Histopatologická diagnóza hepatocelulárního karcinomu

Z pohledu každodenní praxe patologa nepředstavuje hepatocelulární karcinom (HCC) jenom izolovanou problematiku proliferujících uzlů s různým bio­logickým chováním v cirhóze. Podle histogeneze zahrnují primární maligní nádory jater u dospělých pouze tři skupiny onkologických diagnóz (HCC, cholangiocelulární karcinom a vaskulární tumory, zvl. epiteloidní hemangioendoteliom). Mohlo by se zdát, že diferenciální diagnostika mezi třemi kategoriemi bude velmi snadná, opak je ale pravdou, protože v játrech vstupují do onkologické diferenciální diagnózy metastázy tumorů z nejrůznějších primárních lokalit. Obecně vzato nejčastějším nádorem jater jsou metastázy. Je tedy zřejmé, že v játrech patolog v onkologické diagnostice zvažuje prakticky jakýkoli tumor, od metastáz z GIT a mammy, přes neuroendokrinní nádory, hematologické malignity, germi­nální i mezenchymové tumory, po melanom. K tomu je třeba přidat fakt, že HCC je morfologicky extrémně pleo­morfní a že je téměř pravidlem, že v jednom nádorovém ložisku je několik zcela odlišných histologických typů, včetně odlišné diferenciace, což může diagnostiku dále komplikovat. Stejnou heterogenitu vykazuje HCC na úrovni genomických, genetických a epi­genetických studií, proto dosud neexistuje subklasifikace na molekulární úrovni.

Přístup patologa k diagnóze nádoru v játrech se bude lišit podle toho, jaký typ vzorku vyšetřuje (resekát jater nebo jehlová biopsie) a také podle základní morfologie vyšetřovaného ložiska. V případě punkční/jehlové bio­psie je vždy velmi omezené množství tkáně a tomu se musí přizpůsobit výběr vyšetření s racionálním využitím limitovaného počtu řezů.

Podle histopatologických znaků řeší patolog diagnostiku:

• Nádor je hepatocelulární a jde o určení jeho biologické povahy (dysplastický nodulus v cirhóze vs časný HCC, adenom vs HCC).
• Nádor má hepatocelulární a tubulární/cholangiocelulární diferenciaci (jak klasifikovat takové nádory).
• Nádor netypické histologické va­rianty nebo s několika histologickými typy. Otázkou je, zda jde o HCC, cholangiocelulární karcinom nebo metastázu.

Technická komponenta diagnózy nádoru v jehlové biopsii

Klíčem k úspěšné diagnóze nádoru v jehlové biopsii je kromě odbornosti a zkušenosti patologa také technika zpracování bioptického vzorku s optimálním využitím limitovaného množství tkáně. Technicky je situace obdobná jiným lokalitám, s výjimkou neobvykle širokého spektra možností onkologických diagnóz, které lze v jaterní biopsii zachytit. V praxi se obvykle využívá jeden z následujících postupů:

• a) Nejprve se ukrojí řezy pouze na 1–2 skla a na základě morfologických znaků se rozhodne o výběru dalších imunohistochemických průkazů.
• b) Ukrojí se série řezů, které se v pásce uloží, z nich se vyberou okrajové řezy a řezy z centra a na základě morfologických znaků se pokračuje stejně jako v předchozím. Tato praxe se většinou používá v zahraničí, je totiž náročnější na prostor (skladování), na druhé straně šetří čas i materiál při dalším vyšetření, protože se krájí pouze jednou a pro imunohistochemické průkazy lze cíleně využít okolní řezy.

Nádor je hepatocelulární a jde o určení jeho biologické povahy (dysplastický nodulus v cirhóze vs časný HCC, adenom vs HCC)

Shrnutí problematiky dobře diferencovaného časného HCC v cirhóze je součástí doporučeného postupu. Současná klasifikace zpřesnila definice některých znaků, přidala imunohistochemické markery, a tím významně snížila počet problematických případů hodnocených v rutinním bioptickém provozu, a to i mezi pravidelně velmi obtížnou diagnostickou uzlů s high-grade dysplazií a dobře diferencovaným HCC [1].

Základní znaky, které zlepšují v praxi histopatologickou diagnózu HCC jsou:

1. stromální invaze
2. nepárové arterie
3. pozitivní průkaz glypicanu-3 (GPC3)

Stromální invaze charakterizuje časný HCC a představuje stav, kdy jednotlivé trámce nádorových hepatocytů pronikají do stromatu původních portálních polí nebo vazivových sept (obr. 1). Stromální invaze se posuzuje podobně jako v jiných oblastech onko­logické diagnostiky, kde se hodnotí prorůstání nádoru do pouzdra. Protože stromální invaze je dokladem invazivního růstu, stala se nejdůležitějším morfologickým znakem, který umožňuje rozlišení high-grade dysplastického uzlu od časného dobře diferencovaného HCC. Diagnostickou limitací je fakt, že okrsky stomální invaze se vyskytují fokálně a v jehlové biopsii nemusí být zastiženy.

Nepárové arterie jsou arterie, které jsou zastiženy v jaterní tkáni izolovaně mezi hepatocyty. Jsou tedy lokalizované mimo portální pole, kde normálně doprovází žlučovod a jsou vlastně histologickým korelátem neovaskularizace, která představuje hlavní diagnostický znak HCC v průběhu zobrazovacích metod (obr. 2). Nepárové arterie se na rozdíl od stromální invaze mohou vyskytovat i v benigních lézích (adenom) nebo v dysplastických nodulech.

Imunohistochemický průkaz glypicanu-3 znamená téměř revoluci v dia­gnostice HCC. GPC3 je onkofetální protein ovlivňující morfogenezi a kontrolující růst, který je vysoce exprimován v játrech a střevě během fetálního vývoje [2]. U dospělých v normálních játrech exprimován není. Jeho exprese se znovu objevuje v buňkách HCC a může být cytoplazmatická, membránová nebo kanalikulární (obr. 3). Prakticky ve všech případech je fokální a má různou intenzitu. Průkaz GPC3 má vysokou senzitivitu (77 %) a především specificitu (96 %), pozitivní výsledek s vysokou pravděpodobností predikuje maligní nádor z hepatocytů. Největší limitací průkazu GPC3 je jeho fokální exprese, která může vést k negativnímu výsledku, a také to, že průkaz je citlivý na fixaci [3]. Pouze zřídka byl zjištěn pozitivní průkaz GPC3 v jiných maligních tumorech, např. v melanomu, nádoru ze žloutkového váčku [4].

Další imunohistochemické markery

Další doporučované imunohistochemické znaky mají většinou významná omezení.

Alfa-fetoprotein je sérologickým markerem pro pokročilé HCC. Časné HCC nemají obvykle zvýšené hladiny v séru a v histologii průkaz alfa-fetoproteinu nepomůže, protože má velmi nízkou senzitivitu.

Pro pozitivní průkaz CD34 na endo­telu sinusoid se používá termín kapilarizace. Exprese CD34 se zvyšuje v místech, kde je převážně arteriální cévní zásobení, a proto je častěji pozitivní v HCC. Časné HCC, které ještě obsahují portální pole, jsou zásobeny vedle arteriálního novotvořeného oběhu také portálním oběhem, proto budou mít průkaz CD34 v různém rozsahu negativní. Na druhé straně adenomy a fokální nodulární hyperplazie (která pravděpodobně představuje reakci na vaskulární abnormalitu) budou mít fokálně pozitivní průkaz CD34. Pozitivní průkaz CD34 je třeba hodnotit v kontextu dalších morfologických znaků, sám o sobě neindikuje maligní proces.

Hep-Par1 je velmi užitečný, pokud potřebujeme rozlišit HCC od metastázy jiného karcinomu, ale nepomůže v odlišení benigního a maligního tumoru z hepatocytů (Hep-Par1 je mono­klonální protilátka, která reaguje s epitopem jaterních mitochondrií).

Glutamin syntetáza (GS) katalyzuje syntézu glutaminu, který je hlavním zdrojem energie pro nádorové buňky. V normálních játrech je GS exprimovaná v hepatocytech v okolí terminálních venul. V cirhotických játrech bývá pozitivních cca 10 % hepatocytů. Změna v rozsahu pozitivního průkazu GS (> 50 % nádorových buněk) je zaznamenána v případech tumorů jater s mutací βcateninu (GS je cílovým genem βcateninu); tj. cca v 10 % adenomů a 20–34 % HCC.

Heat shock protein 70 (HSP70) se účastní v procesech tumorigeneze ovlivněním regulace buněčného cyklu a apoptózy a představuje významný antiapoptotický faktor. Chronické infekce HCV a HBV, které vedou ke vzniku cirhózy a HCC, vedou také k syntéze HS70. Pozitivní imunohistochemický průkaz HS70 (obvykle jaderný i cytoplazmatický) je fokální a lze ho pozorovat u časných i plně vyvinutých HCC.

Jak již řečeno v úvodu, genetické/proteomické studie dosud neumožňují změny v diagnostice HCC. I když se v posledních dvou letech objevily práce, které ukazují, že podle výsledků molekulární diagnostiky bude pravděpodobně možné odlišit více či méně agresivní nádory, a tím také vybrat pacienty, kteří budou indikováni k resekci nebo transplantaci jater [5].

V podstatě lze shrnout, že typické HCC lze diagnostikovat na úrovni základního barvení HE. Komplikované případy vyžadují imunohisto­chemickou verifikaci, kdy diagnosticky nejpřínosnější je imunohistochemický průkaz glypicanu-3.

V případě diferenciálně diagnostické rozvahy mezi hepatocelulárním adenomem (HCA) a HCC do diagnostiky vstupuje ještě požadavek rozlišení adenomů s vysokým, nebo nízkým rizikem přechodu do HCC.

Hepatocelulární adenomy jsou relativně vzácné tumory, které se nejčastěji objevují u žen v souvislosti s antikoncepcí. Podle současných znalostí představují HCA nesourodou skupinu tumorů, které lze zařadit do jedné ze 4 skupin:

• H-HCA (hepatocelulární adenom definovaný aktivací HNF1 tj. Hepato­cyte Nuclear Factor1) představuje 35–40 % všech HCA a objevuje se téměř výlučně u žen. Raritně tyto tumory doprovázejí familiární DM (diabetes mellitus), kde mohou být mnohočetné (MODY3). V bio­psiích je obvykle steatóza, bez zánětu a bez cyto­logických atypií. To, že nádorové buňky neexprimují L-FABP, lze využít v diagnostice. L-FABP je protein, který ovlivňuje metabolizmus mastných kyselin a v normálních hepatocytech je ­L-FABP exprimován.
• I-HCA (HCA se zánětlivou celulizací) představuje 50 % HCA, nemocní jsou často obézní muži, kuřáci, s kladným vztahem k alkoholu. Jde o nejčastější variantu HCA vyskytující se u mužů. Zánět v histopato­logii doprovází overexprese reaktantů akutní fáze včetně SAA, který lze prokázat imuno­histochemicky a lze ho diagnosticky využít.
• β-HCA (HCA s aktivací βcateninu) představuje cca 10 % adenomů. Aktivace βcateninu se nejsnadněji dokazuje imunohistochemickým průkazem glutamin syntetázy (glutamin syntetáza katalyzuje syntézu glutaminu, který je hlavním zdrojem energie pro nádorové buňky. V β-HCA je difuzní pozitivita glutamin syntetázy). Existuje též možnost imunohistochemického průkazu βcateninu. Tyto tumory jsou častější u mužů, v histopatologii jsou cytologické abnormality, což s sebou nese rozpaky v hodnocení biologického chování. Současně β-HCA mají vysoké riziko maligního zvratu. V poslední době se objevují studie ukazující, že většina těchto tumorů představuje spíše dobře diferencované HCC než adenomy. V této oblasti je nezbytný další výzkum k objasnění toho, zda vůbec jde o dvě rozdílné onkologické kategorie [6].
• HCA bez bližšího určení, zde jsou zařazeny nádory, které nesplňují kritéria žádné z předchozích kategorií. Jde o malou skupinu cca 5 % HCA.

Kromě typu HCA je zvl. u mužů nutné brát v úvahu také velikost ložiska, protože riziko maligního zvratu stoupá s velikostí, a to bez ohledu na celkový počet ložisek v játrech. Kritickou velikost mají ložiska velikosti přesahující 4 cm [7].

Nádor má hepatocelulární a tubulární/cholangiocelulární diferenciaci (jak klasifikovat takové nádory)

Více než 90 % cholangiocelulárních karcinomů (CC) vzniká v hilu (tzv. Klatskinův tumor), zbývající postihují primárně nitrojaterní nebo extrahe­patální žlučovody. V histopatologii je klasický cholangiocelulární karcinom charakterizovaný tubulárními strukturami (pozitivními CK7 a CK19) a nápadnou fibroprodukcí (obr. 4). Tato typická morfologie je snadno odlišitelná od klasického HCC (pozitivní Hep­--Par1), který až na fibrolamelární variantu nemá vazivové stroma. CC mají nepříznivé biologické chování a jejich diagnóza představuje ve většině center kontraindikaci k transplantaci jater. Naproti tomu HCC, pokud nepřesahují definovaná kritéria, jsou naopak indikací k transplantaci. Proto rozlišení obou typů nádorů má závažné následky. V posledních letech jsou publikovány studie o zvyšující se incidenci intrahepatálních CC v cirhóze. Odlišení CC od běžně přítomné reaktivní duktulární proliferace v jizvení (tj. v často se vyskytujících plošných jizvách při změnách prokrvení v cirhóze) může být velmi obtížné, protože nejsou známé žádné proteiny, které by měly rozdílnou expresi v nenádorovém a maligním biliárním epitelu.

Rutinní používání imunohistochemických průkazů cytokeratinů exprimovaných v duktálním (zde biliárním) epitelu (CK19, CK7) odkrylo část HCC s okrsky drobných nezrale vypadajících nádorových buněk (progenitorové buňky) často s různým stupněm tubulárních struktur a s pozitivním průkazem CK7 a CK19. To postavilo histo­patologickou diagnostiku před problém, jak zařadit takové nádory. Otázek je mnoho, např. kde leží kritéria pro identifikaci biliární komponenty? Průkaz cytokeratinů (CK7, CK19) je pozitivní i v hepatocytech v cholestatických lézích. Proto nemůže být izolovaný průkaz CK7 anebo CK19 v okrscích nádorových buněk považován za průkaz biliárního/cholangio­celulárního karcinomu. Markery progenitorových buněk jsou též současně exprimovány v hepatocytech i v biliárním epitelu a v rozhodování nepomohou. K tomu je třeba přidat fakt, že neexistují definovaná kritéria, kdy by měl být nádor klasifikován jako smíšený HCC-CC. To vede k tomu, že každé centrum po­užívá vlastní kritéria. Většinová shoda je v tom, že typické HCC a CC lze odlišit na základě morfo­logických znaků. V praxi panuje shoda, že kombinované HCC-CC by měly být diagnostikovány pouze v případě, že nádor obsahuje plně vyvinutou komponentu CC, včetně fibroprodukce a tubulární architektury. Typické HCC s fokálně pozitivním průkazem CK7 a nebo CK19 jsou klasifikovány většinou jako HCC.

Nádor netypické histologické varianty nebo s několika histologickými typy. Otázkou je, zda jde o HCC, cholangiocelulární karcinom nebo metastázu

HCC je extrémně pleomorfní tumor, což spolu s tím, že do jater mohou metastazovat tumory v podstatě jakékoli histogeneze a z jakékoli primární lokality, přináší do diferenciální diagnostiky nepřeberné množství možností. Podle základní struktury lze ve většině případů odlišit mezenchymové, epitelové, event. hematologické malignity. Další diferenciálně diagnostická rozvaha směřující k výběru imunohistochemických, event. molekulárně genetických průkazů je závislá na histologické struktuře. Extrémně širokou diferenciální diagnostiku může značně ovlivnit anamnestická klinická informace o předchozích diagnózách maligních onemocnění. V textu i v tab. 1 shrnujeme pouze nejběžnější metastatické tumory jater a diferenciální diagnostiku epiteloidního hemangioendoteliomu.

Potřebuje-li patolog rozlišit HCC od metastázy jiného tumoru, je velmi užitečný imunohistochemický průkaz ­Hep-Par1. Průkaz ale nepomůže v odlišení benigního a maligního tumoru z hepatocytů. Navíc Hep-Par1 může být negativní v relativně běžných světlo­buněčných variantách HCC.

Dalším markerem pozitivním téměř výlučně v HCC je glypican-3 (viz dg. HCC).

Komplikovaná situace nastává, ­jsou-li zachyceny struktury tubulárního adeno­karcinomu vývodového typu, kdy je v diferenciální diagnóze cholangiokarcinom nebo metastázy, nejčastěji karcinomu pankreatu nebo kolorektálního karcinomu. Extrahepatální žlučovody a pankreatické vývody mají společný vývojový základ a dosud není znám žádný marker, který by umožnil jejich odlišení. Cholangiocelulární tumory mají nápadnou fibroprodukci a často jsou špatně diferencované. V případě nejčastějších metastáz kolorektálního tubulárního adenokarcinomu lze vedle morfologie použít k podpoře diagnózy detekci různých typů cytokeratinů (kolo­rektální karcinom: CK20+, CK7-).

Tubulární struktury může svým typem růstu napodobit epiteloidní hemangioendoteliom. Jde o cévní nádor, který roste pomalu a vytváří jeden nebo více různě velikých bledých tuhých uzlů. Imunohistochemicky jsou nádorové buňky pozitivní v průkazech CD31, CD34, faktor VIII. V histo­patologii se nádorové buňky šíří sinusy, hepato­cyty mezi sinusy atrofují a centrum ložiska se jizví. Nádor má zonální uspořádání s vazivem centrálně a dalším růstem na periferii. Růst nádoru ovlivňuje okolní hepatocyty, které mohou vytvářet reaktivní kanalikulární struktury, které budou imuno­histochemicky pozitivní v průkazech CK7 a CK19. To může vést k tomu, že tyto reaktivní struktury jsou hodnoceny jako nádor (cholangiocelulární tubulární adenokarcinom) a jednotlivé nádorové buňky v sinusech uniknou pozornosti (obr. 5, 6). Že jde o komplikovanou diagnózu, ukázalo několik zahraničních studií, kde pouze 25–40 % epiteloidních hemangioendoteliomů bylo diagnostikováno při prvním histopatologickém vyšetření [8,9].

Velmi často do jater metastazují neuro­endokrinní nádory (NET). V klinickém obraze jde většinou o náhodný nález vícečetných ložisek v játrech. Nalezení primárního tumoru není vždy jednoduché. Primární nádory mohou být v různých lokalitách v GIT a může jít o malá ložiska. Diagnózu NET podporuje pozitivní imunohistochemický průkaz chromograninu a synapto­fyzinu (obr. 7). Proliferační aktivita ani stupeň diferenciace nemusí odpovídat bio­logickému chování. V játrech lze diagnostikovat velmi dobře diferencované tumory s nízkou proliferační aktivitou, a přesto jde téměř vždy o metastázy.

Stejně komplikovaná může být dia­gnóza metastázy maligního melanomu, zvl. když patolog neví, že pacient měl melanom již diagnostikovaný, anebo když biopsie z jater je prvním záchytem již generalizovaného tumoru. Melanom ne vždy zachovává typické solidně alveolární uspořádání a ne vždy je v nádorových buňkách přítomná produkce pigmentu.

Z mezenchymových nádorů jsou nejčastěji v biopsiích jater zastiženy metastázy gastrointestinálních stromálních tumorů (GIST). I zde může jít o první dia­gnostický záchyt, protože primární ložisko může být asymptomatické. Dia­gnostický je průkaz CD117, který je pozitivní ve více než 95 % GIST.

Závěrem lze shrnout, že histopatologická diagnostika nádorů v játrech se řadí především díky širokému spektru nejrůznějších metastáz k velmi komplikovaným diagnózám. V možnostech rozlišení HCC a benigních afekcí z hepatocytů přineslo značné zlepšení použití imunohistochemického průkazu glypicanu-3. Intrahepatální cholangio­celulární karcinomy klasické morfologie nečiní diagnostický problém, ale skupina nádorů s fenotypem progenitorových buněk je naopak velmi problematická. Nejen pokud jde o jejich klasifikaci, ale především pokud jde o terapeutické rozhodnutí o případné transplantaci jater.

Autorka deklaruje, že v souvislosti s předmětem studie nemá žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Doručeno: 1. 3. 2012

Přijato: 15. 3. 2012

MUDr. Eva Honsová, Ph.D.

Pracoviště klinické a transplantační patologie

Transplantcentrum IKEM

Vídeňská 1958/9, 140 21 Praha 4

eva.honsova@ikem.cz