]), 6M urea, 1× MOPS, 2% glycerol)). Směs heteroduplexů byla provedena denaturací v termocykleru GeneAmp 9700 (PE/AB Foster City, CA, USA) při 95 °C po dobu 5 minut s následnou postupnou renaturací (1 °C za sekundu) na výslednou teplotu 55 °C, která byla udržována po dobu 15 minut. Poté byly vzorky zchlazeny na 4 °C.

TGGE analýzy se prováděly ve dvou krocích – nejprve byly podmínky elektroforézy optimalizovány pro každý PCR fragment zvlášť, pak byly vzorky pacientek analyzovány na paralelních gelech. DNA byla detekována metodou barvení stříbrem, kterou jsme popsali již v našich předešlých publikacích [2, 8].

Všechny vzorky pozitivní v TGGE jsme sekvenovali. Pro přípravu sekvenačních reakcí byl použit Big Dye Terminator Sequencing kit verze 1.1 či verze 3.1 (PE/AB, Foster City, CA, USA). Na jednu sekvenační reakci bylo použito přibližně 100 ng templátové DNA, 3,2 pmol sekvenačního primeru, 2 µl Big Dye Terminator Sequencing kit v1.1 (v3.1), 2 µl 5x Sequencing buffer, vše bylo doplněno sterilní deionizovanovou vodou do objemu 10 µl. Reakce probíhala v termocykleru GeneAmp 9700 (PE/AB Foster City, CA, USA) v následujících krocích: denaturace 96 °C/1 minuta, 25 cyklů (96 °C/15 sekund, teplota annealingu viz tabulka 2/5 sekund, 60 °C/4 minuty) a na sekvenátoru ABI Prism 310 (PE/Applied Biosystems, Foster City, USA) při 11.3 kV po dobu 20 minut. Pro přečištění PCR produktů po amplifikaci byl použit kit Agencourt AmPure a pro přečištění sekvenační reakce kit Agencourt CleanSeq (Agencourt Bioscience Corporation, Beverly, MA,USA) podle návodu výrobce.

Statistické hodnocení

Výsledky byly statisticky hodnoceny pomocí Fisherova exaktního testu pro čtyřpolní tabulky. Hodnoty p < 0,05 se považovaly za statisticky signifikantní.

VÝSLEDKY

V námi vyšetřované populaci byly detekovány dvě různé varianty – varianta G3451A, která nevede k záměně aminokyselin v proteinovém řetězci a varianta G3651A, která má za následek záměnu argininu za histidin na pozici 113 (R113H).

U varianty G3451A byla zjištěna vyšší frekvence (0,74), než je celková frekvence této varianty podle Seattle SNPs (0,3) [1]. To je zřejmě dáno tím, že všechny vzorky v námi vyšetřované skupině byly evropského původu, a nikoli smíšené jako u studie Seattle SNPs. Jejich frekvence pro evropskou populaci byla 0,58, kdežto například pro africkou 0,0 [1]. Tato varianta nezpůsobuje aminokyselinovou záměnu, lze ji považovat za „silent mutaci“ nebo polymorfismus. Navíc její výskyt se statisticky významně neliší ve skupině neplodných žen a plodných kontrol.

Druhá námi detekovaná varianta, varianta G3651A, byla v populaci, kterou jsme vyšetřovali, nalezena u 13 případů neplodných žen. Tato va-rianta má za následek záměnu argininu za histidin na pozici 113 (R113H), takže její vliv na například prostorové uspořádání molekuly je možný. V kontrolní skupině tato bodová mutace zjištěna nebyla, což znamená, že frekvence této mutace v genu pro IL-11 je u neplodných žen signifikantně vyšší ve srovnání s plodnými ženami (p = 0,01 Fisherova exaktního testu pro čtyřpolní tabulky).

DISKUSE

Naše pilotní výsledky prokazují, že frekvence varianty G3651A v genu pro IL-11 je u neplodných žen signifikantně vyšší ve srovnání s plodnými ženami. Protože tato varianta vede k záměně aminokyselin v proteinovém řetězci, existuje možnost, že by její výskyt mohl souviset např. se změnou prostorového uspořádání molekuly IL-11, a tím i se změnou její afinity k receptoru apod.

Jeden cytokin sám o sobě pravděpodobně nemůže významnou měrou ovlivnit proces decidualizace, ale existuje možnost, že abnormalita jednoho činitele naruší celkovou harmonii cytokinového prostředí, která je obecně uznávanou podmínkou úspěšnosti periimplantačních dějů [3]. K jednoznačným závěrům je však třeba mít populaci rozsáhlejší a studii doplnit analýzami následných dějů.

Ačkoli se varianty v genu pro IL-11 vyskytují vzácně [1], mohou mít vliv na molekulární pochody během decidualizace, a tím pádem i implantace a časné embryogeneze. Porozumění působení IL-11 může sloužit k pochopení molekulárních procesů peri-implantačních dějů, a tím i k vytvoření nových léčebných postupů, jež podpoří schopnost implantace a viabilitu embrya, a zvýší tím úspěšnost léčby neplodnosti.

ZÁVĚR

Ačkoli je zřejmé, že mutace v genu pro IL-11 nejsou časté a samy o sobě klinicky významné, představují dílek v poznání zatím nepochopených peri-implantačních dějů. Souvislost vyvážené a delikátně regulované cytokinové souhry s možností spontánního otěhotnění byla opakovaně prokázána. Pochopení imunogenetického pozadí implantace embrya má tedy potenciál přispět k objasnění příčin některých zatím nevysvětlitelných případů neplodnosti a otvírá nové možnosti léčby.

Tato studie je podporována projektem OP VaVpI PO 2 Biomedicínské centrum ED2.1.00/03.0076 a programem rozvoje vědních oblastí na Karlově Univerzitě (projekt P36).

Mgr. Pavla Lhotská

Ústav histologie a embryologie LF UK

Karlovarská 48

306 05 Plzeň

e-mail: lhotskap@pilsfree.cz